इस प्रोटोकॉल एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप की स्थापना और सी. के vivo इमेजिंग के लिए इसके कार्यान्वयन का वर्णन एलिगेंस भ्रूण.
तेजी से और कम phototoxic इमेजिंग तकनीक पूर्ण में जीवों के विकास का अध्ययन करने के लिए पूर्व अपेक्षित हैं. Subcellular संकल्प के साथ 3 डी छवियों को प्रदान करते हुए हल्की चादर आधारित माइक्रोस्कोपी, तस्वीर विरंजन और confocal माइक्रोस्कोपी की तुलना में phototoxic प्रभाव कम कर देता है. यहाँ हम एक ईमानदार माइक्रोस्कोप और प्रकाश चादर की पीढ़ी के लिए ऑप्टो यांत्रिक तत्वों का एक छोटा सा सेट से बना है जो एक प्रकाश चादर आधारित माइक्रोस्कोप, की स्थापना उपस्थित थे. प्रोटोकॉल, निर्माण माइक्रोस्कोप संरेखित और प्रकाश चादर चिह्नित करने के लिए कैसे करें. इसके अलावा, यह सी. के पूर्ण इमेजिंग में के लिए विधि को लागू करने के लिए कैसे विवरण एलिगेंस एक सरल अवलोकन कक्ष का उपयोग भ्रूण. विधि विकास के कुछ घंटे से अधिक 3 डी दो रंगों समय चूक फिल्मों का कब्जा अनुमति देता है. इस समय की लंबी अवधि में सेल आकार, कोशिका विभाजन और टैग प्रोटीन की ट्रैकिंग को कम करना चाहिए.
एक जीव के गठन और आकार देने सेल आंदोलनों, सेल आकार में परिवर्तन, कोशिका विभाजन और सेल भेदभाव शामिल है. इन प्रक्रियाओं की प्रगति और समन्वय को समझना तीन आयामों की क्षमता है और subcellular संकल्प के साथ तेज इमेजिंग उपकरणों की आवश्यकता होती है. इन vivo इमेजिंग क्षमताओं के साथ तकनीकों के बीच, प्रकाश चादर रोशनी माइक्रोस्कोपी भी एकल / चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी कहा जाता है कम phototoxic प्रभाव और 1,2 कम photobleaching उत्पादन का अनूठा लाभ दिया है.
चादर रोशनी माइक्रोस्कोपी में, नमूना ऑप्टिकल सेक्शनिंग करता है जो एक प्रकाश चादर, द्वारा की ओर से प्रकाशित है. रोशनी पथ और पहचान पथ दूसरे से सीधा कर रहे हैं और प्रकाश चादर का पता लगाने के उद्देश्य लेंस की वस्तु फोकल हवाई जहाज़ के साथ मेल खाना करने के लिए गठबंधन किया है. नमूना, दो रास्तों के चौराहे पर रख दिया गया है एकएन डी 3 डी इमेजिंग की अनुमति देने का पता लगाने के अक्ष के साथ ले जाया जा सकता है. केवल ब्याज की विमान प्रबुद्ध है और इस विमान के सभी बिंदुओं को एक ही समय में पता चला रहे हैं. यह काफी अधिग्रहण की गति बढ़ जाती है और confocal माइक्रोस्कोपी 3 की तुलना में photobleaching के साथ ही phototoxicity कम कर देता है.
दो आयामी इमेजिंग के लिए, कोई स्कैनिंग का पता लगाने के भाग के लिए, और न ही रोशनी भाग के लिए न तो आवश्यक है;: व्यावहारिक रूप से, चादर रोशनी माइक्रोस्कोपी सेटअप और संरेखित करने के लिए आसान है क्षमता सेक्शनिंग के साथ एक व्यापक क्षेत्र तकनीक के रूप में, तीन आयामी इमेजिंग नमूना पकड़े मंच की एक धुरी के आंदोलन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
यहाँ हम सी का पूर्ण इमेजिंग में के लिए एक साधारण प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप और इसके कार्यान्वयन की स्थापना पेश एलिगेंस भ्रूण. सी. एलिगेंस भ्रूण अच्छी तरह vivo में आईएमए रहने के लिए उपयुक्त हैंउनकी पारदर्शिता के कारण ging, अपरिवर्तनीय वंश और सेल टकसाली 4,5 पदों. विकसित प्रकाश चादर सेटअप का पता लगाने के लिए एक मानक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर आधारित है. नीचे प्रस्तुत प्रोटोकॉल का निर्माण और संरेखित उत्तेजना मॉड्यूल / पथ, परीक्षण और प्रकाश चादर विशेषताएँ और 3 डी इमेजिंग के लिए नमूना माउंट करने के लिए विवरण कैसे. यह भी फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त विभिन्न प्रकारों पर स्थापना के साथ प्राप्त कर लिया समय चूक फिल्मों के उदाहरण प्रदान करता है.
इस प्रोटोकॉल सी. के vivo इमेजिंग के लिए प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी का एक आसान स्थापना का वर्णन एलिगेंस भ्रूण. लेज़रों, किरण विस्तारक, संधान और ध्यान केंद्रित लेंस सहित प्रकाश चादर, बनाने और संरेखित करने के लिए आवश्यक ऑप्टिकल तत्वों, आसानी से एक ऑप्टिकल बेंच पर रखा जा सकता है. पता लगाने के पथ और कैमरा के लिए एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ संयोजन में, इस स्थापना के लिए एक सरल समाधान के लिए एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप प्रदान करता है.
इस ज्यामिति नमूना पर्यावरण सरल बनाता है. रह नमूना, आयोजित तैनात है और यांत्रिक टुकड़े के एक छोटे से सेट द्वारा ले जाया जाता है जो एक गिलास क्युवेट, में रखा गया है. चादर रोशनी माइक्रोस्कोपी क्षमता सेक्शनिंग के साथ एक व्यापक क्षेत्र तकनीक है, केवल एक ही धुरी मोटर चालित आंदोलन 3 डी इमेजिंग के लिए आवश्यक है. यह एक स्कैनिंग तत्व को तुल्यकालन की आवश्यकता सीमा और सॉफ्टवेयर विकास की सुविधा. ISPIM 6 हमारे ईमानदार geomet की तुलनाRY का पता लगाने के लिए उच्च एनए उद्देश्य लेंस का प्रयोग अनुमति देता है. क्षैतिज विमान में उद्देश्य लेंस के साथ SPIM setups की तुलना में नमूना के बढ़ते और भ्रूण की एक श्रृंखला की इमेजिंग आसान कर रहे हैं. कुल मिलाकर, इस तकनीक के कार्यान्वयन सरल है और प्रकाशिकी में थोड़ा विशेषज्ञता के साथ प्राप्त किया जा सकता है. यह एक उच्च गति और कम phototoxicity लेकिन एक कम अक्षीय संकल्प की कमी के फायदे के साथ confocal सूक्ष्मदर्शी के लिए एक सस्ता विकल्प है.
हम भी सी. माउंट करने के लिए एक आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने तरीका विकसित इस प्रणाली का उपयोग vivo इमेजिंग के लिए एलिगेंस भ्रूण. बढ़ते प्रक्रिया तेज है (15 मिनट) और रोजमर्रा के प्रयोगों के लिए उपयुक्त है. सी के लिए एलिगेंस इमेजिंग, इस साधारण सेटअप के फायदे कम से कम दो गुना कर रहे हैं: पूर्ण इमेजिंग में (मैं) रोटेशन के बिना संभव है और इस प्रकार 3 डी पुनर्निर्माण सीधा है; (Ii) नमूना बढ़ते आसान है और कई भ्रूण क्रमिक रूप से imaged किया जा सकता हैएक ही स्लाइड पर. हम कोशिका विभाजन और सेल आकार में परिवर्तन का पालन करने के लिए पर्याप्त अस्थायी समाधान के साथ समय चूक फिल्मों के उदाहरण से पता चला है. सी. अध्ययन करने के लिए प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी की शक्ति एलिगेंस विकास भी हाल ही में दूसरों 6, 7, 8 से यह साफ कर दिया गया है. इसलिए, इस तकनीक सी. के morphogenesis और patterning अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी हो जाएगा एलिगेंस भ्रूण.
इस प्रणाली को भी अन्य मॉडल जीवों के विकास का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है? यह समझना महत्वपूर्ण है कि ऐसे सी के रूप में छोटे और पारदर्शी जीव के लिए चादर रोशनी माइक्रोस्कोपी का कार्यान्वयन एलिगेंस ऐसे ड्रोसोफिला भ्रूण के रूप में बड़े जीवों के लिए की तुलना में कम कठोर है. ड्रोसोफिला का पूर्ण इमेजिंग में सामान्य रूप से रोटेशन और बहु दृश्य पुनर्निर्माण 9, 10. समरेख उत्तेजना उद्देश्य लेंस के साथ दोनों पक्षों से उत्तेजना भी attenuat की वजह से छाया प्रभाव को कम कर सकते हैं की आवश्यकता हैप्रकाश 11 के आयन. फिर भी, यहां प्रस्तुत सेटअप अभी भी कम विरंजन और कम photoxicity साथ, ड्रोसोफिला भ्रूण की छवि एक पक्ष के लिए अनुकूल है. इस सेटअप भी ऐसे ascidians या zebrafish के रूप में छवि छोटे और पारदर्शी भ्रूण के लिए उपयोगी हो सकता है.
The authors have nothing to disclose.
हम चर्चा के लिए सॉफ्टवेयर विकास और जेरेमी Capoulade के लिए विशेष ओलिवर ब्लैंक में, सभी Lenne के सदस्यों और बर्ट्रेंड लैब्स धन्यवाद. हम भी तकनीकी सहायता के लिए PICsL-IBDM इमेजिंग सुविधा, विशेष रूप से क्लाउड Moretti और ब्राइस Detailleur धन्यवाद.
यह काम (पी.-सीए और वीबी लिए) CNRS से ATIP अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, LABEX (वीबी लिए) Sanofi-एवेंटिस से और एक अनुदान (पी.-सीए और वीबी लिए) अनुदान को सूचित करें. हम (ANR-10-InSb-04-01 "INVESTISSEMENTS डी 'Avenir' कहते हैं) एजेंस Nationale डे ला Recherche द्वारा समर्थित फ्रांस-BioImaging बुनियादी ढांचे को स्वीकार करते हैं.
SPIM | |||
Detection | |||
upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
Illumination | |||
LASER 488nm / 60mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 405nm / 120mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 561nm / 500mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
mirror | |||
lens 50mm | THORLABS | telescope 5X | |
lens 200mm | THORLABS | telescope 5X | |
periscope | THORLABS | RS99/M | |
cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
10X NA 0,3 | NIKON | ||
xyz stage | NEWPORT | ||
Sample | |||
Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
M9 medium: | |||
KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
MgSO4 (1mM final) | Any supplier | ||
cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
x stage | NEWPORT | ||
coverslip 50x20x1mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
Software | |||
C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview |