Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines Lichtschnittmikroskop und dessen Umsetzung zur in vivo Bildgebung von C. elegans Embryonen.
Schnelle und phototoxische bildgebenden Verfahren sind Voraussetzung, um die Entwicklung von Organismen in toto zu studieren. Lichtbogen basiert Mikroskopie reduziert Fotobleichen und phototoxische Effekte im Vergleich zu der konfokalen Mikroskopie und bietet 3D-Bilder mit subzellulärer Auflösung. Hier stellen wir den Aufbau einer Lichtschnittmikroskop basiert, die von einem aufrechten Mikroskop und einen kleinen Satz von opto-mechanischen Elementen für die Erzeugung des Lichtblattes zusammengesetzt ist. Das Protokoll beschreibt, wie zu bauen, richten Sie das Mikroskop und prägen das Lichtblatt. Außerdem enthält es, wie die Methode in toto Abbildung C zu implementieren elegans Embryonen mit Hilfe eines einfachen Beobachtungskammer. Das Verfahren ermöglicht die Erfassung von 3D-Zwei-Farben Zeitraffer-Filme über einige Stunden der Entwicklung. Dies sollte die Verfolgung der Zellform, Zellbereiche und markierte Proteine über lange Zeiträume zu erleichtern.
Die Ausbildung und Formgebung des Organismus beinhaltet Zellbewegungen, Änderungen der Zellform, der Zellteilung und Zelldifferenzierung. Das Verständnis der Progression und Koordination dieser Prozesse erfordern schnelle Imaging-Tools mit drei Dimensionen Fähigkeit und subzellulärer Auflösung. Zu den Techniken, mit diesen in-vivo-Imaging-Funktionen, Lichtblatt-Beleuchtung Mikroskopie auch als Einzel / selektiven Plane Illumination Mikroskopie hat den einzigartigen Vorteil der Herstellung von Low-phototoxische Effekte und Low-Photobleaching 1,2.
In Blatt Beleuchtung Mikroskopie wird die Probe von der Seite durch einen Lichtbogen, der die optische Schnitte führt beleuchtet. Der Beleuchtungspfad und der Detektionspfad sind senkrecht zueinander und der Lichtbogen wird ausgerichtet, um mit der Objektbrennebene der Objektivlinse Detektion zusammenfallen. Die Probe wird an dem Schnittpunkt der beiden Pfade angeordnet ist, einnd entlang der Erfassungsachse bewegt werden, um 3D-Bildgebung zu ermöglichen. Nur die interessierende Ebene beleuchtet wird und alle Punkte dieser Fläche werden gleichzeitig erfasst. Dies erhöht die Aufnahmegeschwindigkeit und verringert Photobleichen sowie Phototoxizität im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie 3.
Praktisch ist Blatt Beleuchtung Mikroskopie einfach zu installieren und align: für zweidimensionale Bildgebung notwendig weder für den Erfassungsteil, noch für die Beleuchtungsteil ist kein Scannen; als Weitfeldtechnik mit Auftrennung kann die dreidimensionale Bildgebung durch eine einzige Achse der Bewegung des Bühnen Halten der Probe erhalten werden.
Hier präsentieren wir die Einrichtung eines einfachen Lichtmikroskop Blatt und seine Umsetzung in toto Bildgebung von C. elegans Embryonen. C elegans Embryonen sind gut geeignet, um in vivo ima lebenGing aufgrund ihrer Transparenz, invariant Abstammung und stereotype Zelle positioniert 4,5. Das entwickelte Lichtblatt-Setup basiert auf einem Standard aufrechten Mikroskop zur Erkennung basiert. Die nachstehende Protokoll beschreibt, wie zu bauen und richten Sie die Anregung Modul / Pfad, zu testen und zu charakterisieren den Lichtbogen und montieren Sie die Probe für die 3D-Bildgebung. Es bietet auch Beispiele für mit dem Setup auf verschiedenen Stämmen, fluoreszierende Marker erworben Zeitraffer-Filme.
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Einstellung der Lichtbogen-Mikroskopie in vivo-Bildgebung von C. elegans Embryonen. Die optischen Elemente, die zum Erstellen und richten Sie den Lichtbogen, darunter Laser, Strahlaufweitung, Bündelung und Fokussierung Linsen, kann leicht auf einer optischen Bank montiert werden. In Kombination mit einem aufrechten Mikroskop für die Detektionspfad und der Kamera bietet dies eine einfache Lösung für das Einrichten eines Lichtschnittmikroskop.
Diese Geometrie macht die Probenumgebung einfach. Die lebende Probe wird in eine Glasküvette, die gehalten wird, angeordnet und durch eine begrenzte Anzahl von mechanischen Teilen verschoben angeordnet ist. Als Blattbeleuchtung Mikroskopie ist ein weites Feld Technik mit Auftrennung wird nur ein einziges motorisierte Achsen-Bewegung für die 3D-Bildgebung erforderlich. Dies begrenzt das Erfordernis der Synchronisation auf einen einzigen Scanelement und erleichtert die Software-Entwicklung. Im Vergleich zu unseren ISPIM 6 aufrecht geory ermöglicht die Verwendung von hohen NA Objektiv für die Erkennung. Im Vergleich zu SPIM Aufbauten mit Objektivlinsen in der horizontalen Ebene die Befestigung der Probe und der Abbildungs einer Reihe von Embryonen zu erleichtern. Insgesamt ist die Implementierung dieser Technik einfach und kann mit wenig Erfahrung in der Optik erreicht werden. Dies ist eine günstige Alternative zum konfokalen Mikroskopen mit den Vorteilen einer höheren Geschwindigkeit und geringere Phototoxizität, aber Nachteil einer geringeren axialen Auflösung.
Wir haben auch eine einfache und reproduzierbare Weise, C. Halterung entwickelt elegans Embryonen für die in vivo-Bildgebung unter Verwendung dieses Systems. Der Montagevorgang ist schnell (15 min) und ist geeignet für den täglichen Experimenten. Für C. elegans-Bildgebung, die Vorteile dieser einfachen Aufbau sind mindestens zwei Falten (i) in toto Abbildungs möglich ist, ohne Drehung und damit die 3D-Rekonstruktion ist einfach; (Ii) Probe Montage ist einfach und mehrere Embryonen nacheinander abgebildet werdenauf derselben Folie. Wir zeigten Beispiele von Zeitraffer-Filmen mit ausreichender zeitlicher Auflösung zu Zellteilungen und Zellformänderungen zu beobachten. Die Macht der Lichtbogen-Mikroskopie zu untersuchen C. elegans Entwicklung wurde auch kürzlich von anderen 6, 7, 8 dargestellt. Daher wird diese Technik sehr nützlich, um die Morphogenese und Strukturieren der Studie C. elegans Embryo.
Kann dieses System auch verwendet werden, um die Entwicklung von anderen Modellorganismen analysieren? Es ist wichtig zu erkennen, dass die Umsetzung der Blattbeleuchtung Mikroskopie für kleine und transparent Organismus wie C. elegans ist weniger streng als für größere Organismen wie Drosophila-Embryonen. In toto Bildgebung von Drosophila erfordert in der Regel Rotation und Multi-View-Rekonstruktionen 9, 10. Anregung von zwei Seiten mit kollineare Anregung Objektive können auch reduzierte die Schatteneffekte durch die Dämpfungs verursachtIon des Lichts 11. Dennoch ist das Setup hier vorge noch Bild einer Seite der Drosophila-Embryonen angepasst, mit geringem Bleichen und niedrigen photoxicity. Diese Einrichtung könnte auch hilfreich, wenn Bilder klein und transparent Embryonen wie Seescheiden oder Zebrafisch sein.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken allen Mitgliedern der Lenne und Bertrand Labors, insbesondere Olivier Blanc für Software-Entwicklung und Jérémie Capoulade zur Diskussion. Wir danken auch dem PICsL-IBDM Bild Anlage, insbesondere Claude Moretti und Brice Detailleur für technische Unterstützung.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus ATIP CNRS (P.-FL und VB) unterstützt, die Labex INFORM Zuschuss (P.-FL und VB) und einen Zuschuss von Sanofi-Aventis (VB). Wir erkennen France-BioImaging Infrastruktur von der Agence Nationale de la Recherche unterstützt (ANR-10-InSb-04-01, als "Investissements d'Avenir").
SPIM | |||
Detection | |||
upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
Illumination | |||
LASER 488nm / 60mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 405nm / 120mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 561nm / 500mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
mirror | |||
lens 50mm | THORLABS | telescope 5X | |
lens 200mm | THORLABS | telescope 5X | |
periscope | THORLABS | RS99/M | |
cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
10X NA 0,3 | NIKON | ||
xyz stage | NEWPORT | ||
Sample | |||
Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
M9 medium: | |||
KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
MgSO4 (1mM final) | Any supplier | ||
cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
x stage | NEWPORT | ||
coverslip 50x20x1mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
Software | |||
C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview |