이 프로토콜은 가벼운 시트 현미경의 설치 및 C의 생체 내 이미징을위한 그것의 구현에 대해 설명합니다 엘레 배아.
빠른 속도와 낮은 광독성 이미징 기술은 토토의 유기체의 발달을 연구하는 전제 조건이다. 세포 내 해상도로 3D 영상을 제공하면서 빛 시트 기반 현미경, 사진 표백 및 공 초점 현미경에 비해 광독성 효과를 감소시킨다. 여기에 우리가 직립 현미경과 빛 시트의 생성을위한 광 – 기계 요소의 작은 집합으로 구성되어 가벼운 시트 기반의 현미경의 설정을 제시한다. 이 프로토콜은, 빌드 현미경을 정렬하고 빛 시트의 특성을하는 방법에 대해 설명합니다. 또, C. TOTO의 이미징에 대한 방법을 구현하는 방법을 상세 elegans의 간단한 관찰 챔버를 이용하여 배아. 이 방법은 개발의 몇 시간 이상 3D 두 색상 시간 경과 영화를 캡처 할 수 있습니다. 이 기능은 장시간 세포의 모양, 세포 분열 및 태그 단백질의 추적을 용이하게한다.
유기체의 형성과 형성 세포의 움직임, 세포 모양의 변화, 세포 분열과 세포 분화를 포함한다. 이러한 프로세스의 진행과 조정을 이해하는 세 가지 차원으로 기능과 세포 내 해상도와 빠른 이미징 도구가 필요합니다. 이러한 생체 내 이미징 기능과 기술 사이, 빛 시트 조명 현미경은 단일 / 선택적 비행기 조명 현미경이라고 저 광독성 효과 및 1,2 낮은 photobleaching에 생산의 고유 한 장점이있다.
시트 조명 현미경에서 시료를 광학 단면 처리를 행하는 광 시트에 의해 측으로부터 조명된다. 조명 경로와 검출 경로는 서로 수직 및 광 시트는 검출 대물 렌즈의 물체 초점면과 일치하도록 정렬된다. 샘플은 두 경로의 교차점에 배치된다ND 3D 이미징을 허용하도록 검출 축을 따라 이동 될 수있다. 또한 남은 평면은 조명되고,이 평면의 모든 포인트가 동시에 검출된다. 이것은 상당히 수집 속도를 증가시키고 공 초점 현미경 (3)에 비해 광표백뿐만 아니라 광독성을 감소시킨다.
이 차원 화상에 대해, 제공된 스캔 탐지 부분은 없으며, 조명 부분은 어느 것도 필요하지 않다; : 실용 시트 조명 현미경 설정 및 정렬하기 쉬운 기능 구획으로 광 시야 기술로서, 3 차원 화상은 샘플을 잡고 스테이지의 하나의 축 이동에 의해 얻어 질 수있다.
여기에서 우리는 C의 토토 영상에 대한 간단한 빛 시트 현미경과 그 구현의 설정까지 제시 elegans의 배아. C. 엘레 배아 잘 생체 IMA 살고 적합투명도로 인해 ging를, 불변의 혈통과 셀에 박힌 4,5를 배치합니다. 개발 된 광 시트 설치가 검출을위한 표준 직립 현미경을 기반으로합니다. 아래에 제시 프로토콜을 구축하고 정렬 여기 모듈 / 경로, 테스트 및 빛 시트의 특성과 3D 영상의 샘플을 장착하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 또한 형광 마커를 표현하는 다양한 균주의 설정과 획득 시간 경과 영화의 예를 제공합니다.
이 프로토콜은 C의 생체 내 이미징을위한 빛 시트 현미경의 쉬운 설치를 설명 엘레 배아. 레이저, 빔 익스팬더, 시준 및 초점 렌즈를 포함한 광 시트를 생성하고 정렬하기 위해 필요한 광학 소자는 용이하게 광학 벤치에 장착 될 수있다. 검출 경로와 카메라의 직립 현미경과 조합하여,이 설정에 대한 간단한 솔루션 가벼운 시트 현미경을 제공합니다.
이 형상은 샘플 환경이 간단하게. 살아있는 표본이 개최 위치 및 기계 조각의 작은 집합으로 이동 유리 큐벳에 배치됩니다. 시트 조명 현미경 능력을 가진 절편 넓은 분야의 기술이기 때문에, 단지 하나의 축 동력 이동은 3D 이미징을 위해 요구된다. 이것은 단일 스캔 소자에 동기화 요건을 제한하고, 소프트웨어 개발을 용이하게한다. iSPIM 6 우리의 수직 지오에 비해RY는 검출 용 고 NA 대물 렌즈의 사용을 허용한다. 수평면에서 대물 렌즈와 SPIM 셋업에 비해 샘플의 장착 및 배아의 일련의 이미징은 쉽다. 전부,이 기술의 구현은 간단하고 광학에 약간의 전문 지식을 얻을 수 있습니다. 이것은 더 빠른 속도와 더 감소 광독성하지만 낮은 축 해상도의 단점의 장점과 공 초점 현미경에 싼 대안이다.
우리는 또한 C.를 탑재 할 수있는 쉽고 재현성있는 방법을 개발 이 시스템을 사용하여 생체 내 이미징을위한 엘레 간스의 배아. 설치 절차는 빠르게 (15 분) 일상 실험에 적합합니다. C.에 대한 엘레 영상, 간단한 설치의 장점은 적어도 두 겹이다 : 토토 이미징 (i)는 회전하지 않고 가능하기 때문에 3D 재건은 간단합니다; (II) 샘플 설치가 용이하고 여러 개의 배아는 순차적으로 이미지화 할 수있다같은 슬라이드에. 우리는 세포 분열과 세포 모양의 변화를 관찰 할 수있는 충분한 시간 분해능과 시간 경과 영화의 예를 보여 주었다. C.을 연구하는 빛 시트 현미경의 힘 elegans의 개발도 최근 다른 6, 7, 8에 의해 설명되었다. 따라서,이 기술은 C.의 형태 형성 및 패터닝을 연구하는 것은 매우 유용 할 것이다 elegans의 배아.
이 시스템은 또한 다른 모델 생물의 발달을 분석하는 데 사용할 수 있습니까? 그것은 인식하는 것이 중요하다되도록 C. 작은 투명 유기체 시트 조명 현미경의 구현 엘레은 Drosophila의 배아와 같은 큰 생물보다 덜 엄격하다. 초파리의 토토 영상에서 일반적으로 회전 및 멀티 뷰 복원 9, 10. 선상 여기 대물 렌즈와 두 가지 측면에서 흥분도 attenuat에 의한 그림자 효과를 감소 할 수 있습니다 필요합니다빛 (11)의 이온. 그러나, 여기에 제시된 설정은 여전히 낮은 표백과 낮은 photoxicity으로, 초파리 배아의 이미지를 한쪽으로 구성된다. 이 설정은 또한 멍게 또는 제브라 피쉬와 같은 이미지를 작은 투명 배아에 도움이 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 토론을위한 소프트웨어 개발 및 제레미 Capoulade 특히 올리비에 블랑, 모든 Lenne의 회원들과 버트 랜드 연구소 감사합니다. 우리는 또한 기술 지원 PICsL-IBDM 영상 시설, 특히 클로드 모레티와 브라이스 Detailleur 감사합니다.
이 작품은 (P.-FL 및 VB에) CNRS에서 ATIP의 교부금에 의해 지원되었다, Labex은 (VB에) 사노피 – 아벤티스에서와 부여 (P.-FL 및 VB에) 부여를 알려 드리겠습니다. 우리는 (ANR-10-된 InSb-04-01 "INVESTISSEMENTS D' Avenir에서"를 호출) 직원은 국립 드 라 공들인에서 지원하는 프랑스 바이오 이미징 인프라를 인정합니다.
SPIM | |||
Detection | |||
upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
Illumination | |||
LASER 488nm / 60mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 405nm / 120mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 561nm / 500mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
mirror | |||
lens 50mm | THORLABS | telescope 5X | |
lens 200mm | THORLABS | telescope 5X | |
periscope | THORLABS | RS99/M | |
cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
10X NA 0,3 | NIKON | ||
xyz stage | NEWPORT | ||
Sample | |||
Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
M9 medium: | |||
KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
MgSO4 (1mM final) | Any supplier | ||
cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
x stage | NEWPORT | ||
coverslip 50x20x1mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
Software | |||
C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview |