Summary
Questo protocollo descrive la configurazione di un microscopio foglio leggero e la sua applicazione per l'imaging in vivo di C. elegans embrioni.
Abstract
Tecniche di imaging fototossiche veloci e bassi sono pre-requisito per studiare lo sviluppo di organismi in toto. La microscopia foglio leggero basato riduce fotometabolismo ed effetti fototossiche rispetto alla microscopia confocale, fornendo immagini 3D con una risoluzione sub-cellulare. Presentiamo qui la configurazione di un foglio basato microscopio ottico, che è composto da un microscopio verticale e un piccolo insieme di elementi opto-meccanici per la generazione del foglio leggero. Il protocollo descrive come costruire, allineare il microscopio e caratterizzano il foglio leggero. Inoltre, si descrive come implementare il metodo per l'imaging in toto di C. elegans embrioni utilizzando una semplice camera di osservazione. Il metodo consente la cattura di 3D bicolore film time-lapse over poche ore di sviluppo. Questo dovrebbe facilitare il monitoraggio delle forma della cellula, divisioni cellulari e proteine marcate per lunghi periodi di tempo.
Introduction
La formazione e la sagomatura di un organismo comporta movimenti delle cellule, forma cambia cellulare, divisione cellulare e la differenziazione cellulare. Comprendere la progressione e il coordinamento di questi processi richiedono strumenti veloci di imaging con possibilità di tre dimensioni e la risoluzione subcellulare. Tra le tecniche con le capacità di imaging in vivo in luce foglio di illuminazione microscopio chiamato anche single / selettiva microscopia illuminazione aereo ha il vantaggio unico di produrre effetti a bassa fototossico e basso photobleaching 1,2.
Nel foglio di illuminazione microscopia, il campione è illuminato dal lato da un foglio leggero, che esegue il sezionamento ottico. Il percorso di illuminazione e il percorso di rilevamento sono perpendicolari tra loro e il foglio leggero è allineato a coincidere con il piano focale oggetto della lente obiettivo rilevamento. Il campione è posto all'intersezione dei due percorsi, unND può essere spostato lungo l'asse di rilevamento per consentire l'imaging 3D. Solo il piano di interesse è illuminato e tutti i punti di questo piano vengono rilevati allo stesso tempo. Ciò aumenta notevolmente la velocità di acquisizione e riduce fotoscolorimento nonché fototossicità rispetto alla microscopia confocale 3.
In pratica, la microscopia illuminazione foglio è facile da installare e align: per due l'imaging tridimensionale, non scansione è necessaria né per la parte di rilevamento, né per la parte illuminazione; come tecnica a grande campo con sezionamento, imaging tridimensionale può essere ottenuta con un singolo movimento asse della scena tenendo il campione.
Qui vi presentiamo la creazione di un microscopio semplice foglio leggero e la sua attuazione in toto per l'imaging di C. elegans embrioni. C. elegans embrioni sono adatti a vivere in vivo imaging a causa della loro trasparenza, lignaggio invariante e stereotipato cellulare posiziona a 4,5. Il setup foglio leggero sviluppato è basato su microscopio verticale standard per il rilevamento. Il protocollo presentato di seguito in dettaglio come costruire e allineare l'eccitazione modulo / percorso, prova e caratterizzare il foglio leggero e montare il campione per l'imaging 3D. Fornisce inoltre esempi di film time-lapse acquisite con l'installazione su diversi ceppi che esprimono marcatori fluorescenti.
Protocol
1. Impostazione del foglio leggero e il Sentiero di rilevamento
La figura 1 riporta uno schema generale del setup ottico.
- Posizionare e fissare il microscopio e il laser sul tavolo ottico.
- Combinare laser 488 nm, 561 nm e 405 nm con i corrispondenti specchi dicroici. Dopo gli specchi dicroici, i laser devono essere precisamente co-allineati. Si noti che la scelta di lunghezze d'onda laser, specchi dicroici e filtri ottici è determinato dagli spettri di assorbimento delle etichette fluorescenti specifici usati negli esperimenti.
- Posizionare il filtro sintonizzabile acustico-ottico (AOTF). Utilizzare il foglio di prova forniti dal fornitore per regolare la frequenza e la potenza del AOTF. Quando ben allineato, circa il 90% della potenza del laser viene trasmesso ad un massimo di sintonia come misurato da una PowerMeter. Si noti che alcuni laser possono essere completamente controllati da software, che potrebbe rendere il AOTF inutile.
- Posizionare e fissareil telescopio. Si noti che il telescopio è composto di due lenti che espandono il raggio di una larghezza pari o superiore al diametro della apertura posteriore della lente obiettivo illuminazione. L'obiettivo con lunghezza focale minima dovrebbe venire prima.
- Luogo, allineare e fissare il periscopio portare verso l'alto il percorso ottico più vicino alla apertura posteriore della lente cilindrica. Si noti che i due specchi del periscopio sono montati in modo che il loro asse lungo è che sul l'inclinazione dello specchio per riflettere il fascio completamente espansa.
- Posizionare la lente cilindrica vicino all'uscita periscopio. Si noti che la lente cilindrica focalizza il fascio in una direzione e lascia collimata nell'altra direzione, formando così un foglio leggero.
- Ridefinire il foglio leggero risultante utilizzando la lente dell'obiettivo illuminazione. Si noti che il punto focale dell'immagine dell'obiettivo illuminazione deve coincidere con il punto focale oggetto dell'obiettivo rilevamento. Proiettare il fasciosu uno schermo (ad esempio un muro) ad una lunga distanza. Spostare l'obiettivo illuminazione lungo l'asse ottico di illuminazione avere sullo schermo taglienti contorni del foglio leggero.
- Posizionare la linea quad (405/488/561/638) filtro per le emissioni nel posto riservato al microscopio (cubo).
- Collocare la fotocamera EMCCD alla porta di uscita microscopio.
- Fissare la prima fase di traduzione manuale sul palco microscopio con viti in fori praticati nella fase microscopio. Si noti che il bordo del palco traduzione deve essere posizionata a circa 2 cm di distanza dal centro del palco microscopio, in modo che la cuvetta sia centrata sotto la lente obiettivo rilevamento.
- Fissare la seconda fase di traduzione manuale sul primo. Le direzioni delle due fasi devono essere perpendicolare (X e Y traduzioni).
- Fissare la fase Z piezoelettrico nella parte superiore dei due stadi precedenti. Si noti che un tavolino motorizzato può essere usata al posto della fase piezoelettrico.
- Fissare il Holde cuvettar (vedi figura 2) nella parte superiore degli stadi. La cuvetta baserà quindi all'intersezione del percorso illuminazione e il percorso di rilevamento, che sono perpendicolari l'uno all'altro.
2. Controllo del foglio leggero
- Riempie una vaschetta di vetro con soluzione fluorescente, e posizionarlo sul supporto del campione all'intersezione dei due percorsi ottici. Il foglio leggero è quindi visibile. Deve essere orizzontale e simmetrica / centrato rispetto alla lente obiettivo rilevamento.
- Rimuovere la lente cilindrica e acquisire un'immagine per misurare lo spessore del foglio leggero. Si noti che lo spessore del foglio leggero dipende l'apertura numerica (NA) dell'illuminazione lente obiettivo (circa 3-4 micron per NA = 0,3). Si noti che per un dato obiettivo, lo spessore della luce fogli può essere aumentata riducendo la dimensione del fascio entrare apertura posteriore con una fessura. Si noti che microsfere fluorescenti possono essere usate per misurare la scureRisoluzione ial e laterale del microscopio.
- Riposizionare la lente cilindrica prima di iniziare l'esperimento.
3. Il montaggio di C. elegans embrioni
I passi seguenti sono raffigurati nella Figura 3.
- Utilizzare una penna marcatura diamante per tagliare un pezzo di un vetrino di 10 x 20 x 1 mm.
- Preparare 5% bacto-agar in acqua, bollire e mantenerla in un blocco di riscaldamento a 60 ° C.
- Aggiungere 50 ml di poli-L-lisina su un lato del pezzo tagliato di diapositiva, lasciare asciugare.
- Posizionare un vetrino da microscopio in panchina e risolvere il problema.
- Giustapporre il pezzo tagliato di scorrimento con la slitta fissa e aggiungere una goccia di agar fuso sulla parte superiore. Spremere l'agar utilizzando un altro vetrino da microscopio pulito per ottenere un pad agar sottile.
- Lasciare che il pad agar asciugare prima di rimuovere la slitta superiore.
- Tagliare il pad agar sul lato della slitta fissata in modo da lasciare un eccesso di circa 3 mm oagar f e rimuovere delicatamente il vetrino fisso.
- Aggiungere 50 ml di poli-L-lisina sul agar e lasciare asciugare completamente.
- Mettere vermi gravide in M9 mezzo in un vetro da orologio.
- Tagliare i vermi a livello della vulva con un bisturi per liberare gli embrioni.
- Sotto un binoculare identificare gli embrioni allo stadio di interesse e raccoglierli utilizzando una pipetta microcapillare.
- Mettere gli embrioni da parte del agar rivestite con poli-L-lisina che sporge dal pezzo tagliato di diapositiva. Mettere gli embrioni proprio vicino al confine della diapositiva. Non posizionare gli embrioni al confine del agar, perché non sarà abbastanza stabile. Rimuovere delicatamente il liquido in modo che gli embrioni si attacchi sul livello poli-L-lisina.
- Allineare rapidamente gli embrioni per evitare la disidratazione.
- Posizionare il vetrino taglio in un piatto di plastica Petri e aggiungere delicatamente M9 medio per coprire la diapositiva.
- Controllare sotto un binocolo che le uova sono ancora bloccati sul agar.
4. Registrazione di C. Sviluppo elegans
- Fissare la precedente preparazione (taglio diapositiva, agar più embrioni) nel supporto del campione e trasferirli in una cuvetta. Figura 4 descrive il titolare casalingo e la Figura 5 mostra una vista della vaschetta in contesto osservazione.
- Fissare la cuvetta sul palco piezoelettrico.
- Identificare la posizione degli embrioni con illuminazione in campo chiaro.
- Avviare il software fatto in casa il controllo della AOTF, la fotocamera e la fase piezoelettrico. Si noti che un software libero, come micromanager, può anche essere usato.
- Selezionare la riga laser e di potenza (AOTF).
- Regolare la posizione del foglio leggero usando la fase 3 direzioni sostenere la lente cilindrica e la lente illuminazione. Spostare la fase lungo la direzione laterale (X) per ottenere il segnale luminoso. Regolare quindi la posizione Z del foglio leggero, e la posizione longitudinale (Y) per ottenere the migliore rapporto segnale-rumore. Si noti che la posizione del fuoco foglio leggero può essere necessario regolare da un embrione all'altro per correggere le differenze di lunghezza di percorso di luce.
- Per acquisire immagini time-lapse, selezionare il tempo di esposizione, guadagno, tempo tra due immagini, così come il numero di immagini da acquisire, e la potenza del laser. Per 2 acquisizione dei colori, selezionare una seconda linea laser. Due immagini a colori vengono acquisite consecutivamente.
- Per acquisire pila az, seleziona anche la distanza tra le due sezioni, e l'inizio e la fine posizioni del piezoelettrico.
Representative Results
Tre esperimenti di registrazione time-lapse in 3D di tre diversi C. elegans ceppi illustrano il tipo di dati che può essere ottenuto usando la configurazione microscopio foglio leggero sopra descritto. Abbiamo verificato che in queste condizioni gli embrioni si sviluppano a velocità normale e sopravvivere imaging, coerente con i rapporti precedenti che indicano che l'imaging SPIM provoca solo bassi livelli di fototossicità in C. elegans embrioni 6,7.
Il primo ceppo esprime un istone fuso con GFP (zuIs178, stIs10024). Registrazione è stata effettuata per 2 ore con una pila di fette 20 (distanza tra le sezioni 1 micron) preso ogni 37 sec. Figura 6 illustra un piano della pila a tempi diversi. Entrambi i nuclei interfasiche (freccia) e condensato cromatina mitotico (testa di freccia) sono chiaramente visibili.
Il secondo ceppo esprime un tubulina fuso con GFP (ruIs57) e un istonefusa alla mCherry (itIs37, stIs10226). La registrazione è stata effettuata durante 16 min con una pila di 20 fette (distanza tra le sezioni 1 micron) preso ogni 105 sec. Figura 7 illustra diversi piani dello stack e diversi punti temporali. Il film associato 1 visualizza ricostruzioni 3D a 3 punti temporali successivi. Durante la divisione, il fuso mitotico (verde) e cromosomi condensati (rosso) sono chiaramente visibili, permettendo il tracciamento degli orientamenti divisione cellulare durante lo sviluppo.
Il terzo ceppo esprime l'apolipoproteina VIT-2 fuso con GFP (pwIs23) e una membrana legata mCherry (ltIs44). La registrazione è stata effettuata durante 25 min con una pila di 10 fette (distanza tra le sezioni 1 micron) preso ogni 30 sec. Figura 8 illustra diversi piani dello stack e diversi punti temporali. I movimenti veloci delle particelle tuorlo lipoproteina (verde) all'interno delle cellule possono essere facilmenteseguita.
Figura 1: configurazione ottica SPIM composto di illuminazione e di rilevamento unità, anteriore e vista basso. Nell'unità di illuminazione, i laser combinate dagli specchi dicroici entrano AOTF, che controlla la potenza di ogni laser indipendente. Poi, il telescopio aumenta la dimensione del fascio da 4 volte e il periscopio lo porta all'altezza del microscopio. La lente cilindrica forma il foglio leggero, che è riorientato dall'obiettivo illuminazione. L'unità di rilevazione è integrato nel microscopio verticale ed è composta principalmente dalla lente di rilevamento, il filtro, la lente del tubo e la EMCCD. Il campione viene posizionato all'intersezione tra l'illuminazione e rilevazione percorsi. Una fase piezoelettrico consente verticale (Z) spostamenti del campioneper l'acquisizione 3D.
Figura 2:. Cuvette supporto Il supporto è costituito da 3 lastre di alluminio ed è avvitato sulla scena piezoelettrico. La cuvetta di vetro è detenuto da una molla (in rosso).
Figura 3: Montaggio protocollo di C. embrioni elegans per esperimenti SPIM. Un pezzo tagliato di vetro è rivestita con poli-L-lisina. Un pad di agar è posizionato sulla superficie rivestita. Poli-L-lisina viene aggiunto sul tampone agar. Infine, C. elegans embrioni sono allineate sul rivestita pad agar poli-L-lisina.
Figura 4: Supporto del campione. Il titolare si adatta alle dimensioni interne della cuvetta vetro. Due molle (in rosso) tenere il vetrino (descritto in Figura 3). Questo supporto viene poi messo dentro la provetta di vetro.
Figura 5:... Supporto del campione nel contesto osservazione embrioni sono immobilizzati sul vetrino secondo il protocollo riassunto in Figura 3 La slitta è tenuto dal titolare esempio descritto in Figura 4 Il porta campione viene inserito nella cuvetta di vetro, dal titolare descritto in Figura 2. Il foglio leggero è orizzontale ed illuminates gli embrioni dal lato. La lente obiettivo rilevamento è verticale, sopra il campione.
Figura 6: La registrazione di un C. elegans embrione esprime una fusione istone :: GFP immagini unico piano di un embrione transgenico che esprime un istone :: fusione GFP (zuIs178; stIs10024) in diversi punti temporali immagini estratte da una registrazione time-lapse in 3D:.. pile realizzate in 20 fette ( distanza tra le sezioni 1 micron); tempo di esposizione per fetta: 30 msec; intervallo di tempo tra pile: 37 sec; tempo di acquisizione totale: 2 ore. Arrow: nucleo interfasico, punta di freccia: condensato cromatina mitotico. A t = 0 min l'embrione è allo stadio di 2 cellule e at = 120 min dell'embrione contiene circa 70 celle come previsto nelle normali s sviluppopeed (notare che solo le cellule contenute in un unico piano sono visibili nelle immagini e non tutte le cellule dell'embrione). Il potere di illuminazione era il 30 μW a 488 nm (misurata all'uscita dell'obiettivo illuminazione). Cliccare qui per visualizzare questo video.
Figura 7: Registrazione di una C. elegans embrione esprimendo un tubulina :: GFP fusion e un istone :: mCherry fusione. immagini estratte da una registrazione time-lapse in 3D di una C. elegans embrione esprimendo un tubulina :: GFP fusione (ruIs57) e un istone :: mCherry fusione (itIs37, stIs10226). Condizioni di registrazione: acquisizione di una pila di 20 fette (distanza tra fette di 1micron) ogni 105 secondi; tempo totale di acquisizione: 16 min; tempo di esposizione: 200 msec per ciascun canale. Pannello una mostra 10 fette della stessa risma. Pannello B mostra la stessa fetta ogni 210 sec. Il potere di illuminazione era il 30 μW e 300 μW, per 488 e 561 nm laser, rispettivamente (misurati all'uscita dell'obiettivo illuminazione). Cliccare qui per visualizzare questo video.
Figura 8: La registrazione di un C. elegans embrione esprimendo un VIT-2 :: GFP fusion e una membrana mirati mCherry. immagini estratte da una registrazione time-lapse in 3D di una C. elegans embrione esprime una fusione VIT-2 :: GFP (PWIS23) e un mCherry membrana targeting (ltIs44). Condizioni di registrazione: acquisizione di una pila di 10 fette (distanza tra le sezioni 1 micron) ogni 30 secondi; tempo totale di acquisizione: 25 min; tempo di esposizione per canale: 200 msec. Pannello A mostra i primi 5 fette della stessa pila. Pannello B mostra la stessa fetta ogni 30sec. Cliccare qui per visualizzare questo video.
Discussion
Questo protocollo descrive una facile configurazione della microscopia foglio leggero per l'imaging in vivo di C. elegans embrioni. Gli elementi ottici necessari per creare e allineare il foglio leggero, tra cui laser, beam expander, collimazione e lenti di messa a fuoco, possono essere facilmente montati su un banco ottico. In combinazione con un microscopio verticale per il percorso di rilevamento e la fotocamera, questo fornisce una soluzione semplice per impostare un microscopio foglio leggero.
Questa geometria rende l'ambiente campione semplice. Il campione vivente è posto in una cuvetta di vetro, che si svolge, posizionato e mosso da un piccolo insieme di pezzi meccanici. Come microscopia illuminazione foglio è una tecnica a largo campo con sezionamento, è necessario solo un singolo asse motorizzato movimento per l'imaging 3D. Questo limita il requisito di sincronizzazione di un singolo elemento di scansione e facilita lo sviluppo di software. Rispetto al ISPIM 6 nostro GEOMET verticaleRY permette l'uso di alta lente obiettivo NA per il rilevamento. Rispetto a configurazioni SPIM con lenti obiettive nel piano orizzontale il montaggio del campione e l'imaging di una serie di embrioni sono più facili. Complessivamente, l'applicazione di questa tecnica è semplice e può essere realizzato con poca esperienza nel settore dell'ottica. Questa è un'alternativa più economica per microscopi confocali con i vantaggi di una maggiore velocità e fototossicità ridotta ma inconveniente di risoluzione assiale inferiore.
Abbiamo sviluppato anche un modo semplice e riproducibile per montare C. embrioni elegans per l'imaging in vivo tramite questo sistema. La procedura di montaggio è veloce (15 min) ed è adatto per esperimenti quotidiane. Per C. immagini elegans, i vantaggi di questa semplice impostazione sono almeno due pieghe: (i) in toto l'imaging è possibile senza rotazione e quindi la ricostruzione 3D è semplice; (Ii) il montaggio del campione è semplice e più embrioni può essere ripreso in sequenzasulla stessa diapositiva. Abbiamo mostrato alcuni esempi di filmati time-lapse con una risoluzione temporale sufficiente osservare le divisioni cellulari e variazioni di forma delle cellule. Il potere di microscopia foglio leggero per studiare C. sviluppo elegans è stato recentemente illustrato da altri 6, 7, 8. Pertanto, questa tecnica sarà molto utile per studiare la morfogenesi e patterning del C. elegans embrione.
Questo sistema può essere utilizzato anche per analizzare lo sviluppo di altri organismi modello? È importante riconoscere che l'attuazione del foglio illuminazione microscopia per organismo piccola e trasparente come C. elegans è meno severe che per gli organismi più grandi come embrioni di Drosophila. in toto l'imaging di Drosophila normalmente richiede la rotazione e multi-vista ricostruzioni 9, 10. eccitazione da due lati con lenti dell'obiettivo di eccitazione collineari possono anche ridurre gli effetti d'ombra causate dalla attenuatione della luce 11. Tuttavia, la configurazione qui presentata è ancora atto ad immagine un lato degli embrioni di Drosophila, con basso candeggio e bassa photoxicity. Questa configurazione potrebbe essere utile anche per immagini piccole e trasparenti embrioni come ascidie o zebrafish.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo tutti i membri del Lenne e laboratori Bertrand, in particolare, Olivier Blanc per lo sviluppo software e Jérémie Capoulade per la discussione. Ringraziamo anche la funzione di imaging PICsL-IBDM, in particolare Claude Moretti e Brice Detailleur per il supporto tecnico.
Questo lavoro è stato sostenuto da ATIP sovvenzioni dal CNRS (a P.-FL e VB), il Labex INFORM concessione (da P.-FL e VB) e una sovvenzione da Sanofi-Aventis (VB). Noi riconosciamo l'infrastruttura France-Bioimmagini sostenuto dalla Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-InSb-04-01, chiamiamo "Investissements d'Avenir").
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SPIM | |||
| Detection | |||
| upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
| 100x W objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
| EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
| Illumination | |||
| LASER 488 nm / 60 mW | TOPTICA | iBeam smart | |
| LASER 405 nm / 120 mW | TOPTICA | iBeam smart | |
| LASER 561 nm / 500 mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
| filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
| Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
| Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
| AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
| mirror | |||
| lens 50 mm | THORLABS | telescope 5X | |
| lens 200 mm | THORLABS | telescope 5X | |
| periscope | THORLABS | RS99/M | |
| cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
| 10X NA 0,3 | NIKON | ||
| xyz stage | NEWPORT | ||
| Sample | |||
| Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
| Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
| Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
| M9 medium: | |||
| KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
| Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
| NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
| MgSO4 (1 mM final) | Any supplier | ||
| cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
| sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
| x stage | NEWPORT | ||
| coverslip 50x20x1 mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
| piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
| cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
| Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
| Software | |||
| C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview | ||
References
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