Denne protokollen beskriver oppsettet av en lys ark mikroskop og gjennomføringen for in vivo avbildning av C. elegans embryoer.
Raske og lave fototoksiske bildeteknikker er forutsetning for å studere utviklingen av organismer i toto. Lett bladet basert mikros reduserer foto-bleking og fototoksiske effekter i forhold til konfokalmikroskopi, samtidig som det gir 3D-bilder med subcellulære oppløsning. Her presenteres oppsettet av et lett bladet basert mikroskop, som består av en opprettstående mikroskop og et lite sett av opto-mekaniske elementer for generering av lys arket. Protokollen beskriver hvordan du kan bygge, justere mikroskop og karakter lyset arket. Videre detaljer det hvordan å implementere fremgangsmåten for in toto avbildning av C. elegans embryo ved hjelp av en enkel observasjon kammer. Metoden tillater fangst av 3D-to-farger time-lapse filmer over noen timer med utvikling. Dette bør lette sporing av celleform, celledelinger og kodede proteiner over lange tidsperioder.
Dannelsen og forming av en organisme som omfatter cellebevegelser, celle form endres, celledeling og celledifferensiering. Forstå progresjon og koordinering av disse prosessene krever raske tenkelig verktøy med tre dimensjoner evne og subcellulære oppløsning. Blant de teknikker med disse in vivo imaging evner i lys ark lys mikros også kalt enkelt / selektiv belysning plane mikroskopi har den unike fordelen av å produsere lave fototoksiske effekter og lav-photobleaching 1,2.
I arket belysning mikroskopi blir prøven belyses fra siden av en lys ark, som utfører den optiske snitting. Belysnings bane og påvisning banen er vinkelrett på hverandre og lyset arket er innrettet til å falle sammen med objektet fokalplanet for påvisning objektiv. Prøven blir plassert i skjæringspunktet mellom de to linjene, ennd kan beveges langs aksen for å tillate deteksjon 3D avbildning. Bare planet av interesse er tent og alle punktene i dette plan blir detektert på samme tid. Dette øker anskaffelseshastigheten og reduserer i tillegg fotobleking som fototoksisitet sammenlignet med konfokal mikroskopi 3..
Praktisk talt, er ark belysning mikros enkelt å sette opp og align: for todimensjonal avbildning, er nødvendig verken for påvisning del, og heller ikke for belysning del ingen scanning; som en bred-felt teknikk med seksjonering evne, kan tre-dimensjonale avbildning kan oppnås ved en enkelt akse bevegelse av fasen holde prøven.
Her presenterer vi opprettelsen av et enkelt lys ark mikroskop og gjennomføringen for i toto avbildning av C. elegans embryoer. C. elegans embryoer er godt egnet til å leve i vivo imaging på grunn av sin åpenhet, invariant avstamning og stereotyp celle posisjonerer 4,5. Den utviklede lette ark oppsettet er basert på en standard oppreist mikroskop for påvisning. Protokollen presenteres nedenfor viser hvordan du kan bygge og justere eksitasjon modul / sti, test og karakter lyset ark og montere prøven for 3D avbildning. Det gir også eksempler på time-lapse filmer ervervet med oppsettet på ulike stammer som uttrykker fluorescerende markører.
Denne protokollen beskriver en enkel installasjon av lys ark mikroskopi for in vivo avbildning av C. elegans embryoer. De optiske elementer som er nødvendige for å skape og justere lyset ark, inkludert lasere, bjelke ekspander, collimation og fokus linser, kan enkelt monteres på en optisk benk. I kombinasjon med en opprettstående mikroskop for påvisning banen og kameraet, gir dette en enkel løsning for å sette opp et lett ark mikroskop.
Denne geometrien gjør prøven miljø enkel. Den levende Prøven blir plassert i en glass kyvetten, som holdes, plasseres og beveges av et lite sett av mekaniske stykker. Som ark belysning mikroskopi er et bredt felt teknikk med seksjonering evne, er bare en enkelt akse motorisert bevegelse som kreves for 3D avbildning. Dette begrenser kravet om synkroniseringen til et enkelt scanning element og muliggjør utvikling av programvare. Sammenlignet med iSPIM seks vår oppreist GEOMETry tillater bruk av høy NA objektiv for deteksjon. Sammenlignet med SPIM oppsett med objektiv i horisontalplanet monteringen av prøven og bildebehandling av en serie av embryoer er lettere. Til sammen er gjennomføringen av denne teknikken grei og kan oppnås med liten kompetanse på optikk. Dette er et billigere alternativ til confocal mikroskop med fordelene ved en høyere hastighet og lavere fototoksisitet, men ulempen med en nedre aksial-oppløsning.
Vi har også utviklet en enkel og reproduserbar måte å montere C. elegans embryoer for in vivo avbildning ved hjelp av dette systemet. Monteringsfremgangsmåten er hurtig (15 min) og er egnet for vanlige eksperimenter. For C. elegans bildebehandling, fordelene ved dette enkle oppsettet er minst to-folder: (i) i toto bildebehandling er mulig uten rotasjon og dermed 3D rekonstruksjon er grei; (Ii) prøven montering er enkel og flere embryoer kan sekvensielt avbildespå samme lysbilde. Vi viste eksempler på filmer med tidsintervall med tilstrekkelig tidsmessig oppløsning til å observere celledelinger og celle form endringer. Kraften i lys ark mikroskop for å studere C. elegans utvikling har også nylig blitt vist av andre, 6, 7, 8.. Derfor vil denne metoden være svært nyttig å studere morfogenese og fordelingen av C. elegans embryo.
Kan dette systemet også anvendes til å analysere utviklingen av andre modellorganismer? Det er viktig å erkjenne at gjennomføringen av arket lys mikroskopi for små og gjennomsiktig organisme, for eksempel C. elegans er mindre strenge enn for større organismer som Drosophila embryoer. In toto avbildning av Drosophila krever normalt rotasjon og multi-view rekonstruksjoner 9, 10. Eksitasjon fra to sider med kollineære eksitasjon objektiv kan også redusert skyggeeffekter forårsaket av attenuation av lys 11. Likevel, er oppsettet presenteres her fortsatt tilpasset image ene siden av Drosophila embryoer, med lav bleking og lav photoxicity. Dette oppsettet kan også være nyttig å avbilde små og gjennomsiktige embryoer som sjøpung eller sebrafisk.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle medlemmer av Lenne og Bertrand laboratorier, særlig Olivier Blanc for programvareutvikling og Jérémie Capoulade for diskusjon. Vi takker også PICsL-IBDM bildebehandling anlegget, spesielt Claude Moretti og Brice Detailleur for teknisk support.
Dette arbeidet ble støttet av ATIP tilskudd fra CNRS (til P.-FL og VB), den LABEX INFORMERE stipend (til P.-FL og VB) og et stipend fra Sanofi-Aventis (til VB). Vi erkjenner France-Bioimaging infrastruktur støttes av Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-INSB-04-01, kaller "Investissements d'Avenir").
SPIM | |||
Detection | |||
upright microscope | ZEISS | Axiophot 1 | |
100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm) | NIKON | ||
EMCCD back illuminated | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
Illumination | |||
LASER 488nm / 60mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 405nm / 120mW | TOPTICA | iBeam smart | |
LASER 561nm / 500mW | COBOLT | JIVE 500 | for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough |
filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
Dichroic 405 | AHF | F38-405 | |
Dichroic 488 | SEMROCK | Di01-R488 | |
AOTF | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
mirror | |||
lens 50mm | THORLABS | telescope 5X | |
lens 200mm | THORLABS | telescope 5X | |
periscope | THORLABS | RS99/M | |
cylindrical lens f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
10X NA 0,3 | NIKON | ||
xyz stage | NEWPORT | ||
Sample | |||
Bacto Agar | Bectkton Dickinson | 214010 | 5% in water |
Poly-L-Lysine solution | Sigma | P8920 | |
Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L | Havard Appartus | 30-0019 | |
Aspiration tube (mouth pipette) | Dutsher | 55005 | |
M9 medium: | |||
KH2PO4 (3g/L) | Any supplier | ||
Na2HPO4 (6g/L) | Any supplier | ||
NaCL (5g/L) | Any supplier | ||
MgSO4 (1mM final) | Any supplier | ||
cuvette holder | HOME MADE | made by Brice Detailleur | |
sample holder | HOME MADE | made by Claude Moretti | |
x stage | NEWPORT | ||
coverslip 50x20x1mm | MARIENFELD | cut then in 10x20x1mm | |
piezo electric stage with amplifier/controller | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
cuvette 40mmx40mmx10mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
Diamond Point Glass Marking Pencil | VWR | ||
Software | |||
C++ (Qt) home made software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview |