Summary
हम माउस भ्रूण त्वचा के विच्छेदन और पूर्व vivo संस्कृति का वर्णन है. संस्कृति प्रणाली ऊतक सतह भर में एक हवा तरल इंटरफेस का कहना है और एक औंधा माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग की अनुमति देता है. Melanoblasts, विकासशील त्वचा के एक घटक, fluorescently उनके व्यवहार confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर देखा जा करने की अनुमति चिह्नित कर रहे हैं.
Abstract
Melanoblasts melanocytes के व्यापारियों व्युत्पन्न तंत्रिका शिखा कर रहे हैं; त्वचा और बालों में रंगद्रव्य उत्पादन के लिए जिम्मेदार कोशिकाओं. Melanoblasts वे बाद में विकासशील बाल 1,2 रोम उपनिवेश जहां भ्रूण की एपिडर्मिस के माध्यम से विस्थापित. तंत्रिका शिखा सेल प्रवास बड़े पैमाने पर इन विट्रो में अध्ययन किया जाता है लेकिन इन विवो तरीकों में अभी भी अच्छी तरह से विशेष रूप से स्तनधारी प्रणालियों में विकसित नहीं कर रहे हैं. एक विकल्प के पूर्व vivo organotypic संस्कृति 3-6 उपयोग करने के लिए है. माउस भ्रूण त्वचा की संस्कृति ऊतक 3,6 की सतह भर में एक हवा तरल इंटरफेस (अली) के रखरखाव की आवश्यकता है. माउस भ्रूण त्वचा के उच्च संकल्प रहते इमेजिंग इस अली का कहना है, लेकिन यह भी संस्कृति उल्टे और कम काम दूरी उद्देश्य लेंस और सबसे confocal सूक्ष्मदर्शी के साथ इसलिए संगत होना करने की अनुमति देता है कि न केवल एक अच्छे विधि के अभाव के कारण बाधा उत्पन्न किया गया. यह लेख एक meth के लिए हाल ही में सुधार का वर्णनआयुध डिपो है कि इन समस्याओं को दूर करने और पूर्व vivo संस्कृति 6 में भ्रूण त्वचा के उच्च संकल्प confocal इमेजिंग की अनुमति के लिए एक गैस पारगम्य झिल्ली का उपयोग करता है. एक melanoblast विशिष्ट Cre पर recombinase R26YFPR संवाददाता लाइन के साथ संयुक्त माउस लाइन व्यक्त उपयोग करके हम fluorescently इन त्वचा संस्कृतियों के भीतर melanoblast आबादी लेबल में सक्षम हैं. तकनीक की अनुमति देता है melanoblasts और उनके व्यवहार और वे जो विकास में ऊतक के साथ बातचीत के अवलोकन के रहते इमेजिंग. प्रतिनिधि परिणाम क्षमता को जीने की छवि समानांतर में 6 संस्कृतियों का प्रदर्शन करने के लिए शामिल किए गए हैं.
Introduction
परंपरागत रूप से भ्रूण त्वचा माउस भ्रूण से विदारक और एक polycarbonate Nuclepore झिल्ली पर बढ़ते द्वारा संवर्धित किया गया है. झिल्ली फिर इस प्रकार के विकास ऊतक 3,4 की सतह भर में एक हवा तरल इंटरफेस को बनाए रखने, संस्कृति माध्यम पर जारी है. इस तकनीक ऊतक फिक्सिंग और एक मार्कर के रूप में 7 β-galactosidase का उपयोग melanoblast वितरण का आकलन करने से melanoblast व्यवहार परख करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हम पूर्व vivo त्वचा संस्कृति 6 में रहते इमेजिंग के fluorescently लेबल melanoblasts अनुमति देता है एक विधि विकसित की है. यहाँ हम confocal इमेजिंग जीने के लिए, सेटअप करने के लिए, विच्छेदन से विस्तार में विधि का वर्णन है और हाल ही में कुछ सुधार शामिल हैं.
Melanoblasts melanocytes के भ्रूण व्यापारियों, बाल और त्वचा में रंगद्रव्य उत्पादन कि कोशिकाओं रहे हैं. Melanoblasts विकासशील माउस ई में भ्रूण दिन 9 (E9) के आसपास में न्यूरल ट्यूब से सटे तंत्रिका शिखा में उठताmbryo. इसके बाद वे बाह्य त्वक स्तर और विकासशील somites के बीच एक dorsolateral मार्ग के साथ विस्थापित. E12.5 में वे पैदा करना और उनके प्रवास के लिए जारी जहां एपिडर्मिस को डर्मिस से चलते हैं. प्राथमिक बाल कूप पैटर्न इन रोम को स्थानीयकृत रहे E14.5 पर epidermis में और E15.5 melanoblasts से आकार लेती है. Melanoblast / मेलानोसाईट विकास की समीक्षा के लिए थॉमस और एरिक्सन (2008) 1 देखें. Melanoblast आबादी लेबल करने के क्रम में हम Tyr संयुक्त है :: सशर्त ROSA26 ठिकाना 9 से पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) व्यक्त कि R26YFPR जानवरों के साथ माउस tyrosinase प्रमोटर 8 से प्रेरित Cre पर recombinase व्यक्त कि CREB जानवरों.
हम एक औंधा confocal खुर्दबीन का उपयोग संस्कृति भ्रूण त्वचा और छवियों पर कब्जा करने के लिए एक विधि का वर्णन. यह रंडी एट अल में वर्णित मूल विधि. (2010) 6 प्रपत्र अनुकूलित है. वर्तमानविधि 6 अच्छी तरह प्रारूप में इमेजिंग की अनुमति देता है और संस्कृति का समर्थन करने के Nuclepore झिल्ली पर और Matrigel पर निर्भरता को हटा. इसके बजाय भ्रूण त्वचा को स्थिर करने के लिए 1% agarose की एक छोटी सी ब्लॉक का उपयोग. Matrigel पर निर्भरता को हटा रहा है, विशेष रूप से घुलनशील वृद्धि कारकों को भ्रूण त्वचा की प्रतिक्रिया का अध्ययन का ध्यान केंद्रित है, जहां स्थितियों में महत्वपूर्ण है. हमारी मूल विधि पहले से ही melanoblast विकास 10-13 में नए अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और हम हम यहाँ वर्णन सुधार एकाधिक समानांतर संस्कृतियों एक आवश्यकता है, विशेष रूप से जहां एक प्रयोगात्मक तकनीक के रूप में इसे और अधिक शक्तिशाली बनाने करेंगे.
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Protocol
सभी जानवर काम ब्रिटेन के गृह कार्यालय (परियोजना लाइसेंस नंबर पीपीएल 60/3785 और 60/4424) से लाइसेंस के तहत संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया था.
1. तैयारी
- एक फ्लोरोसेंट संवाददाता माउस लाइन के साथ एक उपयुक्त Cre पर recombinase व्यक्त माउस लाइन संयोजन से विकासशील त्वचा में melanoblasts लेबल. Tyr :: बनाने की प्रक्रिया, Tyr :: CREB 8 और Wnt1 :: Cre 14 Cre व्यक्त लाइनों के रूप में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है R26YFPR 9 एक संवाददाता पंक्ति के रूप में.
- एक लामिना का प्रवाह हुड में संस्कृति के माध्यम तैयार; (1% v / वी पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के पूरक, 10% v / वी भ्रूण बछड़ा सीरम और 0.584 ग्राम / एल एल glutamine.
- लाइव इमेजिंग उपकरण 70% इथेनॉल के साथ नीचे पोंछते द्वारा इमेजिंग चैम्बर आधार जीवाणुरहित चित्रा 1 में उल्लिखित है. ओवर्स भिगोने द्वारा सम्मिलित करता है, इमेजिंग क्लिप, और O-अंगूठी जीवाणुरहित70% इथेनॉल में ernight. चैम्बर के ढक्कन के रूप में 6 अच्छी तरह से थाली से एक बाँझ ढक्कन का प्रयोग करें.
- इमेजिंग कक्ष के नीचे सतह एक O-अंगूठी (चित्रा 1) द्वारा जगह में आयोजित एक मूढ़ झिल्ली के होते हैं. एक 35 मिमी गैस पारगम्य मूढ़ पकवान के साथ शुरू करो. इमेजिंग चैम्बर से अधिक पकवान प्लेस और एक एकल धार धार के साथ गैस पारगम्य झिल्ली बाहर काटा. इमेजिंग चैम्बर के लिए यह सुरक्षित करने के लिए झिल्ली से अधिक O-अंगूठी पुश.
- इमेजिंग क्लिप्स (कुल 6) जगह में भ्रूण त्वचा उपयोग करने से पहले वे 1% agarose के साथ भरा होना चाहिए (चित्रा 1) दबाना. सी. microwaving और 60 डिग्री तक ठंडा करके बाँझ DH 2 हे के साथ agarose की एक 2% समाधान तैयार 10 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से मिक्स 01:01 (चरण 2 देखें) 60 डिग्री सेल्सियस तक preheated एक बाँझ 6 अच्छी तरह से थाली में 6 इमेजिंग क्लिप खड़े हो जाओ. एक ठीक pastette का उपयोग कर एक क्लिप के केन्द्र में 1% agarose समाधान ड्रिप और शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. एक को रोकने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 1 एमएल ठंड बाँझ पीबीएस जोड़ेंबाहर सुखाने से garose. इमेजिंग क्लिप्स पीबीएस में कई घंटे के लिए भंडारित किया जा सकता है.
- भ्रूण त्वचा की नाजुक जुदाई बाहर ले जाने के लिए और इसके बजाय एक बांस कबाब की कटार इस्तेमाल किया जा सकता है एक chopstick का उपयोग करने का Kashiwagi एट अल. 3 में वर्णित के रूप में विच्छेदित ऊतक 'बाल छड़ी पद्धति' का उपयोग संभाल करने के लिए. एक एकल धार धार का उपयोग कटार के फ्लैट अंत में एक छोटे टुकड़े टुकड़े करने और बाल खड़े एक नरम टूथब्रश डालें. यह लंबाई में लगभग 15 सेमी है कि इतनी कटार ट्रिम.
- एक पूर्ण पर्यावरण कक्ष के साथ एक confocal खुर्दबीन का प्रयोग करें या हवा में 5% सीओ 2 को उपलब्ध कराने के शीर्ष चैम्बर मंच. इमेजिंग के लिए पहले कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक खुर्दबीन मंच Prewarm. यह वे गर्म अप के रूप में मंच घटकों के विस्तार की वजह से नमूना बहाव को रोकने में मदद करता है.
- एक जल्दी और आसानी से एक experimen स्थापित करने के लिए प्रत्येक संस्कृति के बीच केंद्र पर कर सकते हैं ताकि माइक्रोस्कोप का नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक बहु स्थिति सेट तैयारटी.
2. प्रक्रिया
- चूहों दोस्त और दिन E0.5 के रूप में पहले दिन डाक coitum नामित. दिन E14.5 में, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से महिला चुनना और एक छोटे से midline चीरा सिर और पूंछ की ओर त्वचा अलग खींच और फिर अंतर्निहित पेरिटोनियम काटने और वापस शरीर के दोनों ओर से pealing द्वारा शरीर गुहा का पर्दाफाश. संदंश के साथ मजबूती से पकड़े और शल्य कैंची का उपयोग mesometrium साथ snipping द्वारा ठंड बाँझ पीबीएस में गर्भाशय काटना. जब तक आवश्यक बर्फ पर गर्भाशय रखें. एक विस्तृत वर्णन के लिए एक प्रकार का वृक्ष एट अल. (2007) 15 देखें.
- पहले ठीक संदंश के दो जोड़े के साथ उन्हें अलग खींच द्वारा पतनिका जारी करने के लिए शल्य कैंची के साथ गर्भाशय की दीवार की लंबाई में कटौती और फिर पतनिका से भ्रूण विदारक द्वारा गर्भाशय से भ्रूण काटना. फ्लोरोसेंट संवाददाता अभिव्यक्ति (यदि आवश्यक हो) के लिए स्क्रीन.
- विच्छेदन के लिए पहले कत्ल के द्वारा भ्रूण चुनना. उप सैंडविचequently पूंछ हटाने और एक एकल धार धार का उपयोग अंग और फिर forelimbs हिन्द. यदि आवश्यक जीनोटाइपिंग के लिए ऊतक को बनाये रखें.
- एक rostro दुम दिशा में midline के करीब ventrum में एक चीरा. कदम 1.6 में वर्णित बाल छड़ें प्रयोग, ध्यान से एक ही समय में भ्रूण घूर्णन अंतर्निहित संयोजी ऊतक से त्वचा दूर तंग. पूरी तरह से त्वचा को हटाने बल्कि पहले चीरा से उदर किनारे से दूर का साथ संलग्न मत छोड़ो.
- यह तो माउंट करने के लिए बहुत मुश्किल है के रूप में बन त्वचा बँधा नहीं जाने के लिए महत्वपूर्ण है. इसे रोकने के लिए एक सूखी पेट्री डिश की सतह पर बाल चिपक (त्वचीय ऊपर की ओर) का उपयोग त्वचा समतल और फिर एक एकल धार धार का उपयोग दूर भ्रूण ट्रंक से कटौती करने के लिए. त्वचा निकाल दिया जाता है पहले चमड़े का पक्ष विच्छेदित ऊतक और भ्रूण के बीच जंक्शन से सावधान अवलोकन द्वारा एपिडर्मल ओर से प्रतिष्ठित किया जा सकता. विच्छेदित ऊतक का क्षेत्र हैलगभग 0.5 मिमी 2 एक E14.5 भ्रूण विदारक है.
- Agarose ऊतक की त्वचीय पक्ष को छू रहा है, ताकि त्वचा के शीर्ष पर एक इमेजिंग क्लिप रखें. क्लिप के पक्षों को ऊतक के किनारों तंग ध्यान से तो 60 सेकंड के लिए खड़े करने की अनुमति. क्लिप पलटना और बाल त्वचा समतल और संभव के रूप में छोटे रूप में (imaged किया जाएगा कि क्षेत्र में) ऊतक की सतह को छूने की देखभाल कर रही है, किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए लाठी का उपयोग करें.
- वे कसने इतना है कि इमेजिंग क्लिप के दोनों तरफ दो सरल अंगूठे समुद्री मील का उपयोग इमेजिंग क्लिप को त्वचा टाई और क्लिप के शीर्ष के निकट नाली में त्वचा को खींचने के लिए रेशम सीवन धागे का प्रयोग करें. क्लिप पलटना, इमेजिंग डालने और बेस में जगह अंदर धक्का. (1.2 चरण देखें) संस्कृति के माध्यम से ~ 5 मिलीलीटर के साथ सम्मिलित भरें. चित्रा 1 इमेजिंग चैम्बर के विधानसभा रूपरेखा.
- शेष 5 नमूने लिए प्रोटोकॉल दोहराएँ.
3. जीतेइमेजिंग
- इमेजिंग चैम्बर एक मानक 6 अच्छी तरह से थाली के रूप में एक ही आयाम है. Confocal खुर्दबीन के मंच पर चैम्बर माउंट करने के लिए एक उपयुक्त थाली डालने का प्रयोग करें.
- एक स्वचालित चरण में समानांतर संस्कृतियों छवि के लिए आवश्यक है. Confocal सॉफ्टवेयर में छवि को छह पदों को परिभाषित करें. सटीक सेटिंग्स उपयोग माइक्रोस्कोप की क्षमता पर निर्भर करेगा. आमतौर पर एक छोटे z ढेर (3-5 Z-पदों किसी भी स्तर बहाव के लिए खाते में) 6 पदों में से प्रत्येक में प्रयोग किया जाता है और एक z ढेर 18-24 घंटे के लिए हर 2 मिनट पर कब्जा कर लिया है. लाइव इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए यह लेजर शक्ति और करने के लिए z-वर्गों की संख्या को कम करने के लिए ऑप्टिकली इष्टतम पिनहोल सेटिंग से एक व्यापक उपयोग करने के लिए आम तौर पर फायदेमंद है.
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Representative Results
चित्रा 2 Tyr से भ्रूण त्वचा का उपयोग कर एक समय व्यतीत हो जाने के प्रयोग से प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है :: CREB E14.5 पर R26YFPR भ्रूण एक्स. 6 भ्रूण त्वचा संस्कृतियों 18 घंटे के लिए हर 2 मिनट confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged थे. फ्रीवेयर छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज ImageJ 6 फिल्मों में YFP लेबल melanoblasts के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. melanoblasts स्वतः (जेस्पर Søndergaard Pedersen द्वारा विकसित wrMTrck प्लगइन का उपयोग करके ट्रैक किए गए थे http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html 1-3 प्रयोग के प्रतिनिधि हैं. सिनेमा) ट्रैकिंग परिणाम चित्रा 2 में प्रदर्शित कर रहे हैं और पैनल ए के अनुरूप और जी वे क्रमशः प्रेषित प्रकाश, YFP और समग्र दृश्य दिखा. पलायन melanoblast आबादी असाधारण रूप से सक्रिय है. कोशिकाओं लगभग लगातार कदम है और वे मील से विभाजित करने के बारे में हैं, जब केवल थामनेtosis. यह प्रेषित प्रकाश चैनल (3a आंकड़े 3X और मूवी 1) में संस्कृति की अवधि में प्राथमिक बाल कूप पैटर्न के विकास का निरीक्षण करने के लिए भी संभव है.
.. चित्रा 1 उपकरण और सेटअप एक: लाइव इमेजिंग चैम्बर आधार 6 अच्छी तरह से संस्कृति डिश के लिए समान बाहर आयामों के साथ एक स्पष्ट कड़ा आवास के होते हैं. . यह 6 व्यक्ति चैम्बर विधानसभाओं सकते हैं स्लॉट जिसमें छह छेद बी होता है: प्रत्येक डालने 4 घटकों के होते हैं; एक इमेजिंग क्लिप, एक इमेजिंग डालने, एक मूढ़ झिल्ली, और एक O-अंगूठी. क्लिप और डालने काला एसिटाइल प्लास्टिक से lathed कर रहे हैं, हम इस हम परीक्षण प्लास्टिक की सबसे कम autofluorescence है पाया. O-अंगूठी पीवीसी एक से बना हैडी हवा तरल इंटरफेस (अली) के गठन डालने के तल पर मूढ़ झिल्ली शिकंजा कसने के लिए प्रयोग किया जाता है. इमेजिंग क्लिप (काली एसिटाइल) की अनुमति देने के लिए कई छेद है संस्कृति मध्यम सी के संचलन:. क्लिप की केंद्रीय शाफ्ट त्वचा माउंट करने के लिए, जिस पर एक फर्म फ्लैट सतह प्रदान करने के लिए उपयोग करने से पहले 1% agarose से भर जाता है. त्वचा agarose और मूढ़ झिल्ली के बीच त्वचा sandwiching, डालने में धकेल दिया जा रहा से पहले सिवनी धागे के साथ क्लिप से जुड़ा हुआ है. सम्मिलित फिर संस्कृति के माध्यम से भर जाता है: डी. एक एकल टूथ ब्रश एक बांस कबाब की कटार के फ्लैट अंत में एक भट्ठा में मुहिम शुरू की है बाल खड़े भ्रूण त्वचा काटना और हेरफेर. बाल छड़ें की एक जोड़ी भ्रूण त्वचा काटना और इमेजिंग कक्ष में माउंट करने के लिए ठीक संदंश के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है ई:.. एसी में विस्तृत घटकों के फोटो पर क्लिक करें यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.
चित्रा 2. समानांतर में दर्ज की 6 फिल्मों के प्रतिनिधि परिणाम. वायुसेना: प्रणाली की क्षमताओं का प्रदर्शन करने के लिए समानांतर में दर्ज की 6 फिल्मों से ट्रैकिंग परिणाम. प्रत्येक फिल्म (इसी पैनल ए की फिल्म और जी के लिए सिनेमा 1-3 देखें) 18 घंटे की कुल के लिए 2 मिनट का समय अंक पर दर्ज किया गया था. फिल्म का एक फ्रेम में कोशिकाओं के पदों पर दिखाया जाता है और ट्रैकिंग के परिणाम शीर्ष पर आरोपित कर रहे हैं जीएल:. डेटा ट्रैकिंग चुना के रूप में ट्रैकिंग के परिणाम के सारांश साजिश रची.
d/51352/51352fig3.jpg "/>
चित्रा 3 कुल्हाड़ी बाल कूप विकास की और एक melanoblast के दौर से गुजर पिंजरे का बँटवारा के समय चूक फिल्मों से छवियों प्रतिनिधि:.. चयनित, मूवी 1 से फ्रेम फसली प्राथमिक बालों के रोम 0-18 घंटे से त्वचा संस्कृति की अवधि में दिखाई देने लगते हैं.. एक LUT छवियों के लिए लागू किया गया था A'एक्स. ': चयनित, मूवी 2 से फ्रेम फसली विकासशील epidermis और एक व्यक्ति के सेल में पलायन melanoblasts के प्रतिनिधि छवियों (ए में तीर देखते हैं.' ('टी में तीर) के दौर से गुजर पिंजरे का बँटवारा) . इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
मूवी 1: एक 18 घंटा समय व्यतीत प्रयोग से प्रेषित प्रकाश चैनल के प्रतिनिधि परिणाम. <संस्कृति की प्रगति के रूप में, फिल्म के शुरू में स्पष्ट नहीं अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है, हालांकि, प्राथमिक बाल कूप पैटर्न> / मजबूत.
मूवी 2: . एक 18 घंटा समय व्यतीत प्रयोग से YFP चैनल के प्रतिनिधि परिणाम melanoblast आबादी एक अत्यधिक गतिशील और प्रवासी आबादी है. दुर्लभ स्थिर कोशिकाओं आमतौर पर (चित्रा 3 देखें) पिंजरे का बँटवारा के दौर से गुजर रहे हैं.
मूवी 3: . एक 18 घंटा समय व्यतीत प्रयोग से समग्र चैनल के प्रतिनिधि परिणाम melanoblast आबादी विकासशील एपिडर्मिस के भीतर विस्थापित और विकासशील बालों के रोम के साथ बातचीत करने के लिए देखा जा सकता है.
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Discussion
हम उल्टे confocal सूक्ष्मदर्शी पर करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग उत्तरदायी ख़ासियत है कि संस्कृति भ्रूण त्वचा के लिए एक विधि का वर्णन. विधि 6 संस्कृतियों समानांतर में imaged और Matrigel और मूल विधि 6 की Nuclepore झिल्ली पर निर्भरता को हटा करने की अनुमति दे कि हाल ही में सुधार भी शामिल है. इसी तरह की तकनीक से महत्वपूर्ण तकनीकी अंतर एक हवा तरल इंटरफेस स्थापित करने के लिए और भी एक coverslip के रूप में कार्य करने के लिए एक गैस पारगम्य मूढ़ झिल्ली का इस्तेमाल होता है. हम सफलतापूर्वक के लिए 48 घंटे के लिए निरंतर confocal इमेजिंग के साथ संस्कृतियों को बनाए रखा है. confocal छवियों के शोर अनुपात करने के लिए उच्च संकल्प और उत्कृष्ट संकेत स्वचालित सेल ट्रैकिंग जिसके परिणामस्वरूप समय चूक फिल्मों में melanoblast व्यवहार का विश्लेषण करने की अनुमति देता है.
इस तकनीक का उपयोग यह melanoblast प्रसार की गतिशीलता की जांच और epidermis और विकासशील बालों के रोम के साथ उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए संभव है. महत्वपूर्ण सेंटप्रोटोकॉल में ईपीएस विकासशील एपिडर्मिस नुकसान नहीं करता है और सनक या फैला बिना agarose के खिलाफ त्वचा के नमूनों त्वचीय ओर माउंट करने के लिए कि एक सावधान विच्छेदन बाहर ले जाने के लिए कर रहे हैं. इस पत्र में वर्णित प्रक्रिया E13.5 और E15.5 के बीच सबसे अच्छा काम करता है. E13.5 से पहले त्वचा बहुत नाजुक है और E15.5 के बाद यह confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा घुसना अपेक्षाकृत मोटी और मुश्किल है. इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप प्रणाली की क्षमताओं को भी बहुत महत्वपूर्ण हैं. हम आम तौर पर Nikon है मालिकाना सही फोकस प्रणाली (PFS) के साथ सुसज्जित एक Nikon A1R confocal खुर्दबीन का उपयोग करें. PFS का प्रयोग बहुत चरण बहाव की वजह से खराब फिल्मों की संख्या कम कर देता है, इसी तरह की प्रणाली अन्य प्लेटफार्मों के लिए उपलब्ध हैं.
इस तकनीक का एक नुकसान यह विशेष संस्कृति के लिए उपकरणों की आवश्यकता है. हालांकि डिजाइन सरल है और चैम्बर आसानी से किसी भी छोटे तकनीकी कार्यशाला द्वारा इकट्ठा किया जा सकता है. संक्षेप में हम पढ़ाई के लिए व्यापक उपयोग के लिए किया जाना चाहिए कि एक सरल विधि प्रस्तुतभ्रूण त्वचा विकास और melanoblast व्यवहार की है. यह तकनीक भी एक हवा तरल इंटरफेस सफल संस्कृति के लिए एक आवश्यकता है, जहां अन्य परिदृश्यों के लिए संशोधित किया जा सकता है कि अनुमान है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
काम चिकित्सा अनुसंधान परिषद से मूल धन से समर्थन किया था. हम तकनीकी चित्र तैयार करने के लिए क्रेग निकोल के लिए आभारी हैं. हम उनके इमेजिंग समर्थन के लिए मैथ्यू पियर्सन और पॉल पेरी के लिए आभारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30 cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
References
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