Dit protocol beschrijft de installatie van een lichte plaat microscoop en de uitvoering ervan in vivo beeldvorming van C. elegans embryo's.
Snelle en lage fototoxiciteit beeldvormende technieken voorwaarde voor de ontwikkeling van organismen in toto bestuderen. Licht vel gebaseerd microscopie vermindert fotoblekingsreactie en fototoxische effecten in vergelijking met confocale microscopie, terwijl het verstrekken van 3D-beelden met subcellulaire resolutie. Hier presenteren we de opstart van een lichtwaaier gebaseerd microscoop, die bestaat uit een rechtopstaande microscoop en een kleine set van opto-mechanische elementen voor het genereren van de lichtwaaier. Het protocol beschrijft hoe te bouwen, lijnt de microscoop en karakteriseren het licht vel. Bovendien beschrijft hoe de methode te implementeren in toto beeldvorming van C. elegans embryo's met behulp van een eenvoudige observatie kamer. De methode maakt het vastleggen van 3D-twee-kleuren time-lapse filmpjes meer dan enkele uren van ontwikkeling. Dit zou het volgen van celvorm, celdelingen en gemerkte eiwitten gedurende lange tijd te verlichten.
De vorming en de vorming van een organisme omvat cel bewegingen, veranderingen cel vorm, celdeling en celdifferentiatie. Inzicht in de progressie en de coördinatie van deze processen vereisen een snelle imaging-tools met drie-dimensies vermogen en subcellulaire resolutie. Onder de technieken met deze in vivo imaging-mogelijkheden, licht blad verlichting microscopie ook wel single / selectieve vliegtuig verlichting microscopie heeft het unieke voordeel van het produceren van low-fototoxische effecten en lage-fotobleking 1,2.
In sheet verlichting microscopie wordt het monster verlicht van opzij door een lichtbron blad dat de optische sectie uitvoert. De verlichting pad en de detectie pad loodrecht op elkaar en de lichtwaaier is uitgelijnd om samen te vallen met het doel brandvlak van de detectie objectieflens. Het monster wordt geplaatst op het snijpunt van de twee paden, eennd kan langs de detectie as worden verplaatst naar 3D-beelden mogelijk te maken. Slechts het vlak van belang wordt verlicht en alle punten van dit vlak worden gedetecteerd op hetzelfde moment. Dit verhoogt de opnamesnelheid en vermindert fotobleken en fototoxiciteit in vergelijking met confocale microscopie 3.
Praktisch, blad verlichting microscopie is eenvoudig te installeren en align: voor twee dimensionale beeldvorming, geen scannen is noodzakelijk noch voor de detectie deel, noch voor de verlichting deel; als een wide-field techniek met het snijden vermogen, kunnen driedimensionale beelden worden verkregen door een enkele as beweging van het podium met het monster.
Hier presenteren we het opzetten van een eenvoudige lichte plaat microscoop en de uitvoering ervan in toto beeldvorming van C. elegans embryo's. C. elegans embryo's zijn zeer geschikt om te leven in vivo imaGing door hun transparantie, invariante afstamming en stereotiepe cel positioneert 4,5. De ontwikkelde lichtwaaier installatie is gebaseerd op een standaard microscoop rechtop voor detectie. De hieronder gepresenteerde protocol beschrijft hoe te bouwen en af te stemmen de excitatie module / pad, testen en karakteriseren van de lichte plaat en monteer het monster voor 3D-beeldvorming. Het geeft ook voorbeelden van time-lapse filmpjes verworven met de opstelling die op verschillende stammen die fluorescente markers.
Dit protocol beschrijft een eenvoudige setup van licht blad microscopie voor in vivo beeldvorming van C. elegans embryo's. De optische elementen noodzakelijk maken en lijn het licht daarin opgenomen lasers, straalexpander collimatie en focusseerlenzen kan gemakkelijk worden gemonteerd op een optische bank. In combinatie met een rechtopstaande microscoop voor de detectie pad en de camera, biedt dit een eenvoudige oplossing voor het inrichten van een lichtwaaier microscoop.
Deze geometrie maakt het monster omgeving eenvoudig. De levende monster wordt geplaatst in een glazen cuvet, die wordt gehouden, gepositioneerd en bewogen door een kleine set van mechanische onderdelen. Zoals sheet verlichting microscopie is een breed veld techniek met het snijden vermogen, wordt slechts een enkele as gemotoriseerd verkeer nodig voor 3D-beeldvorming. Dit beperkt de vereiste synchronisatie een enkel aftastorgaan en faciliteert softwareontwikkeling. Vergeleken met ISPIM 6 onze rechtop geometry maakt het gebruik van hoge NA objectieflens voor detectie. Vergeleken met SPIM opstellingen met objectieven in het horizontale vlak de montage van het monster en de beeldvorming van een reeks embryo gemakkelijker. Totaal de uitvoering van deze techniek is eenvoudig en kan worden bereikt met weinig ervaring in de optica. Dit is een goedkoper alternatief voor confocale microscopen met de voordelen van een hogere snelheid en verminderde fototoxiciteit maar nadeel van een lagere axiale resolutie.
We ontwikkelden ook een gemakkelijke en reproduceerbare manier te monteren C. elegans embryo in vivo beeldvorming met behulp van dit systeem. De montageprocedure is snel (15 minuten) en is geschikt voor dagelijks experimenten. Voor C. elegans beeldvorming, de voordelen van deze eenvoudige opstelling ten minste twee vouwen: (i) in zijn geheel beeldvorming mogelijk zonder rotatie en dus 3D reconstructie is eenvoudig; (Ii) sample montage is eenvoudig en meerdere embryo's kunnen opeenvolgend worden afgebeeldop dezelfde dia. We toonden voorbeelden van time-lapse filmpjes met voldoende temporele resolutie te celdelingen en veranderingen cel vorm waarnemen. De kracht van het licht vel microscopie aan C. studeren elegans ontwikkeling is onlangs ook geïllustreerd door anderen 6, 7, 8. Daarom zal deze techniek zeer nuttig zijn voor de morfogenese en patroonvorming van de C. bestuderen elegans embryo.
Dit systeem kan ook worden gebruikt om de ontwikkeling van andere modelorganismen analyseren? Het is belangrijk te erkennen dat de toepassing van plaatstaal verlichting microscopie voor kleine en transparante organismen zoals C. elegans is minder streng dan voor grotere organismen zoals Drosophila embryo's. In toto beeldvorming van Drosophila vereist normaal rotatie en multi-view reconstructies 9, 10. excitatie van twee kanten met collineair excitatie objectief lenzen mogen ook verlaagde de schaduw effecten veroorzaakt door de attenuation van het licht 11. Toch wordt de setup hier gepresenteerde steeds aangepast aan het ene kant van de Drosophila embryo's, met lage bleken en lage photoxicity. Deze opstelling kan ook nuttig zijn om de afbeelding kleine en transparante embryo's zoals zakpijpen of zebravis zijn.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken alle leden van de Lenne en Bertrand laboratoria, met name Olivier Blanc voor software ontwikkeling en Jeremie Capoulade voor discussie. We danken ook de PICsL-IBDM imaging faciliteit, in het bijzonder Claude Moretti en Brice Detailleur voor technische ondersteuning.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van ATIP CNRS (naar P.-FL en VB), de Labex INFORM subsidie (naar P.-FL en VB) en een subsidie van Sanofi-Aventis (VB). Wij erkennen France-BioImaging infrastructuur ondersteund door de Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-InSb-04-01, roepen "Investissements d'Avenir").
SPIM | |||
Detection | |||
upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
Illumination | |||
LASER 488nm / 60mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 405nm / 120mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 561nm / 500mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
mirror | |||
lens 50mm | THORLABS | telescope 5X | |
lens 200mm | THORLABS | telescope 5X | |
periscope | THORLABS | RS99/M | |
cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
10X NA 0,3 | NIKON | ||
xyz stage | NEWPORT | ||
Sample | |||
Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
M9 medium: | |||
KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
MgSO4 (1mM final) | Any supplier | ||
cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
x stage | NEWPORT | ||
coverslip 50x20x1mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
Software | |||
C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview |