Summary
Опишем вскрытие и Экс Vivo культуры мышиных эмбриональных кожи. Система культура содержит воздух-жидкость по всей поверхности ткани и позволяет изображений на инвертированный микроскоп. Меланобластов, составной частью развивающегося кожи, которые помечены флуоресцентно позволяя их поведение, которые должны соблюдаться с помощью конфокальной микроскопии.
Abstract
Меланобластов являются нервного гребня получены предшественники меланоцитов; клетки, ответственные за производство пигмента в коже и волосах. Меланобластов мигрируют через эпидермис зародыша, где они впоследствии колонизировать развития волосяных фолликулов 1,2. Нейронной миграции гребень клетка широко изучены в лабораторных, а в естественных условиях методов по-прежнему не очень хорошо развита, особенно в системах млекопитающих. Одним из вариантов является использование Экс Vivo органотипической культуры 3-6. Культура мышиных эмбриональных кожи требует поддержания воздушно-жидкостной интерфейса (ALI) по всей поверхности ткани 3,6. Высокое разрешение проживанию визуализации мышиных эмбриональных кожи был затруднен отсутствием хороший метод, который не только поддерживает этот ALI но и позволяет культура для получения обратной матрицы и поэтому совместим с коротким рабочим расстоянием объективов и наиболее конфокальной микроскопии. В этой статье описываются недавние улучшения в метод, который использует газ мембрану, чтобы преодолеть эти проблемы и позволяет с высоким разрешением конфокальной микроскопии эмбрионального кожи в Экс Vivo культуры 6. При использовании меланобластов конкретных Cre-рекомбиназы выражающее линию мыши в сочетании с репортером линии R26YFPR мы можем флюоресцентно маркировать население меланобластов в этих культурах кожи. Методика позволяет живой визуализации меланобластов и наблюдение за их поведением и взаимодействием с ткани, в которой они развиваются. Представитель результаты включены для демонстрации возможности жить-изображения 6 культур в параллель.
Introduction
Традиционно в зачаточном состоянии кожа была культивировали рассечением из эмбриона мыши и монтажа на поликарбонатной Nuclepore мембраны. Затем мембрану плавали на культуральной среде, тем самым сохраняя воздух-жидкость по всей поверхности ткани развивающегося 3,4. Этот метод был использован для анализа поведения меланобластов путем фиксации ткани и оценке меланобластов распределение с использованием β-галактозидазы в качестве маркера 7. Мы разработали метод, который позволяет жить-визуализация флуоресцентно меченных меланобластов в Экс Vivo культуры кожи 6. Здесь мы опишем метод в деталях от вскрытия, в установке, жить визуализации конфокальной и включают некоторые недавние улучшения.
Меланобласты являются эмбриональными предшественниками меланоцитов клетки, которые продуцируют пигмент в волосы и кожу. Меланобластов возникают в нервного гребня, прилегающей к нервной трубки около эмбриональный день 9 (E9) в развивающихся мыши еmbryo. Впоследствии они мигрируют вдоль дорсолатеральной пути между эктодермой и развивающихся сомитах. В E12.5 они двигаются от дермы в эпидермис, где они размножаются и продолжают их миграции. Первичный волосяной фолликул картина начинает формироваться в эпидермисе на E14.5 и E15.5 меланобластов которые локализации этих фолликулов. Для обзора развития меланоцит / меланоцитов см. Томас & Эриксон (2008) 1. Для того, чтобы маркировать население меланобластов мы объединили Тир :: CREB животных, которые выражают Cre-рекомбиназу, приводимый в действие мышь промотора тирозиназы 8 с R26YFPR животных, которые выражают желтый флуоресцентный белок (YFP) условно с Rosa26 локуса 9.
Мы опишем метод культуры эмбриональных кожи и захвата изображений с помощью перевернутой конфокальной микроскопии. Она приспособлена форма оригинальный метод описан в Морт и соавт. (2010) 6. Настоящийметод позволяет изображений в формате 6-луночный и удаляет зависимость от Nuclepore мембран и на Матригель для поддержки культуры. Вместо этого с помощью небольшого блока 1% агарозы, чтобы стабилизировать эмбриональных кожу. Снятие зависимость от матригеле особенно важно в ситуациях, когда реакция эмбриональной кожи к растворимых факторов роста находится в центре внимания исследования. Наш оригинальный метод уже использовался для получения новому взглянуть на развитие меланобластов 10-13, и мы ожидаем, что улучшения мы описываем здесь сделает его более мощным в качестве экспериментальной методики особенно там, где несколько параллельных культур является обязательным требованием.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные работа была выполнена в соответствии с ведомственным руководящим принципам по лицензии Британского МВД (проект номер лицензии PPL 60/3785 и 60/4424).
1. Подготовка
- Этикетка меланобластов в развивающихся кожи путем объединения соответствующего Cre-рекомбиназы выражающее линию мыши с флуоресцентным репортером мыши линии. Тир :: CREA, Тир :: CREB 8 и Wnt1 :: Cre 14 были успешно использованы в качестве Cre-выражающих линий и R26YFPR 9 в качестве репортерной линии.
- Подготовка питательной среды в ламинаре; дополнить Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с (1% об / об пенициллин / стрептомицин), 10% об / об сыворотки плода теленка и 0,584 г / л L-глутамина.
- Аппарат жить изображений изложена на рисунке 1 Стерилизовать изображений камеры базу путем протирки с 70% этанола. Стерилизовать вставки, визуализации клипы, и уплотнительные кольца путем замачивания О.В.ernight в 70% этаноле. С помощью стерильной крышкой из 6-луночный планшет в качестве крышке камеры.
- Нижняя поверхность изображения камеры состоит из увалень мембраны удерживается на месте с помощью уплотнительного кольца (рис. 1). Начните с 35-мм газопроницаемого увалень блюдо. Место блюдо на изображения камеры и вырезать газа мембрану с одной обоюдоострого лезвия бритвы. Нажмите уплотнительное кольцо над мембраной, чтобы закрепить ее на изображения камеры.
- В визуализации клипы (6 в общей сложности) зажать эмбриональных кожу в месте (рис. 1) перед использованием они должны быть заполнены с 1% агарозы. Подготовьте 2%-ный раствор агарозы стерильной дН 2 O в микроволновую печь и охлаждения до 60 ° C. Mix 1:01 с 10 мл культуральной среды (см. шаг 2), предварительно нагретую до 60 ° C Стенд клипы визуализации 6 в стерильную чашку 6-а. Накапайте 1% агарозном решение в центре каждого клипа, используя тонкую pastette и дайте ему остыть. Добавить 1 мл холодной стерильной PBS в каждую лунку для предотвращения Agarose от высыхания. Изображающего клипы могут быть сохранены в течение нескольких часов в PBS.
- Для проведения нежную разделение эмбриональных кожи и обрабатывать расчлененный ткани использовать «метод волосы палку ', как описано в Kashiwagi соавт. 3 Вместо использования палочку бамбука шашлык на шампуре можно использовать. Сделайте небольшой разрез в плоской конце вертеле с помощью одного краями лезвие и вставить мягкую зубную щетку щетиной. Обрежьте вертел так, чтобы она примерно в 15 см в длину.
- Используйте конфокальной микроскопии с полным климатическую камеру или поставить верхнюю камеру обеспечивает 5% CO 2 в воздухе. Prewarm столик микроскопа до 37 ° С в течение не менее 1 часа до визуализации. Это помогает предотвратить образец дрейф, вызванный расширением элементов стадии, поскольку они согреться.
- Подготовьте набор мульти-позиции с помощью программного обеспечения управления микроскопа, чтобы можно было быстро и легко концентрироваться на середине каждой культуры настроить эксперимент.
2. Порядок
- Mate мышей и назначить первый день после коитуса как день E0.5. В день E14.5, отбирать самку смещением шейных позвонков и выставить в полость тела, сделав небольшой срединный разрез, потянув за исключением кожу в сторону головой и хвостом, а затем резки основной брюшину и пилинг обратно в обе стороны от тела. Проанализируйте матку в холодную стерильной PBS, удерживая твердо пинцетом и отрезая по mesometrium используя хирургические ножницы. Держите матку на льду, пока не потребуется. Для более подробного описания см. Ши и др.. (2007) 15.
- Проанализируйте эмбрионов из матки сначала разрезанием длину стенки матки с хирургическими ножницами, чтобы освободить децидуальной а затем рассекает эмбрионов из децидуальной, потянув их на части с двумя парами тонких щипцов. Экран для флуоресцентного репортера выражении (при необходимости).
- Cull эмбрионов путем обезглавливания перед вскрытием. Подводные лодкиequently удалению хвоста и задних конечностей, а затем передние конечности с помощью одного краями лезвия бритвы. Сохраните ткани для генотипирования, если потребуется.
- Сделайте надрез в ventrum близко к средней линии в ростро-каудальном направлении. Использование волос палочки, описанной на стадии 1.6, тщательно задразнить далеко кожу от подлежащей соединительной ткани вращающегося эмбрион в то же время. Не снимайте кожу полностью, а оставить его прилагается вдоль брюшной стороны, наиболее удаленном от первого разреза.
- Важно не допустить, чтобы кожа стала облажался, как это потом очень трудно установить. Чтобы предотвратить это, расплющить кожу с помощью волос палочки (кожная стороной вверх) на поверхности сухой чашке Петри, а затем отрезать от эмбриона ствола с помощью одного краями лезвия бритвы. Кожный сторона можно отличить от эпидермального стороны путем тщательного наблюдения стыке между расчлененный ткани и эмбриона до кожи удаляется. Площадь расчлененного тканипримерно 0,5 мм 2 при вскрытии в E14.5 эмбриона.
- Поместите зажим изображений на верхней части кожи так, что агароза соприкасается с кожной стороной ткани. Дать постоять в течение 60 секунд, а затем тщательно дразнить края ткани до бокам клипа. Переверните клип и использовать волосы торчат выравниваться кожу и удалить пузырьки воздуха, заботясь, чтобы прикасаться к поверхности ткани (в области, которая будет изображена) как можно меньше.
- С помощью шелковой шовной нити связать кожу к клипу изображения с использованием двух простых большого пальца узлов по обе стороны от клипа изображений так, чтобы они затянуть и тянуть кожу в паз близко к верхней части зажима. Переверните клип, нажмите внутри вставки изображений и место в основе. Заполните вставку с ~ 5 мл культуральной среды (см. шаг 1.2). Рисунок 1 описывает сборку изображения камеры.
- Повторите протокол для остальных 5 образцов.
3. ЖитьИзображений
- Камера изображений имеет те же размеры, что и стандартной пластины 6-луночный. Используйте соответствующий пластины вставки смонтировать камеру на сцене конфокальной микроскопии.
- Автоматизированная этап необходим для образа культуры параллельно. Определите шесть позиций к изображению в конфокальной программного обеспечения. Точные параметры будут зависеть от возможностей используемого микроскопа. Обычно небольшое Z-Stack (3-5 Z-позиции к ответу на любой стадии дрейфа) используется в каждом из 6-положениях и Z-Stack захватывается каждые 2 мин в течение 18-24 часов. Для применений живого изображений как правило, предпочтительно использовать шире, чем оптически оптимальной настройки точечной уменьшить мощность лазера и количество Z-секции требуется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 2 показывает репрезентативные результаты от времени эксперимента покадровой используя эмбриональных кожу от Тира :: CREB х эмбрионов R26YFPR на E14.5. 6 эмбриональных культурах кожи были обследованы с помощью конфокального микроскопа каждые 2 мин в течение 18 часов. Бесплатное программное обеспечение для анализа изображений пакет ImageJ был использован для анализа поведение YFP-меченых меланобластов в 6 фильмах. В меланобласты были автоматически отслеживаются с помощью плагина wrMTrck разработанный Jesper Søndergaard Педерсен ( http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html ) результаты отслеживания отображаются на рисунке 2. Фильмы 1-3 являются представителями эксперимента и соответствуют панелей А и G. Они показывают проходящем свете YFP и составных видов соответственно. Миграции меланоцит населения чрезвычайно активным. Клетки двигаться почти постоянно и только приостановить, когда они собираются разделить на миtosis. Кроме того, можно наблюдать развитие первичного волосяного фолликула узором в течение периода культуры в проходящем свете канала (фиг. 3A-3X и Movie 1).
.. Рисунок 1 Оборудование и установки: жить изображений камера база состоит из четкого плексиглас жилья с одинаковыми внешними размерами до культуральной чашке 6-а. Он содержит шесть отверстий, в которых 6 индивидуальных сборок камерные может разъеме B. Каждый вкладыш состоит из 4 компонентов; клип изображений, вставка изображений, увалень мембрана, и уплотнительное кольцо. Клип и вставка которые обточенные из черного ацетил пластика, мы обнаружили, что это имеют самый низкий аутофлюоресценция из пластмасс мы тестировали. О-образное кольцо сделано из ПВХ апD используется для зажима увалень мембрану на нижней части вставки, образующей жидкую межфазную поверхность раздела воздух (ALI). Клип томография (черный ацетил) имеет несколько отверстий для циркуляции из культуральной среды C:. Центральный вал клипа наполнен 1% агарозы перед использованием, чтобы обеспечить твердую плоскую поверхность, на которой можно монтировать кожу. Кожа крепится к клипа с резьбой шва перед толкают в вставки, между которыми кожу между агарозы и увалень мембраны. Вставка затем заполняется культуральной среде D:. Препарировать и манипулировать эмбриональных кожу один зубная щетка щетина установлен в щели в плоском конце бамбуковой кебаб шампур. Пара волос палочки можно использовать в сочетании с тонким пинцетом рассекать эмбриональных кожу и смонтировать в камере формирования изображения E:.. Фотографии компонентов, описанных в переменного Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное рисунке.
Рисунок 2. Представитель результаты 6 фильмов, записанных параллельно. AF: Отслеживание результатов из 6 фильмов, записанных параллельно, чтобы продемонстрировать возможности системы. Каждый фильм был записан в 2-минутных временных точках в общей сложности 18 часов (см. Фильмы 1-3 для соответствующего фильма панелей А и G). Позиции клеток в кадре один фильма показаны и результаты отслеживания накладываются поверх GL. Сводка результатов отслеживания на графике как нулевую отметку отслеживания данных.
d/51352/51352fig3.jpg "/>
Рисунок 3 Представитель изображения из покадровой фильмов развития волосяного фолликула и одного меланобластов переживает митоза AX:.. Выбранный, обрезать кадры из фильма 1 Первичные фолликулы волос становятся видимыми в течение периода культуры кожи от 0-18 часов.. LUT был применен к изображениям A'-X. ': Выбранные, обрезать кадры из фильма 2 представительства образы меланобластов мигрирующих в развивающихся эпидермиса и отдельной клетки (см. стрелку в.') Переживает митоза (стрелка на Т ') . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фильм 1: представитель результат проходящего света канала от покадровой эксперимента 18-часовой. </ Сильный> первичный паттерн волос фолликул, хотя и не очевидно в начале фильма, становится более заметным по мере развития культуры.
Фильм 2: . Представитель результатом канала YFP из покадровой эксперимента 18-часовой Население меланоцит является очень динамичным и мигрирующего населения. Редкие стационарные клетки обычно проходят митоз (см. Рисунок 3).
Фильм 3: . представитель результатом композитного канала от покадровой эксперимент 18-часовой население меланоцит можно увидеть мигрировать в развивающихся эпидермиса и взаимодействовать с развивающихся волосяных фолликулов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы опишем метод для культуры эмбриональных кожи, которая особенностью поддаются визуализации жить-клеток на перевернутых конфокальной микроскопии. Способ включает в себя недавние улучшения, которые позволяют 6 культур для включения в образ параллельно и удаляет зависимость от матригеле и Nuclepore мембранах оригинального метода 6. Решающим техническое отличие от аналогичных методов является использование газопроницаемого увалень мембраны создать воздушный жидкость, а также выступать в качестве покровного стекла. Мы успешно поддерживается культур с непрерывным изображений конфокальной до 48 часов. Высокое разрешение и отличное соотношение сигнал-шум из конфокальных изображений позволяет отслеживания автоматизированная клеток для анализа меланобластов поведение в результате покадровой фильмов.
Используя эту технику, можно исследовать динамику меланобластов разгона и изучить их взаимодействие с эпидермисом и развивающихся волосяных фолликулов. Критическая улEPS в протоколе должны провести тщательное вскрытие, которое не повредить развивающимся эпидермис и монтировать Образцы кожи кожный сторону против агарозы без перегибов или участках. Процедура, описанная в этой статье работает лучше между E13.5 и E15.5. Перед E13.5 кожа очень хрупкие и после E15.5 это относительно толстый и жесткий, чтобы проникнуть с помощью конфокальной микроскопии. Возможности системы микроскопа, используемого также очень важны. Мы обычно используют Nikon A1R конфокальной микроскопии, оснащенный фирменной совершенной системы фокусировки Nikon, (PFS). Использование PFS значительно уменьшает количество плохих фильмов, вызванных стадии дрейфа, подобные системы доступны для других платформ.
Одним из недостатков этого метода является необходимость специального оборудования культуры. Однако дизайн прост и камера может быть легко собрана любого малого технического семинара. В итоге мы представляем простой метод, который должен быть широкого использования для Studieс эмбрионального развития кожи и меланобластов поведения. Предполагается, что технология может также быть изменены для других сценариев, в которых воздух-жидкость является необходимым условием для успешного культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке основного финансирования со стороны Совета по медицинским исследованиям. Мы благодарны Крейг Николь для подготовки технических чертежей. Мы благодарны Мэтью Пирсон и Павла Перри за их поддержку изображений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30 cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
References
- Thomas, A. J., Erickson, C. A. The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest. Pigment Cell & Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).
- Mayer, T. C. The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos. Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).
- Kashiwagi, M., Huh, N. Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis. Epidermal Cells: Methods and Protocols. Turksen, K. 289, Humana Press. 39-45 (2005).
- Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin. Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).
- Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies. Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).
- Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).
- Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles. Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).
- Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage. Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).
- Li, A., et al. Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod. Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).
- Li, A., et al. Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism. The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).
- Schachtner, H., et al. Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo. European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).
- Ma, Y., et al. Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation. Development. 140 (10), Cambridge, England. 2203-2211 (2013).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).
