Transcript og Metabolit Profilering for Vurdering af tobak Tree og Poppel som råvare til Bio-industri

Summary

Plantebiomasse tilbyder en vedvarende ressource for flere produkter, herunder brændstof, foder, fødevarer og en række forskellige materialer. I dette papir undersøger vi egenskaberne af tobak træ (Nicotiana glauca) og poppel som egnede kilder for et bioraffinaderi pipeline.

Abstract

Den globale efterspørgsel efter fødevarer, foder, energi og vand udgør ekstraordinære udfordringer for fremtidige generationer. Det er indlysende, at robuste platforme for udforskning af vedvarende ressourcer er nødvendige for at overvinde disse udfordringer. Inden for de multinationale rammer MultiBioPro vi er ved at udvikle bioraffinaderi rørledninger for at maksimere brugen af ​​plantebiomasse. Mere specifikt bruger vi poppel og tobak træet (Nicotiana glauca) som target afgrødearter til forbedring saccharification, isoprenoid, indhold lange kæde kulbrinte, fiber kvalitet og suberin og lignin indhold. De metoder, der anvendes til at opnå disse effekter omfatter GC-MS, LC-MS og RNA sekventering platforme. Metabolitten rørledninger er veletablerede værktøjer til at generere disse typer af data, men også have de begrænsninger, idet kun godt karakteriserede metabolitter kan anvendes. Den dybe sekventering vil give os mulighed til at omfatte alle udskrifter til stede under de udviklingsmæssige stadier af tobak træ blad, men hat blive kortlagt tilbage til sekvensen af Nicotiana tabacum. Med disse set-ups, vi sigter mod en grundlæggende forståelse for de underliggende processer og skabe en industriel ramme for at udnytte resultaterne. I et mere langsigtet perspektiv, mener vi, at data, der genereres her, vil give midler til en bæredygtig bioraffinaderi proces ved hjælp af poppel og tobak træ som råmateriale. Til dato det basale niveau af metabolitter i prøverne er blevet analyseret og de anvendte protokoller er fastsat i denne artikel.

Introduction

Befolkning og økonomisk vækst har forårsaget en stigende efterspørgsel efter mad, vand og brændstof. En stor del af disse leverancer der fremstilles, forarbejdes og transporteres ved hjælp af finite fossilt baserede midler, såsom petroleum. Det er imidlertid klart, at denne praksis ikke er holdbar, og udvikling af alternative midler vil derfor være af stor betydning ^1. Mange vedvarende ressourcer er i varierende grad, i øjeblikket udnyttet, herunder vind, vand bevægelse, sol, geotermisk varme, og bølge baserede energikilder. En anden bæredygtig og stort set uudnyttet ressource er biomasse fra planter. Denne ressource tilbyder også en meget omkostningseffektiv måde at konvertere solenergi afledt energi til brændstof ^2. Bortset fra at levere biobaseret brændstof plantebiomassen tilbyder også unikke muligheder for alternative produkter, herunder plast, rengøringsmidler og værdifulde kemikalier.

Plante cellevæg Den, som i vid udstrækning består af sukker polymerer, MAKes op hovedmassen af ​​anlæggets biomasse og mange kræfter i øjeblikket investeret i en effektiv omdannelse til bioethanol. Den resterende biomasse kan efterfølgende forarbejdes til biogas og olierelaterede produkter ^3. Meget af den flerårige plantearter, herunder græs og træer, der producerer store mængder af cellulosebaseret biomasse typisk vokser bedst i de tempererede zoner. Men omkring 20% af landarealet er halvtørre og er derfor også udsat for tørke ^4. Det vil naturligvis være af interesse for også dyrke disse golde landskab med planter, der effektivt kan bidrage til en bæredygtig produktion af energi og materiale. Disse planter har brug for at have en optimal vandforbrug effektivitet og tørke modstand og ville omfatte tobak træet (Nicotiana glauca) og arter fra Agave-slægten.

Den MultiBioPro Konsortiet har til formål at gennemføre en integreret bioraffinaderi rørledning, ved hjælp af to vigtige crop arter, poppel og tobak træ. Poppel er dukket op som en lovende biobrændstof afgrøde, da det hurtigt vokser, let klonalt formeres og meget tilpasningsdygtige til en bred vifte af klima-og jordbundsforhold. Det giver også en bred vifte af træ, fiber, brænde og andre skovprodukter ^5. Tobakken træet er også dukket op som et egnet anlæg til biobrændsel og bioraffinaderi formål. Det producerer typisk betydelige mængder biomasse, indeholder store mængder af ikke-strukturelle kulhydrater ^6, og har også den sjældne evne til at akkumulere store mængder af let ekstraherbare ikke-spiselige olier (herunder lang kæde C _{29-C 31} mættede kulbrinter og triterpenoids), der er egnet til biodiesel produktion. Tobakken træ er i øvrigt gøres til genstand for genetisk forbedring, har høj spiring kapacitet, og vokser lykkeligt på halvtørre jorder, der ikke anvendes til fødevareproduktion. Det fremgår således, at både poppel og tobak træ har iboende potentiale for multipFORMÅLET afgrøder, dvs som nye høj værdi råmaterialer til en integrativ biobaseret industri. I dette papir har vi fokus på varieret sæt metoder til at skelne, hvordan tobak træ indskud langkædede kulbrinter.

I et forsøg på at identificere den underliggende molekylære maskineri er ansvarlig for produktion og udskillelse af de mættede langkædede kulbrinter for tobaksblade, anvender vi moderne "omik" baserede teknologier. Dette omfatter RNA seq af en udviklingsmæssig blad serie (ti etaper), og multiplatform metabolit profilering tilgange ved hjælp af LC-og GC-MS (for polære og ikke-polære metabolitter og lipidomics). Disse data vil blive brugt til at udvinde for genekspression, der korrelerer med, eller går forud, indtræden af ​​biosyntese af molekylerne, der er angivet ovenfor. Gener og stier, der vises lovende fra disse bestræbelser vil blive anvendt til funktionel test i modellen arter Arabidopsis og i sidste ende kan være modtagelig til bioteknologisk teknik i TOBacco træ.

Protocol

1.. Plant Material

Grow Nicotiana glauca planter i 30 potter cm diameter indeholdende M2 professionelle vækstmedium. Dyrke planter i væksthus med en dagtemperatur på 20-25 ° C og natlig temperatur på 15 ° C. Brug en 16 timers lys og 8 timers mørke cyklus som supplerende lys regime.

2.. Prøveforberedelse

1. For primære metabolitter:
   1. Harvest plantematerialer (blade og stilke af N. glauca) og fryse materiale straks.
   2. Lyofilisere frosne plantematerialer ved frysetørring i tre dage.
   3. Grind frysetørrede prøver ved mixer mølle med metalkugler.
   4. Alikvot finmalet tørre materialer i en 2 ml centrifugeglas eller hætteglas.
2. For sekundære metabolitter:
   1. Harvest plantevæv og fryse materiale straks.
   2. Grind frosne plantevæv ved mixer mølle med rustfri stålkugle eller morter og pistil.
   3. Alikvote finmalet væv i 2 ml-centrifugerør (ca. 20 mg vådvægt).

3.. Extraction Protokol for Metabolite Profilering for primære metabolitter ved GC-MS

1. Alikvot jorden tør plantemateriale (10 mg af blade og 20 mg stamceller materialer) i 2 ml, skruelåg, rund bund rør.
2. Læg 1.400 pi 100% methanol og vortex i 10 sek.
3. Tilføj 60 pi Ribitol (0,2 mg / ml lager i H ₂ O), som en intern kvantitativ standard og vortex i 10 sek.
4. Tilføj kugle en rustfri (zirconia eller) og homogeniseres materiale med en Mixer Mill i 2 minutter ved 25 Hz.
5. Centrifuger blandingen i 10 min ved 11.000 x g..
6. Supernatanten overføres til et hætteglas.
7. Tilføj 750 pi chloroform.
8. Tilføj 1.500 pi _H2O og vortex blandingen i 10 sek.
9. Overfør 150 ul fraøvre fase (polære fase) i et frisk 1,5 ml centrifugerør.
10. Tørre prøver med en hastighed vac. Det er bydende nødvendigt, at prøverne er reduceret til tørhed for mellem 3 og 24 timer, indtil der ikke resterende væske er til stede.
11. Tilsæt 40 ​​ul af methoxyaminhydrochlorid (20 mg / ml i pyridin).
12. Ryst blandingen i en vandret varmeblok shaker i 2 timer ved 37 ° C.
13. Tilføj 70 pi N-methyl-N - (trimethylsilyl)-trifluoracetamid MSTFA mix.
14. Ryst blandingen i 2 timer ved 37 ° C.
15. Spin ned dråber på låget med en kort centrifugering ~ 1 minut ved 11.000 x g..
16. Væsken overføres i hætteglas egnet til GC-MS-analyse.

4.. Udtræk til Metabolite Profilering for sekundære metabolitter af LC-MS

1. Tilsæt 500 pi methanol til den frosne jord prøver.
2. Ryst med Thermomixer i 15 minutter ved 70 ° C (1.000 sek ^-1).
3. Centrifuger prøverne (5 min, 20.000 xg), og den flydende fase overført til et 1,5 ml centrifugerør.
4. Lyofilisere flydende fase med en centrifugal fordamper (Speedvac).
5. Tilsæt 100 pi cyclohexan og 100 ul milliQ vand til den tørre pellet.
6. Ryst prøverne i 5 minutter ved stuetemperatur (brug vortex).
7. Centrifuger prøverne (5 min, 20.000 xg).
8. Transfer 80 ul af vandfasen (nedre fase) LC-MS injektionshætteglas med konisk bund for LC-MS-analyse.

5.. Dataanalyse

1. Konfigurer Xcalibur, MarkerLynx, Metalign ⁷ eller XCMS ⁸ og vælg analyse, der skal behandles.
2. Forbered en tabel over fundne toppe af din interesse i overensstemmelse med sammensatte klasse i tabel 1.
3. Identificer toppe ved co-eluering af faste forbindelser.
4. Efterfølgende anmærke opdaget toppe bruger MSN analyse, strukturelle karakterisering algoritmer ^9,10, litteratur survey og metabolit databasesøgning ^11,12.

6.. Kulbrinte Extraction ¹³

1. Nedsænkes friskhøstede N. glauca blade (~ 200 mg) i opløsningsmiddel (methanol, ethanol, chloroform, hexan eller petroleumsether (kogepunkt 40-60 ° C eller 60-80 ° C) (5 ml HPLC-kvalitet) i 2 til 20 min.
2. Fjern blade og tørre opløsningsmidler helt ved roterende fordampning.
3. Resuspender prøver i hexan (1 ml, HPLC-kvalitet).
4. Udfør GC-MS-analyse ved hjælp af gaskromatografi og bindestreg til et 5973MSD. Driftsbetingelser bør være som følger; bæregas, helium med en strømningshastighed på 0,9 ml min ^-1/11 psi. Injicere prøver (1 ul) med en splitless indsprøjtningsdyse ved 280 ° C. Hold gaskromatografi ovn ved 70 ° C i 5 min før ramping ved 4 ° C / min til 320 ° C. Hold den endelige temperatur i yderligere 10 minutter, i alt cirka 67,5 min. Indstil interface med MS ved 280 ° C, og pForetag en MS i fuld scanning tilstand ved hjælp af 70 eV EI + og scannet 10-800 D.
5. I første omgang behandler Chromatogrammet komponenter med automatiseret MS deconvolution og identifikationssystem, og dem, der er identificeret ved hjælp af NIST 98 MS-bibliotek.
6. Bekræfte identifikationen af ​​mættede langkædede alkan kulbrinter (hexacosenol, nonacosan, triacontan, octacosenol, nonacosonal, hentriacontane, dotriacontane og tritriacontane) ved at sammenligne retentionstider og klassiske fragmenteringsmønstre til kendte autentiske standarder.
7. Bestem kvantitativt carbonhydrider ved at sammenligne integrerede toparealer med dosisresponskurver (0,07 til 2,5 mg), fremstillet fra autentiske standarder.
8. Beregn midler og standard fejl af midlerne (SEM) ved hjælp af Excel software.

7.. Analyse af Isoprenoider ¹⁴

1. Udfør homogenisering som beskrevet i afsnit 2.. I 10 mg homogeniseret frysetørret pulver afvejes i et centrifugeglas.
2. Tilføj sekventielt 250 ml methanol på pulveret, bland det, og derefter tilsættes 500 ml kloroform (laboratoriereagens klasse), og bland det med vortex.
3. Lad prøverne på is i mørke i 20 minutter.
4. Tilsæt 250 ml Tris-HCI-buffer (100 mM, pH 7,5) eller vand (HPLC-kvalitet) til suspensionen, og vortexes.
5. Centrifuger blandingen ved 12.000 rpm (13.523 x g) i 5 minutter for at adskille ikke-polære fra vandige faser. Den upolære Chloroformfasen indeholdende isoprenoid ekstrakter er i bunden.
6. Overfør fase til en ny centrifugerør.
7. Tilføj yderligere 500 ml chloroform til den vandige fase, og føre en anden ekstraktion med vortex og centrifugering som beskrevet ovenfor.
8. Kombiner chloroformekstrakterne og bringe prøver til tørhed på fordamperen og opbevares ved -20 ° C indtil analyse.
9. 50 ml ethylacetat (HPLC-kvalitet) til den tørrede isoprenoid ekstrakt for at genopløse materialet.
10. Injicer 3 ml på en C18søjle ved anvendelse af en UPLC Acquity separation modul. Gradienten anvendt til at separere de pigmenter bør omfatte; A: methanol / H ₂ 0 (50:50) og B: acetonitril / ethylacetat (75:25), og de ​​første betingelser bør være en 30% (v / v) og B 70% (v / v) at gå til 100 % B i løbet af 6 min. Brug en strømningshastighed på 0,6 ml / min.
11. Overvåg eluatet kontinuerligt med en Photo Diode Array (PDA) detektor 250-600 nm.
12. Identificere bestanddele ved co-kromatografi og spektrale sammenligninger mellem autentiske standarder, beta-caroten (provitamin A), phytoensynthase, lycopen, lutein og zeaxanthin.
13. Udfør kvantificering fra dosis-respons-kurver.
14. Bekræft forbindelser ved hjælp af LC-MS; bruger lignende kromatografiske betingelser. Detection bør ske ved hjælp APCI ionisering i positiv tilstand med en Q-Tof instrument.
15. Gør ændringer for tocopherol bestemmelse med 25 mg frysetørret materiale, der er blevet udvundet og forsæbning i 6% KOH ved 50 ° C i 1,5 time.

Denne protokol kombinerer Trizol RNA ekstraktion med et RNeasy Kit til at opnå kvalitet RNA høj.

1. Grind 100 mg frosset plantemateriale i 2 ml centrifugerør med en metalkugle med en mixer mill.
2. Tilsæt 1 ml Trizol.
3. Centrifugér materiale i 10 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C.
4. Supernatanten overføres til et nyt reagensglas.
5. Tilsæt 200 pi chloroform Vend røret flere gange, og inkuberes 3 minutter ved stuetemperatur.
6. Centrifuger blandingen i 15 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C.
7. Den øvre vandige fase (ca. 700 ul) overføre til en ny reaktion rør.
8. Læg cirka 2,5 volumener ethanol (100%), vendes røret flere gange, og der inkuberes i 30 minutter ved -80 ° C.
9. Flyt prøven herunder præcipitat spin søjle fra sættet.
10. Centrifugeres kolonnen for 15 sekunder ved 8.000 xg, og kassér flav igennem.
11. Tilføj 700 ul buffer RW1 til spinsøjle og centrifugeres i 15 sekunder ved 8000 x g. Kassér gennemstrømningen.
12. Tilsæt 500 pi Buffer RPE til spinkolonne og centrifugere søjlen i 15 sekunder ved 8.000 x g. Kassér gennemstrømningen.
13. Tilsæt 500 pi Buffer RPE til spinkolonne og centrifugeres i 2 minutter ved 8.000 x g.
14. Placer spinkolonne i et nyt 1,5 ml reaktionsrør og tilsættes 50 pi RNase-frit vand.
15. Centrifugér søjlen i 1 min ved 8000 xg for at eluere RNA'et.
16. Fjerne tilbageværende DNA under anvendelse af et Ambion DNA-free kit ifølge producentens anvisninger.
17. Bestemme kvaliteten af ​​RNA. RNA bør have RNA integritet numre (RIN) over 8.
18. Send fra RNA til næste generation sekventering.

Representative Results

Den HPLC-profil i figur 1 viser et repræsentativt resultat af isoprenoid-analyse af N. glauca bladekstrakter. De forskellige isoprenoids C40 og derover blev påvist ved hjælp af en Photo Diode Array (PDA) detektor. Toppene blev kommenteret baseret på co-kromatografi og spektral sammenligning mellem autentiske standarder, betakaroten (provitamin A), phytoen, lycopen, lutein og zeaxanthin. De to MS kromatogrammer i figur 2 viser resultatet af primær metabolit analyse fra N. glauca blade og stængel materiale hhv. MS spektrum af en top svarende til serin (angivet ved en pil) er også givet som et eksempel. Figur 3 viser Bioanalyzer anvendes til bestemmelse af kvaliteten af RNA og en repræsentant output fra enheden. De to vigtigste toppe i kromatogrammet svarende til 18 S og 25 S ribosomal RNA, hvilket indikerer intakt RNA i prøven. Yderligere toppe af fragmenteret ribbenosomal RNA synes i tilfælde af delvist eller stærkt nedbrudt RNA.

Figur 1.. HPLC-profil viser isoprenoider stede i bladekstrakter fra N. glauca. fleste isoprenoider C40 og derover er ikke modtagelig for GC-MS-analyse. Vi brugte derfor HPLC separationer med fotodiodesættet detektion. Et typisk kromatogram er optaget ved 450 nm er vist. De carotenoidpigmenter er typiske for fotosyntetiske væv med lutein overvejende. Også til stede er zeaxanthin, som sjældent findes i bladvæv medmindre placeret under høj lys stress. Niveauerne af zeaxanthin gøre det til en god kilde til denne high-værdi sammensatte. Klik her for at se et større vertering af dette tal.

Figur 2.. MS kromatogram og spektrum af N. glauca vævsekstrakter. Total ion MS kromatogram (TIC) af blade og dæmme ekstrakter målt ved GC-MS præsenteres (70-600 m / z). GC-MS-analyse blev udført som beskrevet tidligere i ^15. Fundne toppe blev kommenteret under anvendelse af masse spektrale mærker biblioteket. MS spektrum af serin (2TMS) er vist som et eksempel. MS kromatogram: X-akse og Y-akse indikerer retentionstid (min) og intensitet (overflod) af signalet, MS-spektrum: X-aksen og Y-aksen angiver M / Z-forhold og intensiteten (overflod) af signalet, hhv. Klik her for at se størrebillede.

Figur 3. Bioanalyzer måling af RNA fremstillet for RNA seq N. glauca bladmateriale. at opnå meget rent RNA nødvendig for RNA-seq vi ekstraheret RNA under anvendelse af Trizol-reagens og efterfølgende oprenset RNA ved hjælp af kolonner fra RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Vi bestemmes ved hjælp af Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Tyskland) vises i venstre RNA kvalitet. Et eksempel på en Bioanalyzer udgang gives til højre. De to vigtigste toppe i stikprøven repræsenterer 18 S og 25 S ribosomal RNA. Vores prøve viste en RNA-integritet nummer (RIN) på 9,2, hvilket er langt over den ønskede værdi på 8. Klik på hendee for at se større billede.

Discussion

De protokoller, der præsenteres her giver en omfattende ramme for at analysere tobak træ blade for metabolitter og udskrifter. Det forventes, at disse kombinerede indsats bør give os ny indsigt i processerne bag syntesen og ekstrudering af kulbrinter og den høje værdi forbindelser til stede i dette væv. Disse metoder bør derfor give os en bedre forståelse for, hvordan forbindelserne bliver syntetiseret. Ud over de tobak træ aspekter af arbejdet, er det også til formål at forbedre poppel biomasse, især rettet mod lignification af den sekundære væg struktur, men også at undersøge, om vi kan bruge bark til udvinding af værdifulde forbindelser.

De metoder, der præsenteres i dette papir er små modifikationer af standardiserede metoder til metabolit profilering. Disse metoder er naturligvis begrænset til kendte metaboliske profiler og det er muligt at adskillige nye metaboliske toppe kan opnås for which ingen forbindelse er kendt. Vi håber at sætte disse forbindelser i sammenhæng med andre metabolitter ved at kombinere adfærd metabolitter og udskrifter i serie den udviklingsmæssige tid.

Ingen af ​​de metoder, der præsenteres her, er ændret væsentligt fra metoder, der typisk anvendes til plantematerialer. Det interessante aspekt ligger i kombinationen af ​​metoder til at forstå den underliggende ramme for primært lang produktionskæden kulbrinte og ændring i tobaks træ blade. Et af de vigtige skridt for at opnå denne information er den efterfølgende kombination af de forskellige datatyper. Vi forestiller, at de data, som en første evaluering vil blive opdelt i forskellige klynger baseret på adfærd metabolitter / udskrifter over udvikling, og at disse data vil blive brugt til at udlede afskrift vs metabolit adfærd, og også til potentielt overdrage visse metabolitter veje . Desuden er mere omfattende netbaserede analyser derefter forestillede to udnytte årsagssammenhænge.

De analytiske protokoller, der præsenteres her vil også give et grundlag for felt-forsøg og industriel udnyttelse af biomassen. For at opnå dette, MultiBioPro konsortiet indeholder flere industrielle partnere, der har evner til yderligere at udforske biomasse, med det formål at levere biodiesel, bioethanol og andre forbindelser af høj vaerdi. Disse typer af udnyttelse af biomasse vil blive vurderet på grundlag af; (1) at teste robustheden og kvaliteten af ​​de bio produkter produceres (typisk industri standard tests vil blive gennemført for at sikre, at produkterne genererede har god markedsværdi), (2), en økonomisk, social og miljømæssig vurdering af teknologierne vil blive udført hjælp litteraturkilder, interviews og materiale, der genereres under feltforsøg og pilotanlæg bioraffinaderi vurderinger. Disse aktiviteter vil omfatte cost-benefit og livscyklusanalyse, generering af en miljømæssig dokumentation og markeds-og virksss strategier. Vi mener, at denne rørledning vil blive en nyttig blanding af den akademiske verden, anvendt videnskab og industriel udnyttelse til yderligere poppel og tobak træ biomasse til forbrugerprodukter slutprodukter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol reagent	Invitrogen	15596-026
Chloroform	Merck	102445
Ethanol	Merck	101986
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
TURBO Dnase	Invitrogen	AM2238
RNA 6000 Nano Kit	Agilent	G2938-90034
2100 Electrophoresis Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
1.5 ml and 2 ml safe-lock tubes	Eppendorf	0030 120.086, 0030 120.094
Steel balls	Geyer Berlin GmbH	VA2mm
Mixer mill MM 300	Retsch	YO-04182-09
Microcentrifuge	Eppendorf	5424