Questo protocollo descrive la configurazione di un microscopio foglio leggero e la sua applicazione per l'imaging in vivo di C. elegans embrioni.
Tecniche di imaging fototossiche veloci e bassi sono pre-requisito per studiare lo sviluppo di organismi in toto. La microscopia foglio leggero basato riduce fotometabolismo ed effetti fototossiche rispetto alla microscopia confocale, fornendo immagini 3D con una risoluzione sub-cellulare. Presentiamo qui la configurazione di un foglio basato microscopio ottico, che è composto da un microscopio verticale e un piccolo insieme di elementi opto-meccanici per la generazione del foglio leggero. Il protocollo descrive come costruire, allineare il microscopio e caratterizzano il foglio leggero. Inoltre, si descrive come implementare il metodo per l'imaging in toto di C. elegans embrioni utilizzando una semplice camera di osservazione. Il metodo consente la cattura di 3D bicolore film time-lapse over poche ore di sviluppo. Questo dovrebbe facilitare il monitoraggio delle forma della cellula, divisioni cellulari e proteine marcate per lunghi periodi di tempo.
La formazione e la sagomatura di un organismo comporta movimenti delle cellule, forma cambia cellulare, divisione cellulare e la differenziazione cellulare. Comprendere la progressione e il coordinamento di questi processi richiedono strumenti veloci di imaging con possibilità di tre dimensioni e la risoluzione subcellulare. Tra le tecniche con le capacità di imaging in vivo in luce foglio di illuminazione microscopio chiamato anche single / selettiva microscopia illuminazione aereo ha il vantaggio unico di produrre effetti a bassa fototossico e basso photobleaching 1,2.
Nel foglio di illuminazione microscopia, il campione è illuminato dal lato da un foglio leggero, che esegue il sezionamento ottico. Il percorso di illuminazione e il percorso di rilevamento sono perpendicolari tra loro e il foglio leggero è allineato a coincidere con il piano focale oggetto della lente obiettivo rilevamento. Il campione è posto all'intersezione dei due percorsi, unND può essere spostato lungo l'asse di rilevamento per consentire l'imaging 3D. Solo il piano di interesse è illuminato e tutti i punti di questo piano vengono rilevati allo stesso tempo. Ciò aumenta notevolmente la velocità di acquisizione e riduce fotoscolorimento nonché fototossicità rispetto alla microscopia confocale 3.
In pratica, la microscopia illuminazione foglio è facile da installare e align: per due l'imaging tridimensionale, non scansione è necessaria né per la parte di rilevamento, né per la parte illuminazione; come tecnica a grande campo con sezionamento, imaging tridimensionale può essere ottenuta con un singolo movimento asse della scena tenendo il campione.
Qui vi presentiamo la creazione di un microscopio semplice foglio leggero e la sua attuazione in toto per l'imaging di C. elegans embrioni. C. elegans embrioni sono adatti a vivere in vivo imaging a causa della loro trasparenza, lignaggio invariante e stereotipato cellulare posiziona a 4,5. Il setup foglio leggero sviluppato è basato su microscopio verticale standard per il rilevamento. Il protocollo presentato di seguito in dettaglio come costruire e allineare l'eccitazione modulo / percorso, prova e caratterizzare il foglio leggero e montare il campione per l'imaging 3D. Fornisce inoltre esempi di film time-lapse acquisite con l'installazione su diversi ceppi che esprimono marcatori fluorescenti.
Questo protocollo descrive una facile configurazione della microscopia foglio leggero per l'imaging in vivo di C. elegans embrioni. Gli elementi ottici necessari per creare e allineare il foglio leggero, tra cui laser, beam expander, collimazione e lenti di messa a fuoco, possono essere facilmente montati su un banco ottico. In combinazione con un microscopio verticale per il percorso di rilevamento e la fotocamera, questo fornisce una soluzione semplice per impostare un microscopio foglio leggero.
Questa geometria rende l'ambiente campione semplice. Il campione vivente è posto in una cuvetta di vetro, che si svolge, posizionato e mosso da un piccolo insieme di pezzi meccanici. Come microscopia illuminazione foglio è una tecnica a largo campo con sezionamento, è necessario solo un singolo asse motorizzato movimento per l'imaging 3D. Questo limita il requisito di sincronizzazione di un singolo elemento di scansione e facilita lo sviluppo di software. Rispetto al ISPIM 6 nostro GEOMET verticaleRY permette l'uso di alta lente obiettivo NA per il rilevamento. Rispetto a configurazioni SPIM con lenti obiettive nel piano orizzontale il montaggio del campione e l'imaging di una serie di embrioni sono più facili. Complessivamente, l'applicazione di questa tecnica è semplice e può essere realizzato con poca esperienza nel settore dell'ottica. Questa è un'alternativa più economica per microscopi confocali con i vantaggi di una maggiore velocità e fototossicità ridotta ma inconveniente di risoluzione assiale inferiore.
Abbiamo sviluppato anche un modo semplice e riproducibile per montare C. embrioni elegans per l'imaging in vivo tramite questo sistema. La procedura di montaggio è veloce (15 min) ed è adatto per esperimenti quotidiane. Per C. immagini elegans, i vantaggi di questa semplice impostazione sono almeno due pieghe: (i) in toto l'imaging è possibile senza rotazione e quindi la ricostruzione 3D è semplice; (Ii) il montaggio del campione è semplice e più embrioni può essere ripreso in sequenzasulla stessa diapositiva. Abbiamo mostrato alcuni esempi di filmati time-lapse con una risoluzione temporale sufficiente osservare le divisioni cellulari e variazioni di forma delle cellule. Il potere di microscopia foglio leggero per studiare C. sviluppo elegans è stato recentemente illustrato da altri 6, 7, 8. Pertanto, questa tecnica sarà molto utile per studiare la morfogenesi e patterning del C. elegans embrione.
Questo sistema può essere utilizzato anche per analizzare lo sviluppo di altri organismi modello? È importante riconoscere che l'attuazione del foglio illuminazione microscopia per organismo piccola e trasparente come C. elegans è meno severe che per gli organismi più grandi come embrioni di Drosophila. in toto l'imaging di Drosophila normalmente richiede la rotazione e multi-vista ricostruzioni 9, 10. eccitazione da due lati con lenti dell'obiettivo di eccitazione collineari possono anche ridurre gli effetti d'ombra causate dalla attenuatione della luce 11. Tuttavia, la configurazione qui presentata è ancora atto ad immagine un lato degli embrioni di Drosophila, con basso candeggio e bassa photoxicity. Questa configurazione potrebbe essere utile anche per immagini piccole e trasparenti embrioni come ascidie o zebrafish.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo tutti i membri del Lenne e laboratori Bertrand, in particolare, Olivier Blanc per lo sviluppo software e Jérémie Capoulade per la discussione. Ringraziamo anche la funzione di imaging PICsL-IBDM, in particolare Claude Moretti e Brice Detailleur per il supporto tecnico.
Questo lavoro è stato sostenuto da ATIP sovvenzioni dal CNRS (a P.-FL e VB), il Labex INFORM concessione (da P.-FL e VB) e una sovvenzione da Sanofi-Aventis (VB). Noi riconosciamo l'infrastruttura France-Bioimmagini sostenuto dalla Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-InSb-04-01, chiamiamo "Investissements d'Avenir").
SPIM | |||
Detection | |||
upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
Illumination | |||
LASER 488nm / 60mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 405nm / 120mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 561nm / 500mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
mirror | |||
lens 50mm | THORLABS | telescope 5X | |
lens 200mm | THORLABS | telescope 5X | |
periscope | THORLABS | RS99/M | |
cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
10X NA 0,3 | NIKON | ||
xyz stage | NEWPORT | ||
Sample | |||
Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
M9 medium: | |||
KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
MgSO4 (1mM final) | Any supplier | ||
cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
x stage | NEWPORT | ||
coverslip 50x20x1mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
Software | |||
C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview |