Transcript och metabolit profilering för utvärdering av tobaks Träd och poppel som råvara för biobaserade industri

Summary

Växtbiomassa erbjuder en förnybar resurs för flera produkter, bland annat bränsle, foder, livsmedel och en mängd olika material. I denna artikel vi undersöka egenskaperna hos tobaksträd (Nicotiana glauca) och poppel som lämpliga källor för ett bioraffinaderi pipeline.

Abstract

Den globala efterfrågan på livsmedel, foder, energi och vatten innebär extra utmaningar för framtida generationer. Det är uppenbart att robusta plattformar för utforskandet av förnybara resurser är nödvändiga för att övervinna dessa utmaningar. Inom den multinationella ramen MultiBioPro utvecklar vi bioraffinaderi rörledningar för att maximera användningen av växtbiomassa. Mer specifikt använder vi poppel och tobak träd (Nicotiana glauca) som mål-grödor för att förbättra saccharification, isoprenoid, långa innehåll kedja kolväte, fiberkvalitet, och suberin och lignininnehåll. De metoder som används för att erhålla dessa utgångar inkluderar GC-MS, LC-MS-och RNA-sekvense plattformar. Metaboliten rörledningar är väletablerade verktyg för att skapa dessa typer av data, men har också begränsningar i att endast väl karakteriserade metaboliter kan användas. Den djupa sekvensering ger oss möjlighet att inkludera alla avskrifter närvarande under de utvecklingsstadier av tobaks träd, blad, men hsom ska mappas tillbaka till sekvensen av Nicotiana tabacum. Med dessa uppställningar, vi siktar på en grundläggande förståelse för bakomliggande processer och att upprätta en industriell ram för att utnyttja resultaten. I ett mer långsiktigt perspektiv tror vi att data som genereras här kommer att ge medel för en hållbar bioraffinaderi process med hjälp av poppel och tobak träd som råvara. Hittills den basala nivån av metaboliter i proverna har analyserats och de protokoll som används finns i den här artikeln.

Introduction

Befolkning och ekonomisk tillväxt har medfört en ökad efterfrågan på mat, vatten och bränsle. En stor del av dessa leveranser tillverkas, bearbetas och transporteras med hjälp av ändliga fossila sätt, till exempel olja. Det är dock uppenbart att denna praxis är inte hållbart, och utveckling av alternativa resurser kommer därför att vara av stor vikt ^1. Många förnybara resurser är, i varierande grad, för närvarande utnyttjas, inklusive vind, vatten rörelse, solenergi, geotermisk energi, och vinka baserade energikällor. En annan hållbar och outnyttjad resurs är biomassa från växter. Denna resurs har även ett mycket kostnadseffektivt sätt att omvandla solenergi härrör energin i bränslen ^2. Bortsett från att tillhandahålla biobaserat bränsle, växtbiomassa erbjuder unika möjligheter för alternativa produkter, bland annat plast, rengöringsmedel och värdefulla kemikalier.

Växtcellväggen, som till stor del består av sockerbaserade polymerer, makes upp huvuddelen av växtens biomassa och mycket arbete är för närvarande satsas på en effektiv omvandling till bioetanol. Den återstående biomassan kan därefter bearbetas till biogas och oljerelaterade produkter ^3. En stor del av de perenna växtarter, bland gräs och träd, som producerar stora mängder cellulosa biomassa vanligtvis växer bäst i de tempererade zonerna. Dock är cirka 20% av landarealen halvtorrt, och är därför också benägna att torka ^4. Självklart skulle det vara av intresse att även odla dessa torra marker med växter som på ett effektivt sätt kan bidra till en hållbar produktion av energi och material. Dessa anläggningar måste ha en optimal vattenanvändningen och torka motstånd och skulle omfatta tobaksträdet (Nicotiana glauca) och arter från Agave släktet.

Den MultiBioPro konsortiet syftar till att genomföra ett integrerat bioraffinaderi pipeline, med hjälp av två viktiga spop art, poppel och tobak träd. Poppel har vuxit fram som ett lovande biobränsle gröda som det snabbväxande, lätt kloner förökas och mycket anpassningsbara till en mängd olika klimat-och markförhållanden. Det ger också ett brett utbud av trä, fiber, ved och andra skogsprodukter ^5. Tobaks träd har också vuxit fram som en lämplig anläggning för biobränslen och bioraffinaderier ändamål. Den producerar normalt betydande mängder biomassa, innehåller höga halter av icke-strukturella kolhydrater ^6, och dessutom har den sällsynta förmågan att ackumulera stora mängder lätt extraherbara nonfood oljor (inbegripet lång kedja C _{29-C 31} mättade kolväten och triterpenoids) som är lämpliga för biodiesel produktion. Tobaks träd är dessutom bli föremål för genetisk förbättring, har hög groning kapacitet, och växer gärna på halvtorra jordar som inte används för livsmedelsproduktion. Det förefaller därför som både poppel och tobak träd har inneboende potential för multipYFTET grödor, dvs som nya värdefulla råvaror för en integrativ biobaserad industri. I denna uppsats fokuserar vi på mångfald av metoder för att urskilja hur tobaks träd insättningar långkedjiga kolväten.

I ett försök att identifiera den underliggande molekylära maskineriet som ansvarar för produktion och utsöndring av de mättade långkedjiga kolväten på tobaksblad, tillämpar vi moderna "omik" baserade teknologier. Detta inkluderar RNA artiklar i en utvecklingsbladserie (tio stegen), och multiplattforms metabolit profilering närmar använder LC-och GC-MS (för polära och icke-polära metaboliter och lipidomics). Dessa data kommer att användas för att bryta för genuttryck som korrelerar med, eller föregår, uppkomsten av biosyntesen av molekylerna som anges ovan. Gener och vägar som verkar lovande från detta arbete kommer att användas för funktionstestning i modellarter Arabidopsis och kan i slutändan vara mottaglig för bioteknisk ingenjörs i tobacco träd.

Protocol

1. Växtmaterial

Odla Nicotiana glauca fabriker i 30 krukor cm diameter innehåller M2 professionella odlingssubstrat. Odla växter i växthus, med en dagstemperaturen på 20-25 ° C och nattlig temperatur av 15 ° C. Använd en 16 timmars ljus och 8 timmar mörker cykel som kompletterande ljus regimen.

2. Provberedning

1. För primära metaboliter:
   1. Harvest växtmaterial (blad och stjälkar av N. glauca) och frysmaterial omedelbart.
   2. Lyofilisera fryst växtmaterial genom frystorkning i tre dagar.
   3. Slipa frystorkade prov från mixer kvarn med metallkulor.
   4. Alikvot fint malda torra material i en 2 ml centrifugrör eller glasflaska.
2. För sekundära metaboliter:
   1. Harvest växtvävnader och frysmaterial omedelbart.
   2. Slipa frusna växtvävnader med mixer kvarn med kula av rostfritt stål eller av mortel och mortelstöt.
   3. Alikvotera fina malda vävnader i 2 ml centrifugrör (cirka 20 mg våtvikt).

3. Extraction Protokoll för Metabolite Profilering för primära metaboliter med GC-MS

1. Alikvot marken torrt växtmaterial (10 mg av blad-och 20 mg av stem material) i 2 ml, skruvlock, rundbottnade rör.
2. Lägg 1.400 l av 100% metanol och skaka i 10 sekunder.
3. Addera 60 pl av Ribitol (0,2 mg / ml stock i _H2O) som en intern kvantitativ standard och vortexblanda i 10 sek.
4. Lägg ett rostfritt stål (eller zirkoniumoxid) boll och homogenisera materialet med ett Mixer Mill i 2 min vid 25 Hz.
5. Centrifugera blandningen i 10 min vid 11000 x g..
6. Överför supernatanten till en glasflaska.
7. Lägg till 750 l av kloroform.
8. Lägg 1500 | il _H2O och vortexblanda mix för 10 sek.
9. Överför 150 | il frånövre fasen (polär fas) till ett rent 1,5 ml centrifugrör.
10. Torra prover med en hastighet vac. Det är absolut nödvändigt att proven reducerades till torrhet under mellan 3 och 24 timmar tills ingen kvarvarande vätska är närvarande.
11. Tillsätt 40 pl av metoxiaminhydroklorid (20 mg / ml i pyridin).
12. Skaka blandningen i en horisontell värmeblock skakare under 2 h vid 37 ° C.
13. Addera 70 pl N-metyl-N - (trimetylsilyl)-trifluoracetamid MSTFA mix.
14. Skaka blandningen under 2 h vid 37 ° C.
15. Spinn ner dropparna på omslaget med en kort centrifugering ~ 1 min vid 11000 x g..
16. Överför vätskan i glasampuller lämpliga för GC-MS-analys.

4. Extraktion för Metabolit Profiling för sekundära metaboliter genom LC-MS-

1. Tillsätt 500 | il metanol för att den frusna marken prover.
2. Skaka med en Thermomixer under 15 minuter vid 70 ° C (1000 sek ^-1).
3. Centrifugera prover (5 min, 20000 x g), och den flytande fasen överfördes till ett 1,5 ml centrifugrör.
4. Lyofilisera vätskefasen med en centrifugal förångare (speedvac).
5. Tillsätt 100 l cyklohexan och 100 ^ milliQ vatten till den torra pellets.
6. Skaka proverna under 5 min vid rumstemperatur (användning vortex).
7. Centrifugera prover (5 min, 20.000 xg).
8. Överför 80 ul av vattenfasen (undre fas) för LC-MS-injektionsflaskor med konisk botten för LC-MS-analys.

5. Dataanalys

1. Konfigurera Xcalibur, MarkerLynx, Metalign ⁷ eller XCMS ⁸ och välj dataanalys som ska bearbetas.
2. Förbered en tabell över detekterade toppar ditt intresse enligt föreningen klass i tabell 1.
3. Identifiera topparna genom samtidig eluering av standardföreningar.
4. Därefter kommentera detekterade toppar använder MSN-analys, strukturkarakteriserings algoritmer ^9,10, litteratur survey och metabolit databasökning ^11,12.

6. Kolväten Extraction ¹³

1. Sänk nyskördade N. glauca blad (~ 200 mg) i lösningsmedel (metanol, etanol, kloroform, hexan eller petroleumeter (kokpunkt 40-60 ° C eller 60-80 ° C) (5 ml, HPLC-kvalitet) under 2 till 20 min.
2. Avlägsna löv och torka lösningsmedel helt genom rotationsindunstning.
3. Återsuspendera proverna i hexan (1 ml, HPLC-kvalitet).
4. Utför GC-MS-analys med hjälp av gaskromatografi och avstavas till en 5973MSD. Driftsförhållanden bör vara följande; bärargas, helium med en flödeshastighet av 0,9 ml min ^-1 / 11 psi. Injicera prover (1 il) med en splitless injektor vid 280 ° C. Håll gaskromatografi ugn vid 70 ° C under 5 min innan rampning vid 4 ° C / min till 320 ° C. Håll den slutliga temperaturen under ytterligare 10 min, vilket gör en total tid av 67,5 min. Ställ gränssnittet med MS vid 280 ° C och perform MS full scan-läge med 70 eV EI + och skannas 10-800 D.
5. Inledningsvis bearbeta kromatogrammet komponenter genom automatiserad MS deconvolution-och identifieringssystem, och de som identifieras med hjälp av NIST 98 MS bibliotek.
6. Bekräfta identifieringen av mättade långkedjiga alkan kolväten (hexacosenol, nonacosan, triacontane, octacosenol, nonacosonal, hentriacontane, dotriacontane och tritriacontane) genom att jämföra retentionstider och klassiska fragmenteringsmönster till kända autentiska standarder.
7. Bestäm kvantitativt kolväten genom att jämföra integrerade toppområdena med dos-responskurvor (0,07-2,5 mg), byggda från autentiska standarder.
8. Beräkna medelvärden och standardfel av medel (SEM) med hjälp av Excel programvara.

7. Analys av isoprenoider ¹⁴

1. Utför homogenisering som beskrivs i avsnitt 2. Väg in 10 mg homogeniserad frystorkat pulver i ett centrifugrör.
2. Lägg till i tur och ordning 250 ml metanol på pulvret, blanda, tillsätt sedan 500 ml kloroform (laboratoriereagenskvalitet), och blanda genom att vortexa.
3. Låt proverna på is i mörker under 20 min.
4. Tillsätt 250 ml Tris-HCl-buffert (100 mM, pH 7,5) eller vatten (HPLC-kvalitet) till suspensionen och blanda genom att vortexa.
5. Centrifugera blandningen vid 12000 rpm (13523 x g) under 5 min för att separera den icke-polära från vattenhaltiga faser. Den opolära kloroform fas innehållande isoprenoid extrakt är i botten.
6. Överför den fas i ett annat centrifugrör.
7. Tillsätt ytterligare 500 ml kloroform till den vattenhaltiga fasen, och genomföra en andra extraktion genom virveln och centrifugering såsom beskrivits ovan.
8. Kombinera de kloroformextrakten och föra proven till torrhet med användning av förångaren och förvara vid -20 ° C fram till analys.
9. Tillsätt 50 ml etylacetat (HPLC-kvalitet) till det torkade isoprenoid extrakt för att återupplösa materialet.
10. Injicera 3 ml på en C18kolonn med användning av en UPLC Acquity separationsmodulen. Den lutning som används för att separera pigment bör innehålla; A: metanol / H ₂ 0 (50:50) och B: acetonitril / etylacetat (75:25), och initialvillkor bör vara en 30% (volym / volym) och B 70% (volym / volym) som går till 100 % B under 6 min. Använd en flödeshastighet av 0,6 ml / min.
11. Övervaka eluatet kontinuerligt med en fotodiod-array-detektor (PDA) från 250 till 600 nm.
12. Identifiera komponenter genom co-kromatografi och spektrala jämförelser mellan autentiska standarder, betakaroten (provitamin A), fytoen, lykopen, lutein och zeaxantin.
13. Utför kvantifiering från dos-responskurvor.
14. Bekräfta föreningar med användning av LC-MS; använder liknande kromatografiska förhållanden. Detektering bör ske med hjälp av APCI jonisering i positivt läge med en Q-Tof instrument.
15. Gör ändringarna för tokoferol bestämning med 25 mg frystorkat material som har utvunnits och förtvålning i 6% KOH vid 50 ° C i 1,5 timmar.

Detta protokoll kombinerar Trizol RNA-extraktion med en RNeasy Kit för att få hög kvalitet RNA.

1. Grind 100 mg frusna växtmaterialet i 2 ml centrifugrör med en metallkula med en bländare kvarn.
2. Tillsätt 1 ml Trizol.
3. Centrifugera materialet i 10 min vid 12000 x g vid 4 ° C.
4. Överför supernatanten till ett nytt reaktionsrör.
5. Addera 200 pl kloroform, vänd röret flera gånger, och inkubera 3 min vid rumstemperatur.
6. Centrifugera blandningen i 15 min vid 12000 x g vid 4 ° C.
7. Överför den övre vattenfasen (approximativt 700 | il) in i ett nytt reaktionsrör.
8. Tillsätt cirka 2,5 volymer etanol (100%), vänd röret flera gånger, och inkubera under 30 min vid -80 ° C.
9. Flytta provet inklusive eventuell fällning spinnkolonn från satsen.
10. Centrifugera kolonnen under 15 sek vid 8000 x g och kasta flåg igenom.
11. Addera 700 pl buffert RW1 till spinnkolonn och centrifugera i 15 sek vid 8000 x g i. Kasta genomflödet.
12. Addera 500 pl buffert RPE till spinnkolonn och centrifugeras kolonnen under 15 sekunder vid 8000 x g i. Kasta genomflödet.
13. Addera 500 pl buffert RPE till spinnkolonn och centrifugera under 2 minuter vid 8000 x g..
14. Placera det centrifugeringskolonn in i ett nytt 1,5 ml reaktionsröret och tillsätt 50 | il RNas-fritt vatten.
15. Centrifugera kolonnen under 1 min vid 8000 x g för eluering av RNA.
16. Ta bort kvarvarande DNA med hjälp av en Ambion DNA-kit enligt tillverkarens anvisningar.
17. Bestämma kvaliteten hos RNA. RNA bör ha RNA integritetsnummer (RIN) över 8.
18. Sänd av RNA för nästa generations sekvensering.

Representative Results

HPLC-profilen i Figur 1 visar ett representativt resultat av isoprenoid analys av N. glauca bladextrakt. De olika isoprenoids av C40 och ovan upptäcktes med hjälp av en fotodiodarraydetektor (PDA). Topparna kommenterad baserat på co-kromatografi och spektral jämförelse mellan autentiska standarder, betakaroten (provitamin A), fytoen, lykopen, lutein och zeaxantin. De två MS kromatogram i Figur 2 visar resultatet av primära metabolit analys från N. glauca blad och stam material, respektive. MS-spektrum av en topp som motsvarar serin (anges med en pil) ges också som ett exempel. Figur 3 visar Bioanalyzer användas för att bestämma kvaliteten hos RNA och en representativ utsignal från anordningen. De två huvudsakliga topparna i kromatogrammet motsvarande 18 S och 25 S ribosomalt RNA, vilket indikerar intakt RNA i provet. Ytterligare toppar fragmenterad revbenosomal RNA verkar i fall av delvis eller kraftigt försämrat RNA.

Figur 1. HPLC-profil visar isoprenoids som finns i bladextrakt från N. glauca. flesta isoprenoids av C40 och ovan är inte mottagliga för GC-MS-analys. Vi använde därför HPLC-separationer med fotodiod array detektion. Ett typiskt kromatogram registrerades vid 450 nm visas. De karotenoidpigment är typiska för foto vävnader med lutein dominerar. Också närvarande är zeaxantin, som sällan hittas i bladvävnad om inte placeras under hög ljus stress. Halterna av zeaxantin gör det en bra källa till denna högt värde förening. Klicka här för att se en större volymertering av denna figur.

Figur 2. MS kromatogram och spektrum av N. glauca vävnadsextrakt. Totalt jon MS-kromatogram (TIC) av blad och stamextrakt uppmätt med GC-MS presenteras (70 till 600 m / z). GC-MS-analys utfördes såsom beskrivits tidigare i ^15. Upptäckta toppar kommenterad med hjälp av massspektrala taggar bibliotek. MS-spektrum av serin (2TMS) visas som ett exempel. MS kromatogram: X-axeln och Y-axeln visar retentionstid (min) och intensiteten (överflöd) av signalen, MS-spektrum: X-axeln och Y-axeln anger M / Z nyckeltal och intensiteten (överflöd) av signalen, respektive. Klicka här för att visa en störreimage.

Figur 3. Bioanalyzer mätning av RNA framställt för RNA punkter i N. glauca bladmaterial. För att erhålla höggradigt rent RNA som behövs för RNA-seq vi heras RNA med användning av Trizol-reagens och därefter renades den RNA med användning av kolumnerna från RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Vi bestämde RNA kvalitet med hjälp av Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Tyskland) som visas till vänster. Ett exempel på en Bioanalyzer utgång ges till höger. De två huvudtoppar i urvalet representerar 18 S och 25 S ribosomalt RNA. Vårt prov visade en RNA integritet nummer (RIN) på 9,2, vilket är långt över det fastställda värdet 8. Klicka hennee för större bild.

Discussion

De protokoll som presenteras här ger en övergripande ram för att analysera tobaks löv för metaboliter och avskrifter. Det är tänkt att dessa gemensamma ansträngningar ska ge oss nya insikter i de processer som ligger till grund för syntes och extrudering av kolvätena och det höga värdet föreningar i denna vävnad. Dessa metoder bör därför ge oss en bättre förståelse för hur de föreningar som syntetiseras. Förutom de tobaks trädet aspekter av arbetet, är det också syftar till att förbättra poppel biomassa, särskilt med inriktning lignification av den sekundära väggstrukturen, men också för att undersöka om vi kan använda bark för utvinning av värdefulla ämnen.

De metoder som presenteras i detta dokument är smärre ändringar av standardiserade metoder för metabolit profilering. Dessa metoder är naturligtvis begränsad till kända metaboliska profiler, och det är möjligt att flera nya metaboliska toppar kan erhållas för which ingen förening är känd. Vi hoppas kunna sätta dessa föreningar i sammanhang med andra metaboliter genom att kombinera beteende metaboliter och avskrifter över utvecklings tidsserier.

Ingen av de metoder som presenteras här är väsentligt ändras från metoder som vanligtvis används för växtmaterial. Det intressanta ligger i kombinationen av metoder för att förstå den bakomliggande ram för huvudsakligen lång produktionskedja kolväten och ändringar i tobaks träd blad. En av de kritiska stegen för att få denna information är den efterföljande kombinationen av de olika datatyper. Vi ser framför oss att de uppgifter som en första utvärdering kommer att delas in i olika grupper baserat på beteendet hos de metaboliter / utskrifter över utvecklingen och att dessa uppgifter kommer att användas för att dra slutsatser om utskrift vs metabolit beteenden, och även för att eventuellt överlåta vissa metaboliter till vägar . Dessutom är mer avancerade nätverksbaserade analyser sedan tänkt to utnyttja orsakssamband.

De analytiska protokoll som presenteras här kommer också att ge underlag för fält prövningar och industriellt utnyttjande av biomassan. För att åstadkomma detta, innehåller MultiBioPro konsortiet flera industriella partners som har förmåga att ytterligare utforska biomassa, i syfte att leverera biodiesel, bioetanol och andra föreningar med högt värde. Dessa typer av exploatering av biomassa kommer att bedömas utifrån; (1) att testa robustheten och kvaliteten på de biologiska produkter som produceras (typiska industrin standardtester kommer att genomföras för att säkerställa att produkter som genereras har bra marknadsvärdet), (2), en ekonomisk, social och miljömässig utvärdering av tekniken kommer att utföras med hjälp av litteraturkällor, intervjuer och material som genereras under fältförsök och pilotanläggning bioraffinaderi bedömningar. Dessa aktiviteter kommer att inkludera kostnads-och livscykelanalys, generering av miljö dokumentation och marknad och business strategier. Vi tror att denna rörledning kommer att bli en nyttig blandning av akademiska, tillämpad vetenskap och industriell exploatering ytterligare poppel och tobak trädbiomassa för konsumentslutprodukter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol reagent	Invitrogen	15596-026
Chloroform	Merck	102445
Ethanol	Merck	101986
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
TURBO Dnase	Invitrogen	AM2238
RNA 6000 Nano Kit	Agilent	G2938-90034
2100 Electrophoresis Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
1.5 ml and 2 ml safe-lock tubes	Eppendorf	0030 120.086, 0030 120.094
Steel balls	Geyer Berlin GmbH	VA2mm
Mixer mill MM 300	Retsch	YO-04182-09
Microcentrifuge	Eppendorf	5424