Summary
इस प्रोटोकॉल एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप की स्थापना और सी. के vivo इमेजिंग के लिए इसके कार्यान्वयन का वर्णन एलिगेंस भ्रूण.
Abstract
तेजी से और कम phototoxic इमेजिंग तकनीक पूर्ण में जीवों के विकास का अध्ययन करने के लिए पूर्व अपेक्षित हैं. Subcellular संकल्प के साथ 3 डी छवियों को प्रदान करते हुए हल्की चादर आधारित माइक्रोस्कोपी, तस्वीर विरंजन और confocal माइक्रोस्कोपी की तुलना में phototoxic प्रभाव कम कर देता है. यहाँ हम एक ईमानदार माइक्रोस्कोप और प्रकाश चादर की पीढ़ी के लिए ऑप्टो यांत्रिक तत्वों का एक छोटा सा सेट से बना है जो एक प्रकाश चादर आधारित माइक्रोस्कोप, की स्थापना उपस्थित थे. प्रोटोकॉल, निर्माण माइक्रोस्कोप संरेखित और प्रकाश चादर चिह्नित करने के लिए कैसे करें. इसके अलावा, यह सी. के पूर्ण इमेजिंग में के लिए विधि को लागू करने के लिए कैसे विवरण एलिगेंस एक सरल अवलोकन कक्ष का उपयोग भ्रूण. विधि विकास के कुछ घंटे से अधिक 3 डी दो रंगों समय चूक फिल्मों का कब्जा अनुमति देता है. इस समय की लंबी अवधि में सेल आकार, कोशिका विभाजन और टैग प्रोटीन की ट्रैकिंग को कम करना चाहिए.
Introduction
एक जीव के गठन और आकार देने सेल आंदोलनों, सेल आकार में परिवर्तन, कोशिका विभाजन और सेल भेदभाव शामिल है. इन प्रक्रियाओं की प्रगति और समन्वय को समझना तीन आयामों की क्षमता है और subcellular संकल्प के साथ तेज इमेजिंग उपकरणों की आवश्यकता होती है. इन vivo इमेजिंग क्षमताओं के साथ तकनीकों के बीच, प्रकाश चादर रोशनी माइक्रोस्कोपी भी एकल / चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी कहा जाता है कम phototoxic प्रभाव और 1,2 कम photobleaching उत्पादन का अनूठा लाभ दिया है.
चादर रोशनी माइक्रोस्कोपी में, नमूना ऑप्टिकल सेक्शनिंग करता है जो एक प्रकाश चादर, द्वारा की ओर से प्रकाशित है. रोशनी पथ और पहचान पथ दूसरे से सीधा कर रहे हैं और प्रकाश चादर का पता लगाने के उद्देश्य लेंस की वस्तु फोकल हवाई जहाज़ के साथ मेल खाना करने के लिए गठबंधन किया है. नमूना, दो रास्तों के चौराहे पर रख दिया गया है एकएन डी 3 डी इमेजिंग की अनुमति देने का पता लगाने के अक्ष के साथ ले जाया जा सकता है. केवल ब्याज की विमान प्रबुद्ध है और इस विमान के सभी बिंदुओं को एक ही समय में पता चला रहे हैं. यह काफी अधिग्रहण की गति बढ़ जाती है और confocal माइक्रोस्कोपी 3 की तुलना में photobleaching के साथ ही phototoxicity कम कर देता है.
दो आयामी इमेजिंग के लिए, कोई स्कैनिंग का पता लगाने के भाग के लिए, और न ही रोशनी भाग के लिए न तो आवश्यक है;: व्यावहारिक रूप से, चादर रोशनी माइक्रोस्कोपी सेटअप और संरेखित करने के लिए आसान है क्षमता सेक्शनिंग के साथ एक व्यापक क्षेत्र तकनीक के रूप में, तीन आयामी इमेजिंग नमूना पकड़े मंच की एक धुरी के आंदोलन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
यहाँ हम सी का पूर्ण इमेजिंग में के लिए एक साधारण प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप और इसके कार्यान्वयन की स्थापना पेश एलिगेंस भ्रूण. सी. एलिगेंस भ्रूण अच्छी तरह vivo में आईएमए रहने के लिए उपयुक्त हैंउनकी पारदर्शिता के कारण ging, अपरिवर्तनीय वंश और सेल टकसाली 4,5 पदों. विकसित प्रकाश चादर सेटअप का पता लगाने के लिए एक मानक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर आधारित है. नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल का निर्माण और संरेखित उत्तेजना मॉड्यूल / पथ, परीक्षण और प्रकाश चादर विशेषताएँ और 3 डी इमेजिंग के लिए नमूना माउंट करने के लिए विवरण कैसे. यह भी फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त विभिन्न प्रकारों पर स्थापना के साथ प्राप्त कर लिया समय चूक फिल्मों के उदाहरण प्रदान करता है.
Protocol
1. लाइट शीट और जांच पथ की स्थापना
चित्रा 1 ऑप्टिकल स्थापना के एक सामान्य योजना देता है.
- ऑप्टिकल तालिका पर माइक्रोस्कोप और लेज़रों प्लेस और तय कर लो.
- लेज़रों 488 एनएम, 561 एनएम और इसी dichroic दर्पण के साथ 405 एनएम का मिश्रण. Dichroic दर्पण के बाद, लेज़रों ठीक सह गठबंधन किया है. लेजर तरंग दैर्ध्य, dichroic दर्पण, और ऑप्टिकल फिल्टर का चुनाव प्रयोगों में इस्तेमाल विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबल के अवशोषण स्पेक्ट्रा से निर्धारित किया जाता है कि ध्यान दें.
- ध्वनिक ऑप्टिकल tunable फ़िल्टर (AOTF) रखें. AOTF की आवृत्ति और शक्ति को समायोजित करने के लिए आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान की कसौटी पर चादर का प्रयोग करें. अच्छी तरह से गठबंधन जब एक PowerMeter द्वारा मापा, लेजर शक्ति के बारे में 90% अधिकतम ट्यूनिंग पर फैलता है. AOTF अनावश्यक बना सकता है, जो कुछ लेज़रों पूरी तरह से सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है ध्यान दें.
- रखें और तयदूरबीन. दूरबीन बराबर या रोशनी उद्देश्य लेंस के पीछे एपर्चर के व्यास से भी बड़ा एक चौड़ाई के लिए बीम का विस्तार है कि दो लेंस से बना है कि ध्यान दें. छोटी से छोटी फोकल लंबाई के साथ लेंस पहले आना चाहिए.
- प्लेस, संरेखित और करीब बेलनाकार लेंस के पीछे एपर्चर को ऊपर की तरफ ऑप्टिकल पथ लाने पेरिस्कोप तय कर लो. पेरिस्कोप के दो दर्पण अपने लंबे अक्ष पूरी तरह से विस्तार बीम को प्रतिबिंबित करने के क्रम में दर्पण का झुकाव पर बिछाने है कि एक तरह से बढ़ रहे हैं ध्यान दें.
- अगले पेरिस्कोप बाहर निकलने के लिए बेलनाकार लेंस रखें. बेलनाकार लेंस एक दिशा में किरण केंद्रित है और यह इस तरह एक प्रकाश शीट बनाने, अन्य दिशा में collimated छोड़ देता है कि नोट.
- रोशनी उद्देश्य लेंस का उपयोग करके परिणामस्वरूप प्रकाश चादर refocus. रोशनी उद्देश्य की छवि केन्द्र बिन्दु का पता लगाने के उद्देश्य से वस्तु केन्द्र बिन्दु के साथ मेल खाना चाहिए ध्यान दें. किरण परियोजनाएक लंबी दूरी पर एक स्क्रीन (जैसे एक दीवार) पर. प्रकाश शीट की स्क्रीन तेज आकृति पर प्राप्त करने के लिए रोशनी किरण अक्ष के साथ रोशनी उद्देश्य ले जाएँ.
- माइक्रोस्कोप (घन) में सुरक्षित जगह में ट्रैक्टर रेखा (405/488/561/638) उत्सर्जन फिल्टर रखें.
- माइक्रोस्कोप उत्पादन बंदरगाह पर EMCCD कैमरा रखें.
- खुर्दबीन मंच में drilled छेद में शिकंजा द्वारा खुर्दबीन मंच पर पहली मैनुअल अनुवाद चरण ठीक करें. अनुवाद चरण के किनारे क्युवेट का पता लगाने के उद्देश्य लेंस नीचे केंद्रित है कि इतनी दूर खुर्दबीन मंच के केंद्र से लगभग 2 सेमी पर तैनात किया जाना है कि ध्यान दें.
- पहले एक पर दूसरा मैनुअल अनुवाद चरण ठीक करें. दो चरणों के निर्देशों (एक्स और वाई में अनुवाद) सीधा होना है.
- पिछले दो चरणों के शीर्ष पर जेड piezoelectric मंच को ठीक करें. एक मोटर चालित चरण बजाय piezoelectric मंच का इस्तेमाल किया जा सकता है ध्यान दें.
- क्युवेट holde फिक्सआर चरणों के शीर्ष पर (चित्र 2 देखें). क्युवेट इस प्रकार रोशनी मार्ग के चौराहे और एक दूसरे को सीधा कर रहे हैं, जो पता लगाने के पथ पर रखा जाएगा.
2. लाइट शीट जाँच हो रही है
- फ्लोरोसेंट समाधान के साथ एक गिलास क्युवेट भरें, और दो ऑप्टिकल पथ के चौराहे पर नमूना धारक पर जगह है. प्रकाश चादर इस तरह दिख रहा है. यह क्षैतिज हो गया है, और सुडौल / पता लगाने के उद्देश्य लेंस के संबंध में केन्द्रित.
- बेलनाकार लेंस निकालें और प्रकाश चादर की मोटाई मापने के लिए एक छवि के अधिग्रहण. प्रकाश शीट की मोटाई रोशनी उद्देश्य लेंस (एनए के बारे में 3-4 माइक्रोन = 0.3) के संख्यात्मक एपर्चर (एनए) पर निर्भर करता है कि ध्यान दें. एक दिया लेंस के लिए ध्यान दें कि, प्रकाश शीट की मोटाई एक भट्ठा के साथ वापस एपर्चर में प्रवेश बीम का आकार कम करके बढ़ाया जा सकता है. फ्लोरोसेंट microspheres कुल्हाड़ी मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि नोटमाइक्रोस्कोप के ial और पार्श्व संकल्प.
- प्रयोग शुरू करने से पहले बेलनाकार लेंस वापस रखो.
3. सी. के बढ़ते एलिगेंस भ्रूण
निम्नलिखित कदम चित्रा 3 में कल्पना कर रहे हैं.
- 10 x 20 x 1 मिमी की एक गिलास स्लाइड का एक टुकड़ा काट करने के लिए एक हीरे का अंकन कलम का उपयोग करें.
- 5% Bacto, अगर तैयार करें 60 डिग्री सेल्सियस पर पानी में, यह फोड़ा और एक हीटर ब्लॉक में इसे बनाए रखने के
- स्लाइड की कटौती टुकड़ा के एक तरफ पाली एल lysine के 50 μl जोड़ें, यह शुष्क करने की अनुमति देते हैं.
- बेंच पर एक खुर्दबीन स्लाइड प्लेस और यह तय कर लो.
- तय स्लाइड के साथ स्लाइड की कटौती टुकड़ा मुक़ाबला और शीर्ष पर पिघल अगर की एक बूंद जोड़ें. एक पतली अगर पैड प्राप्त करने के लिए एक और साफ खुर्दबीन स्लाइड का उपयोग अगर निचोड़.
- अगर पैड शीर्ष स्लाइड हटाने से पहले सूखे की अनुमति दें.
- लगभग 3 मिमी ओ की एक अतिरिक्त छोड़ने के लिए आदेश में तय स्लाइड के किनारे पर अगर पैड कटF अगर और धीरे तय स्लाइड को हटा दें.
- अगर पर पाली एल lysine के 50 μL जोड़ें और यह पूरी तरह से सूखी.
- एक घड़ी का शीशा में M9 मध्यम में गर्भवती कीड़े डाल दिया.
- भ्रूण जारी करने के लिए एक स्केलपेल के साथ योनी के स्तर पर कीड़े काटो.
- एक दूरबीन के तहत ब्याज की अवस्था में भ्रूण की पहचान और एक microcapillary पिपेट का उपयोग करके उन्हें इकट्ठा.
- स्लाइड की कटौती टुकड़ा से protrudes कि पाली एल lysine लेपित के साथ अगर की ओर से भ्रूण रखें. बस अगली स्लाइड की सीमा को भ्रूण रखें. वे काफी स्थिर नहीं होगा क्योंकि अगर की सीमा पर भ्रूण स्थिति मत. भ्रूण पाली एल lysine परत पर रहना होगा कि इतनी धीरे तरल निकालें.
- जल्दी सुखाना से बचने के लिए भ्रूण संरेखित.
- एक प्लास्टिक पेट्री डिश में कटौती स्लाइड प्लेस और धीरे स्लाइड कवर करने के लिए M9 मध्यम जोड़ें.
- अंडे अभी भी अगर पर अटक कर रहे हैं कि एक दूरबीन के तहत की जाँच करें.
सी. के 4. रिकॉर्डिंग एलिगेंस विकास
- नमूना धारक में पिछले तैयारी (कटौती स्लाइड, अगर प्लस भ्रूण) को ठीक करें और एक क्युवेट में जगह है. चित्रा 4 घर का बना धारक का वर्णन और चित्रा 5 अवलोकन संदर्भ में क्युवेट के एक दृश्य दिखाता है.
- Piezoelectric मंच पर क्युवेट को ठीक करें.
- उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के साथ भ्रूण की स्थिति को पहचानें.
- AOTF, कैमरा और piezoelectric चरण नियंत्रित घर में बने सॉफ्टवेयर शुरू करो. ऐसे Micromanager के रूप में एक मुफ्त सॉफ्टवेयर,, भी इस्तेमाल किया जा सकता है ध्यान दें.
- लेजर लाइन और बिजली (AOTF) का चयन करें.
- बेलनाकार लेंस और रोशनी लेंस समर्थन 3 दिशाओं मंच का उपयोग कर प्रकाश चादर की स्थिति को समायोजित करें. प्रतिभाशाली संकेत प्राप्त करने के लिए पार्श्व दिशा (एक्स) के साथ मंच हटो. वें प्राप्त करने के लिए तो प्रकाश चादर के Z स्थिति, और अनुदैर्ध्य स्थिति (y) को समायोजित करेंशोर अनुपात करने के लिए ई सबसे अच्छा संकेत. प्रकाश चादर ध्यान की स्थिति प्रकाश पथ लंबाई में मतभेद दूर करने के लिए एक भ्रूण से दूसरे को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है कि ध्यान दें.
- समय चूक छवियों को प्राप्त करने के लिए, दो छवियों, साथ ही प्राप्त किया जा करने के लिए छवियों की संख्या, और लेजर सत्ता के बीच समय लाभ, जोखिम समय का चयन करें. 2 रंग अधिग्रहण के लिए, एक दूसरे लेजर लाइन का चयन करें. दो रंग छवियों लगातार हासिल किया है.
- AZ ढेर प्राप्त करने के लिए, यह भी दो स्लाइस के बीच की दूरी, और शुरुआत और piezoelectric के पदों को समाप्त हुए चयन करें.
Representative Results
वहाँ तीन अलग अलग सी से थ्री 3D समय चूक रिकॉर्डिंग प्रयोगों एलिगेंस उपभेदों ऊपर वर्णित प्रकाश चादर खुर्दबीन सेटअप का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है कि डेटा के प्रकार के उदाहरण देकर स्पष्ट करना. हम इन परिस्थितियों में भ्रूण SPIM इमेजिंग सी में केवल कम phototoxicity स्तर का कारण बनता संकेत है कि पहले की रिपोर्टों के साथ संगत, सामान्य गति से विकास और इमेजिंग जीवित रहते हैं कि जाँच एलिगेंस 6,7 भ्रूण.
पहले तनाव GFP (; stIs10024 zuIs178) से जुड़े हुए एक histone व्यक्त करता है. रिकॉर्डिंग हर 37 सेकंड लिया 20 स्लाइस (स्लाइस 1 माइक्रोन के बीच की दूरी) के एक ढेर के साथ 2 घंटे के दौरान प्रदर्शन किया गया था. 6 अलग समय बिंदुओं पर ढेर के एक विमान को दिखाता है चित्रा. दोनों interphasic नाभिक (तीर) और गाढ़ा mitotic chromatin (तीर सिर) स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं.
दूसरे तनाव GFP (ruIs57) के लिए जुड़े हुए ट्यूबिलिन और एक histone व्यक्त करता हैmCherry (; stIs10226 itIs37) से जुड़े हुए. रिकॉर्डिंग हर 105 सेकंड लिया 20 स्लाइस (स्लाइस 1 माइक्रोन के बीच की दूरी) के एक ढेर के साथ 16 मिनट के दौरान प्रदर्शन किया गया था. 7 ढेर और अलग अलग समय बिंदुओं के विभिन्न विमानों को दिखाता है चित्रा. संबद्ध फिल्म 1 प्रदर्शित करता है 3 लगातार समय बिंदुओं पर पुनर्निर्माण 3D. विभाजन के दौरान, mitotic धुरा (हरा) और गाढ़ा गुणसूत्रों (लाल) स्पष्ट रूप से विकास के दौरान कोशिकाओं के विभाजन के झुकाव की ट्रैकिंग की अनुमति दिखाई दे रहे हैं.
तीसरे तनाव GFP (pwIs23) से जुड़े हुए अपोलीपोप्रोटीन वी आई टी -2 व्यक्त करता है और mCherry (ltIs44) बंधे एक झिल्ली. रिकॉर्डिंग हर 30 सेकंड लिया 10 स्लाइस (स्लाइस 1 माइक्रोन के बीच की दूरी) के एक ढेर के साथ 25 मिनट के दौरान प्रदर्शन किया गया था. 8 ढेर और अलग अलग समय बिंदुओं के विभिन्न विमानों को दिखाता है चित्रा. कोशिकाओं के भीतर जर्दी लिपोप्रोटीन कण (हरा) के तेजी से आंदोलनों आसानी से किया जा सकता हैपीछा किया.
चित्रा 1: रोशनी और पहचान इकाइयों, आगे और नीचे दृश्य की रचना SPIM ऑप्टिकल सेटअप. रोशनी इकाई में, dichroic दर्पण द्वारा संयुक्त लेज़रों स्वतंत्र रूप से एक लेजर की शक्ति को नियंत्रित करता है जो AOTF, दर्ज करें. फिर, दूरबीन 4 गुना से किरण का आकार बढ़ता है और पेरिस्कोप माइक्रोस्कोप की ऊंचाई के लिए लाता है. बेलनाकार लेंस रोशनी उद्देश्य से refocused है जो प्रकाश चादर, रूपों. पता लगाने इकाई ईमानदार माइक्रोस्कोप में एकीकृत है और मुख्य रूप से पता लगाने के लेंस, फिल्टर, ट्यूब लेंस और EMCCD द्वारा रचित है. नमूना रोशनी और पहचान रास्तों के बीच चौराहे पर तैनात है. एक piezoelectric चरण की अनुमति देता है नमूना के ऊर्ध्वाधर (जेड) displacements3 डी अधिग्रहण के लिए.
चित्रा 2:. क्युवेट धारक धारक 3 एल्यूमिनियम प्लेट के होते हैं और piezoelectric मंच पर दबाव डाला जाता है. कांच क्युवेट (लाल रंग में) एक वसंत द्वारा आयोजित किया जाता है.
चित्रा 3: सी. के बढ़ते प्रोटोकॉल SPIM प्रयोगों के लिए एलिगेंस भ्रूण. कांच की कटौती टुकड़ा पाली एल lysine के साथ लेपित है. अगर की एक पैड लेपित सतह पर तैनात है. पाली एल lysine तो अगर पैड पर जोड़ा जाता है. अंत में, सी. एलिगेंस भ्रूण पाली एल lysine लेपित अगर पैड पर गठबंधन कर रहे हैं.
चित्रा 4: नमूना धारक. धारक कांच क्युवेट के आंतरिक आयाम के लिए फिट बैठता है. (लाल रंग में) दो स्प्रिंग्स (चित्रा 3 में वर्णित) गिलास स्लाइड पकड़. यह धारक तो कांच क्युवेट के अंदर डाल दिया है.
चित्रा 5:... नमूना धारक अवलोकन संदर्भ में भ्रूण प्रोटोकॉल चित्रा 3 में अभिव्यक्त के अनुसार कांच स्लाइड पर स्थिर रहे स्लाइड चित्रा 4 में वर्णित नमूना धारक द्वारा आयोजित किया जाता है नमूना धारक कांच क्युवेट में डाला जाता है, चित्रा 2 में वर्णित धारक द्वारा आयोजित. प्रकाश चादर मैं क्षैतिज औरकी ओर से भ्रूण lluminates. पता लगाने के उद्देश्य लेंस नमूना ऊपर, खड़ी है.
चित्रा 6: एक सी. के रिकॉर्डिंग एक histone :: GFP संलयन व्यक्त एलिगेंस भ्रूण एक ट्रांसजेनिक भ्रूण की एकल विमान छवियों एक histone :: GFP संलयन (zuIs178; stIs10024) व्यक्त अलग समय बिंदुओं पर एक 3 डी समय चूक रिकॉर्डिंग से निकाले छवियाँ:.. 20 स्लाइस (के बने ढेर स्लाइस 1 माइक्रोन के बीच की दूरी); टुकड़ा प्रति जोखिम समय: 30 मिसे; ढेर के बीच समय अंतराल: 37 सेकंड; कुल अधिग्रहण समय: 2 घंटा. तीर: interphasic नाभिक, तीर सिर: सघन mitotic chromatin. टी = 0 मिनट पर भ्रूण 2 सेल चरण में है और सामान्य विकास के तहत आशा के रूप में टी = 120 मिनट भ्रूण लगभग 70 सेल शामिल(एक ही विमान में निहित केवल कोशिकाओं भ्रूण की सभी कोशिकाओं नहीं तस्वीर में दिखाई दे रहे हैं और ध्यान दें कि) peed. रोशनी की शक्ति (रोशनी उद्देश्य के बाहर निकलने पर मापा) 488 एनएम पर 30 μW था. इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 7: एक सी. के रिकॉर्डिंग एलिगेंस एक ट्यूबिलिन :: GFP संलयन व्यक्त भ्रूण और एक Histone :: mCherry संलयन. एक सी. के एक 3D समय चूक रिकॉर्डिंग से निकाले छवियाँ एक ट्यूबिलिन :: GFP संलयन (ruIs57) और एक Histone :: mCherry संलयन (; stIs10226 itIs37) व्यक्त एलिगेंस भ्रूण. रिकॉर्डिंग की स्थिति: स्लाइस 1 के बीच 20 स्लाइस (दूरी के एक ढेर के अधिग्रहणमाइक्रोन) हर 105 सेकंड; कुल अधिग्रहण समय: 16 मिनट; जोखिम समय: प्रत्येक चैनल के लिए 200 मिसे. पैनल एक ही ढेर के 10 स्लाइस से पता चलता है. पैनल बी एक ही टुकड़ा हर 210 सेकंड से पता चलता है. रोशनी की शक्ति (रोशनी उद्देश्य के बाहर निकलने पर मापा) क्रमश: 488 और 561 एनएम लेज़रों, के लिए 30 μW और 300 μW था. इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
8 चित्रा: एक सी. के रिकॉर्डिंग एक वी आई टी -2 :: GFP संलयन व्यक्त एलिगेंस भ्रूण और एक सी. के एक 3D समय चूक रिकॉर्डिंग से निकाले एक झिल्ली लक्षित mCherry. छवियाँ एलिगेंस भ्रूण एक वी आई टी -2 :: GFP संलयन व्यक्त (PWIS23) और एक झिल्ली लक्षित mCherry (ltIs44). रिकॉर्डिंग की स्थिति: 10 स्लाइस (स्लाइस 1 माइक्रोन के बीच की दूरी) हर 30 सेकंड के एक ढेर के अधिग्रहण; कुल अधिग्रहण समय: 25 मिनट; चैनल के अनुसार जोखिम समय: 200 मिसे. पैनल एक ही ढेर के 5 पहले स्लाइस से पता चलता है. पैनल बी एक ही टुकड़ा हर 30sec से पता चलता है. इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Discussion
इस प्रोटोकॉल सी. के vivo इमेजिंग के लिए प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी का एक आसान स्थापना का वर्णन एलिगेंस भ्रूण. लेज़रों, किरण विस्तारक, संधान और ध्यान केंद्रित लेंस सहित प्रकाश चादर, बनाने और संरेखित करने के लिए आवश्यक ऑप्टिकल तत्वों, आसानी से एक ऑप्टिकल बेंच पर रखा जा सकता है. पता लगाने के पथ और कैमरा के लिए एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ संयोजन में, इस स्थापना के लिए एक सरल समाधान के लिए एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप प्रदान करता है.
इस ज्यामिति नमूना पर्यावरण सरल बनाता है. रह नमूना, आयोजित तैनात है और यांत्रिक टुकड़े के एक छोटे से सेट द्वारा ले जाया जाता है जो एक गिलास क्युवेट, में रखा गया है. चादर रोशनी माइक्रोस्कोपी क्षमता सेक्शनिंग के साथ एक व्यापक क्षेत्र तकनीक है, केवल एक ही धुरी मोटर चालित आंदोलन 3 डी इमेजिंग के लिए आवश्यक है. यह एक स्कैनिंग तत्व को तुल्यकालन की आवश्यकता सीमा और सॉफ्टवेयर विकास की सुविधा. ISPIM 6 हमारे ईमानदार geomet की तुलनाRY का पता लगाने के लिए उच्च एनए उद्देश्य लेंस का प्रयोग अनुमति देता है. क्षैतिज विमान में उद्देश्य लेंस के साथ SPIM setups की तुलना में नमूना के बढ़ते और भ्रूण की एक श्रृंखला की इमेजिंग आसान कर रहे हैं. कुल मिलाकर, इस तकनीक के कार्यान्वयन सरल है और प्रकाशिकी में थोड़ा विशेषज्ञता के साथ प्राप्त किया जा सकता है. यह एक उच्च गति और कम phototoxicity लेकिन एक कम अक्षीय संकल्प की कमी के फायदे के साथ confocal सूक्ष्मदर्शी के लिए एक सस्ता विकल्प है.
हम भी सी. माउंट करने के लिए एक आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने तरीका विकसित इस प्रणाली का उपयोग vivo इमेजिंग के लिए एलिगेंस भ्रूण. बढ़ते प्रक्रिया तेज है (15 मिनट) और रोजमर्रा के प्रयोगों के लिए उपयुक्त है. सी के लिए एलिगेंस इमेजिंग, इस साधारण सेटअप के फायदे कम से कम दो गुना कर रहे हैं: पूर्ण इमेजिंग में (मैं) रोटेशन के बिना संभव है और इस प्रकार 3 डी पुनर्निर्माण सीधा है; (Ii) नमूना बढ़ते आसान है और कई भ्रूण क्रमिक रूप से imaged किया जा सकता हैएक ही स्लाइड पर. हम कोशिका विभाजन और सेल आकार में परिवर्तन का पालन करने के लिए पर्याप्त अस्थायी समाधान के साथ समय चूक फिल्मों के उदाहरण से पता चला है. सी. अध्ययन करने के लिए प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी की शक्ति एलिगेंस विकास भी हाल ही में दूसरों 6, 7, 8 से यह साफ कर दिया गया है. इसलिए, इस तकनीक सी. के morphogenesis और patterning अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी हो जाएगा एलिगेंस भ्रूण.
इस प्रणाली को भी अन्य मॉडल जीवों के विकास का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है? यह समझना महत्वपूर्ण है कि ऐसे सी के रूप में छोटे और पारदर्शी जीव के लिए चादर रोशनी माइक्रोस्कोपी का कार्यान्वयन एलिगेंस ऐसे ड्रोसोफिला भ्रूण के रूप में बड़े जीवों के लिए की तुलना में कम कठोर है. ड्रोसोफिला का पूर्ण इमेजिंग में सामान्य रूप से रोटेशन और बहु दृश्य पुनर्निर्माण 9, 10. समरेख उत्तेजना उद्देश्य लेंस के साथ दोनों पक्षों से उत्तेजना भी attenuat की वजह से छाया प्रभाव को कम कर सकते हैं की आवश्यकता हैप्रकाश 11 के आयन. फिर भी, यहां प्रस्तुत सेटअप अभी भी कम विरंजन और कम photoxicity साथ, ड्रोसोफिला भ्रूण की छवि एक पक्ष के लिए अनुकूल है. इस सेटअप भी ऐसे ascidians या zebrafish के रूप में छवि छोटे और पारदर्शी भ्रूण के लिए उपयोगी हो सकता है.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम चर्चा के लिए सॉफ्टवेयर विकास और जेरेमी Capoulade के लिए विशेष ओलिवर ब्लैंक में, सभी Lenne के सदस्यों और बर्ट्रेंड लैब्स धन्यवाद. हम भी तकनीकी सहायता के लिए PICsL-IBDM इमेजिंग सुविधा, विशेष रूप से क्लाउड Moretti और ब्राइस Detailleur धन्यवाद.
यह काम (पी.-सीए और वीबी लिए) CNRS से ATIP अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, LABEX (वीबी लिए) Sanofi-एवेंटिस से और एक अनुदान (पी.-सीए और वीबी लिए) अनुदान को सूचित करें. हम (ANR-10-InSb-04-01 "INVESTISSEMENTS डी 'Avenir' कहते हैं) एजेंस Nationale डे ला Recherche द्वारा समर्थित फ्रांस-BioImaging बुनियादी ढांचे को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SPIM | |||
| Detection | |||
| upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
| 100x W objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
| EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
| Illumination | |||
| LASER 488 nm / 60 mW | TOPTICA | iBeam smart | |
| LASER 405 nm / 120 mW | TOPTICA | iBeam smart | |
| LASER 561 nm / 500 mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
| filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
| Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
| Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
| AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
| mirror | |||
| lens 50 mm | THORLABS | telescope 5X | |
| lens 200 mm | THORLABS | telescope 5X | |
| periscope | THORLABS | RS99/M | |
| cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
| 10X NA 0,3 | NIKON | ||
| xyz stage | NEWPORT | ||
| Sample | |||
| Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
| Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
| Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
| M9 medium: | |||
| KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
| Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
| NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
| MgSO4 (1 mM final) | Any supplier | ||
| cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
| sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
| x stage | NEWPORT | ||
| coverslip 50x20x1 mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
| piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
| cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
| Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
| Software | |||
| C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview | ||
References
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