本协议描述了一个光片显微镜的建立和实施对C的体内成像线虫胚胎。
快和低光毒性成像技术是先决条件,研究生物的全盘发展。轻质板材基于显微降低光漂白和比较,激光共聚焦显微镜光毒性作用,同时提供3D图像与亚细胞分辨率。这里我们提出了一种基于光片的显微镜,它是由一个直立显微镜和一小部分的光片的产生光电机械元件的安装。该协议描述了如何建立,对准显微镜表征光片。此外,它详细介绍了如何实现该方法在C的全盘成像线虫使用一个简单的观察室的胚胎。该方法允许的3D两色时间推移电影在几个小时内发展的捕获。这应该减轻细胞形态,细胞分裂和蛋白质标记在很长一段时间的跟踪。
一个生物体的形成和塑造涉及细胞运动,细胞形态变化,细胞分裂和细胞分化。了解这些过程的进展和需要协调三个维度的能力和亚细胞分辨率快速成像工具。其中包括与这些体内成像能力的技巧,光板照明显微镜也被称为单/选择性平面照明显微镜具有生产低光毒性作用,低光漂白1,2的独特优势。
在片材的照明显微镜,将样品从侧面由一个光片,它执行光学切片照亮。照明路径和检测路径是彼此垂直和光片对齐到与检测物镜的物方焦平面重合。样品被放置在两条路径相交,一个ND可沿检测轴移动,让3D成像。感兴趣的唯一的平面被照亮,并在同一时间被检测到该平面的所有点。这显著增加了采集速度,并降低光致漂白和光毒性相比,共聚焦显微镜3。
实际上,板材照明显微镜是易于安装和对齐:对于二维成像,无扫描是必要的既不是为了检测部分,也没有照明部;作为与切片能力宽视场技术中,三维成像可以由平台保持的样品的单一轴的移动来获得。
在这里,我们在C的全盘成像提出一个简单的光薄片显微镜及其实施的设立为线虫胚胎。C.线虫的胚胎非常适合生活在体内 IMA更改,由于其透明度,不变的血统和千篇一律的细胞定位4,5。所开发的光片的设置是基于一个标准的直立显微镜的检测。下面介绍的协议详细介绍了如何构建和调整激励模块/路径,测试及表征光片和安装样品三维成像。它还提供了对表达荧光标记不同菌株的设置收购时间推移电影的例子。
本协议描述了一个简单的安装光片镜检为C的体内成像线虫胚胎。需要创建并对准光片,包括激光器,光束扩展器,准直和聚焦透镜的光学元件,可以很容易地安装在光具座上。在与一个堂堂正正的显微镜检测路径和摄像机组合,这提供了一个简单的解决方案来设置一个光片显微镜。
这种几何形状使得样品环境简单。的活体被放置在玻璃比色皿,其被保持,定位并通过一小部分的机械件移动。作为钢板照明显微镜是切片能力的宽视场技术,只有电动单轴运动所需的3D成像。这限制了同步的要求,以一个单一的扫描元件,便于软件的开发。相较于iSPIM 6我们直立GEOMETRY允许使用高NA物镜的进行检测。相比SPIM的设置,不同的物镜在水平面内样品的安装和一系列胚胎的成像更容易。总之,这一技术的实现是简单的并且可以与小的专门知识光学来实现。这是一个更便宜的替代的共焦显微镜具有更高的速度和降低光毒性,但较低的轴向分辨率的缺点的优点。
我们还开发了一个简单的和可重复的方法来安装C。线虫的胚胎在体内使用这个系统的成像。在安装过程是快速的(15分钟),并且是适合于日常的实验。对于C。线虫成像,这种简单的设置的优点是至少两个褶皱:(i) 于全盘成像是可能的,不旋转,因此三维重建是直接的; (ⅱ)样品的安装是容易的,多个胚胎可以顺序成像在同一张幻灯片。我们发现时间推移电影的例子有足够的时间分辨率来观察细胞分裂和细胞形态的变化。光薄片显微镜来研究下的权力线虫发展也已最近由其他人6,7,8所示,因此,这种技术将是非常有用的,研究C的形态发生和图案形成线虫胚胎。
可这个系统也可以用来分析其他模式生物的发展?认识到这一点很重要薄片照明显微镜的小型和透明生物体(如C)的实施线虫是比较大的生物体如果蝇胚胎不那么严格, 在果蝇的托托成像通常需要旋转和多视图重建9,10。激励从两侧用共线激发物镜也可以降低所造成的attenuat的阴影效果离子灯11。然而,这里介绍的设置仍然适用于果蝇胚胎的图像一侧,具有低白化,低光毒性。这种设置也可能是有用的图像和小的胚胎透明,如海鞘类动物或斑马鱼。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Lenne的所有成员和Bertrand实验室,特别是奥利维尔相思的软件开发和热雷米Capoulade讨论。我们也感谢PICsL-IBDM成像设备,尤其是克劳德·莫雷蒂和布莱斯Detailleur技术支持。
这项工作是由ATIP补助金从国家科学研究中心(到P-FL和VB)的支持下,Labex INFORM补助(至P-FL和VB)和赠款赛诺菲 – 安万特公司(以VB)。我们承认由法新社国立德拉RECHERCHE支持法国 – 生物成像的基础设施(ANR-10-INSB-04-01,称之为“INVESTISSEMENTS德艾文莉”)。
SPIM | |||
Detection | |||
upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
Illumination | |||
LASER 488nm / 60mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 405nm / 120mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 561nm / 500mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
mirror | |||
lens 50mm | THORLABS | telescope 5X | |
lens 200mm | THORLABS | telescope 5X | |
periscope | THORLABS | RS99/M | |
cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
10X NA 0,3 | NIKON | ||
xyz stage | NEWPORT | ||
Sample | |||
Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
M9 medium: | |||
KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
MgSO4 (1mM final) | Any supplier | ||
cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
x stage | NEWPORT | ||
coverslip 50x20x1mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
Software | |||
C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview |