Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

نص والمستقلب التنميط لتقييم شجرة التبغ والحور كمادة وسيطة لصناعة القائمة على الحيوية

Published: May 16, 2014 doi: 10.3791/51393
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 3,4, 3,4, 3,4, 3,4, 5,6, 5,6, 7, 8, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 13, 1,14
1Max Planck Institute for Molecular Plant Physiology, 2School of Biological Sciences, Plant Molecular Science, Centre for Systems and Synthetic Biology, Royal Holloway, University of London, 3Department of Plant Systems Biology, VIB, 4Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, UGhent, 5Institute for Building Materials, ETH Zurich, 6Applied Wood Materials, EMPA, 7Division of Glycoscience, School of Biotechnology, AlbaNova University Center, Royal Institute of Technology (KTH), 8European Research and Project Office GmbH, 9ABBA Gaia S.L., 10Pflanzenöltechnologie, 11Capax Environmental Services, 12Green Fuels, 13Neutral Consulting Ltd, 14Plant Cell Biology Research Centre, School of Botany, University of Melbourne

ERRATUM NOTICE

Summary

تقدم الكتلة الحيوية النباتية مورد متجدد للمنتجات متعددة، بما في ذلك الوقود والأعلاف والمواد الغذائية ومجموعة متنوعة من المواد. في هذه الورقة نحن التحقيق في خصائص شجرة التبغ (النيكوتين glauca) والحور المصادر المناسبة كما لخط أنابيب معامل تكرير أحيائية.

Abstract

الطلب العالمي على الغذاء والأعلاف والطاقة والمياه تطرح تحديات غير عادية للأجيال القادمة. فمن الواضح أن منصات قوية لاستكشاف الموارد المتجددة ضرورية للتغلب على هذه التحديات. في إطار المتعددة الجنسيات MultiBioPro نحن نعمل على تطوير خطوط الأنابيب معامل تكرير أحيائية لتحقيق الاستفادة القصوى من الكتلة الحيوية النباتية. وبشكل أكثر تحديدا، ونحن نستخدم الحور وشجرة التبغ (النيكوتين glauca) كأنواع المحاصيل المستهدفة لتحسين تسكر، isoprenoid، محتويات سلسلة طويلة الهيدروكربونية، ونوعية الألياف، وسوبيرين واللجنين المحتويات. الطرق المستخدمة للحصول على هذه النتائج تشمل GC-MS، LC-MS ومنصات تسلسل الحمض النووي الريبي. يتم إنشاء خطوط أنابيب الأيض بشكل جيد أدوات لتوليد هذه الأنواع من البيانات، ولكن أيضا لديها قيود في هذا الأيض فقط تتميز كذلك يمكن استخدامها. فإن التسلسل العميق تسمح لنا ليشمل جميع النصوص الحالية خلال المراحل التنموية للأوراق شجرة التبغ، ولكن حكما ليتم تعيينها إلى تسلسل نيكوتيانا تبغ. مع هذه المنبثقة مجموعة، ونحن نهدف إلى فهم أساسي للعمليات الأساسية وعلى إنشاء إطار الصناعية لاستغلال النتائج. في منظور أكثر على المدى الطويل، ونحن نعتقد أن البيانات التي تم إنشاؤها هنا سوف توفر وسيلة لعملية معامل تكرير أحيائية المستدامة باستخدام شجرة الحور والتبغ كمادة خام. حتى الآن على المستوى القاعدي من نواتج الأيض في عينات تم تحليلها ويتم توفير البروتوكولات المستخدمة في هذه المقالة.

Introduction

تسببت السكان والنمو الاقتصادي والطلب المتزايد على الغذاء والماء والوقود. ويتم إنتاج الكثير من هذه الإمدادات ومعالجتها ونقلها باستخدام وسائل محدودة على أساس الأحفوري، مثل النفط. هو عليه، ومع ذلك، من الواضح أن هذه الممارسة ليست مستدامة، وبالتالي فإن تطوير موارد بديلة تكون ذات أهمية كبيرة 1. العديد من الموارد المتجددة، بدرجات متفاوتة، ويجري استغلالها حاليا، بما في ذلك الرياح وحركة المياه، والطاقة الشمسية والطاقة الحرارية الأرضية، وموجة مصادر الطاقة القائمة. المستدامة للموارد غير مستغلة إلى حد كبير وآخر هو الكتلة الحيوية من النباتات. كما يقدم هذا المورد على طريقة فعالة من حيث التكلفة للغاية لتحويل الطاقة الشمسية إلى وقود مشتق 2. وبصرف النظر عن تقديم الوقود الحيوي القائم، والكتلة الحيوية النباتية كما يقدم فرصا فريدة للمنتجات البديلة، بما في ذلك المواد البلاستيكية والمنظفات، والمواد الكيميائية ذات قيمة.

جدار الخلية النباتية، والتي تتألف في معظمها من البوليمرات السكر مقرها، ماكوفاق يصل الجزء الأكبر من الكتلة الحيوية للنبات، ويجري حاليا استثمرت الكثير من الجهد في تحويل كفاءة لها في الإيثانول. قد احقا معالجة الكتلة الحيوية المتبقية في الغاز الحيوي والمنتجات النفطية ذات الصلة 3. الكثير من الأنواع النباتية المعمرة، بما في ذلك الأعشاب والأشجار، والتي تنتج كميات كبيرة من الكتلة الحيوية السليلوزية عادة تنمو أفضل في المناطق المعتدلة. ومع ذلك، ما يقرب من 20٪ من مساحة الأراضي شبه القاحلة، وبالتالي فهي عرضة لموجات الجفاف 4 أيضا. من الواضح، أنه سيكون من مصلحة لزراعة هذه الأراضي القاحلة أيضا مع النباتات التي يمكن أن تسهم بشكل فعال في الإنتاج المستدام للطاقة والمواد. هذه النباتات تحتاج إلى أن يكون هناك الأمثل كفاءة استخدام المياه ومقاومة الجفاف وستشمل شجرة التبغ (النيكوتين glauca) والأنواع من جنس الصبار.

يهدف الكونسورتيوم MultiBioPro لتنفيذ خط أنابيب معامل تكرير أحيائية المتكاملة، وذلك باستخدام اثنين من كر هامةأنواع الذكر، وشجرة الحور التبغ. وقد برزت الحور كمحصول الوقود الحيوي واعدة لأنها تنمو بسرعة وسهولة نشر clonally وقابلة للتكيف للغاية لمجموعة واسعة من الظروف المناخية والتربة. كما يوفر مجموعة واسعة من الخشب والألياف والخشب الوقود، ومنتجات الغابات الأخرى 5. وقد برزت أيضا شجرة التبغ باعتبارها محطة مناسبة لأغراض الوقود الحيوي ومعامل تكرير أحيائية. وتنتج عادة كميات كبيرة من الكتلة الحيوية، ويحتوي على كميات عالية من الكربوهيدرات ابنيوي 6، وأيضا لديه القدرة النادرة لتراكم كميات كبيرة من الزيوت غير غذائية استخراجها بسهولة (بما في ذلك سلسلة طويلة C 29-C 31 الهيدروكربونات المشبعة واستخلص) التي هي مناسبة لانتاج الديزل الحيوي الإنتاج. شجرة التبغ، علاوة على ذلك، قابلة للتحسين الوراثي، لديه قدرة عالية تنتشر، وينمو في التربة بسعادة شبه القاحلة لا تستخدم لإنتاج الغذاء. وبالتالي يبدو أن كلا من الحور وشجرة التبغ لديها القدرة الذاتية للmultipالمحاصيل urpose، أي كمادة وسيطة جديدة ذات قيمة عالية لصناعة الحيوي القائم تكاملية. في هذه الورقة ونحن نركز على مجموعة متنوعة من النهج لتمييز سلسلة الهيدروكربونات كيف الودائع شجرة التبغ طويلة.

في محاولة لتحديد الآليات الجزيئية الكامنة المسؤولة عن إنتاج وإفراز المواد الهيدروكربونية المشبعة طويلة السلسلة على أوراق التبغ، ونحن نطبق "OMICS" الحديثة التكنولوجيات القائمة. وهذا يشمل يليها RNA من سلسلة أوراق التنموية (عشرة مراحل)، ونهج التنميط المستقلب المتعدد باستخدام LC-GC-MS و(لنواتج الأيض وlipidomics القطبية وغير القطبية). وسوف تستخدم هذه البيانات لإزالة الألغام للتعبير الجين الذي يرتبط، أو تسبق، بداية من الحيوي للجزيئات هو مبين أعلاه. وسيتم استخدام الجينات والممرات التي تبدو واعدة من هذه المساعي لاختبار وظيفي في نبات الأرابيدوبسيس الأنواع النموذجية ويمكن أن يكون في نهاية المطاف قابلة للهندسة التكنولوجيا الحيوية في طوبشجرة ACCO.

Protocol

1. المواد النباتية

تنمو النباتات في نيكوتيانا glauca الأواني 30 سم القطر تحتوي على M2 المهنية المتوسطة المتنامية. تنمو النباتات في البيوت الزجاجية، مع درجة حرارة النهار من 20-25 درجة مئوية، ودرجة حرارة ليلية من 15 درجة مئوية. استخدام ضوء 16 ساعة ودورة الظلام 8 ساعة كما ضوء النظام التكميلي.

2. إعداد نموذج

  1. لنواتج الأيض الأساسي:
    1. المواد النباتية الحصاد (الأوراق والسيقان من N. glauca) والمواد تجميد فورا.
    2. يجفد المواد النباتية المجمدة بواسطة تجميد التجفيف لمدة ثلاثة أيام.
    3. طحن عينات مجفف بالتجميد من قبل مطحنة خلاط مع كرات معدنية.
    4. المواد الجافة قسامة الأرض الجميلة في أنبوب الطرد المركزي 2 مل أو قارورة من الزجاج.
  2. للالمركبات الثانوية:
    1. الأنسجة النباتية الحصاد والمواد تجميد فورا.
    2. طحن الأنسجة النباتية المجمدة بواسطة mمطحنة ixer مع الكرة الفولاذ المقاوم للصدأ أو هاون ومدقة.
    3. قسامة الأنسجة الأرض الرائعة في 2 مل أنبوب الطرد المركزي (حوالي 20 ملغ من الوزن الرطب).

3. بروتوكول لاستخراج المستقلب التنميط لالمستقلبات الابتدائية بواسطة GC-MS

  1. المواد النباتية الجافة الأرض قسامة (10 ملغ من أوراق و 20 ملغ من المواد الجذعية) في 2 مل، المسمار كأب، وأنابيب أسفل الجولة.
  2. إضافة ميكرولتر من 1،400 الميثانول بنسبة 100٪ ودوامة لمدة 10 ثانية.
  3. إضافة 60 ميكرولتر من ريبيتول (0.2 ملغ / مل الأسهم في H 2 O) كمعيار كمي الداخلي ودوامة لمدة 10 ثانية.
  4. إضافة الفولاذ المقاوم للصدأ واحد (أو زركونيا) الكرة والتجانس مع المواد مطحنة الخلاط لمدة 2 دقيقة عند 25 هرتز.
  5. أجهزة الطرد المركزي لهذا المزيج لمدة 10 دقيقة في 11،000 ز س.
  6. نقل طاف لقارورة زجاجية.
  7. إضافة 750 ميكرولتر من الكلوروفورم.
  8. إضافة ميكرولتر من 1،500 H 2 O ودوامة المزيج لمدة 10 ثانية.
  9. نقل 150 ميكرولتر منالمرحلة العليا (مرحلة القطبية) الى الطازجة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي.
  10. العينات الجافة باستخدام بطالة السرعة. لا بد من أن العينات يتم تخفيض للجفاف لمدة تتراوح بين 3 و 24 ساعة حتى وجود أي السائل المتبقية.
  11. إضافة 40 ميكرولتر من هيدروكلوريد methoxyamine (20 ملغ / مل في البيريدين).
  12. يهز المزيج في أفقي الحرارة كتلة شاكر لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
  13. إضافة 70 ميكرولتر N-ميثيل-N - (trimethylsilyl) trifluoroacetamide MSTFA المزيج.
  14. يهز هذا المزيج لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
  15. تدور باستمرار قطرات على غلاف من قبل الطرد المركزي قصيرة ~ 1 دقيقة في 11،000 ز س.
  16. نقل السائل في قارورة زجاجية مناسبة لتحليل GC-MS.

4. استخراج لالمستقلب التنميط للالمركبات الثانوية التي كتبها LC-MS

  1. إضافة 500 ميكرولتر الميثانول لعينات التربة المجمدة.
  2. يهز مع thermomixer لمدة 15 دقيقة عند 70 درجة مئوية (1،000 ثانية -1).
  3. الطرد المركزي العينات (5 ميلن، 20،000 x ج) والطور السائل نقل إلى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي.
  4. يجفد الطور السائل مع المبخر الطرد المركزي (speedvac).
  5. إضافة 100 ميكرولتر الهكسان الحلقي، و 100 ميكرولتر المياه milliQ إلى بيليه الجافة.
  6. يهز العينات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (استخدام الدوامة).
  7. الطرد المركزي العينات (5 دقائق، 20،000 x ج).
  8. نقل 80 ميكرولتر من مرحلة المياه (المرحلة الدنيا) لحقن قارورة LC-MS مع أسفل المخروطية لتحليل LC-MS.

5. تحليل البيانات

  1. تكوين Xcalibur، MarkerLynx، Metalign 7 أو 8 XCMS وحدد تحليل البيانات لتتم معالجتها.
  2. إعداد جدول القمم الكشف عن اهتمامك وفقا للفئة مركب في الجدول 1.
  3. تحديد قمم بواسطة شطف المشترك للمركبات القياسية.
  4. في وقت لاحق تعليم قمم الكشف باستخدام تحليل MSN، خوارزميات توصيف الهيكلية 9،10، أدبurvey والمستقلب قاعدة بيانات البحث 11،12.

6. الهيدروكربونية استخراج 13

  1. يغرق N. المقطوع حديثا أوراق glauca (~ 200 ملغ) في المذيبات (الميثانول والإيثانول والكلوروفورم والهكسان أو اثير البترول (نقطة الغليان 40-60 درجة مئوية أو 60-80 درجة مئوية) (5 مل؛ HPLC الصف) لمدة 2 إلى 20 دقيقة.
  2. إزالة أوراق الشجر وتجف تماما قبالة المذيبات عن طريق التبخر الدوارة.
  3. عينات resuspend في الهكسان (1 مل؛ HPLC الصف).
  4. إجراء تحليل GC-MS باستخدام كروماتوغرافيا الغاز والواصلة إلى 5973MSD. وينبغي أن تكون ظروف التشغيل على النحو التالي؛ الغاز الناقل، الهيليوم مع معدل تدفق 0.9 مل دقيقة -1/11 رطل. حقن عينات (1 ميكرولتر) مع حاقن splitless عند 280 درجة مئوية. عقد الفرن اللوني للغاز عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل التعلية في 4 درجات مئوية / دقيقة إلى 320 درجة مئوية. عقد درجة الحرارة النهائية ل10 دقيقة أخرى، مما يجعل الوقت ما مجموعه 67.5 دقيقة. تعيين واجهة مع MS عند 280 درجة مئوية وعerform في وضع MS مسح كامل باستخدام 70 فولت + EI ومسحها 10-800 D.
  5. في البداية معالجة مكونات اللوني بواسطة deconvolution الآلي MS ونظام تحديد الهوية، وتلك التي يتم تحديدها باستخدام مكتبة MS نيست 98.
  6. تأكيد تحديد سلسلة الهيدروكربونات المشبعة ألكان طويلة (hexacosenol، نوناكوزان، triacontane، octacosenol، nonacosonal، hentriacontane، dotriacontane وtritriacontane) بمقارنة مرات الاحتفاظ وأنماط تجزئة الكلاسيكية إلى المعايير الأصيلة المعروفة.
  7. تحديد الهيدروكربونات كميا بمقارنة المناطق الذروة متكاملة مع منحنيات الاستجابة للجرعة (،07-2،5 ملغ)، شيدت من معايير أصيلة.
  8. حساب الوسائل والخطأ المعياري وسائل (SEM) باستخدام برنامج إكسل.

7. تحليل Isoprenoids 14

  1. أداء التجانس كما هو موضح في القسم 2. زن في 10 ملغ من تجميد المجفف مسحوق المتجانس في أنبوب الطرد المركزي.
  2. إضافة بالتسلسل 250 مل الميثانول على مسحوق، ومزجها، ثم يضاف 500 مل كلوروفورم (مختبر كاشف الصف)، ومزجها من قبل vortexing.
  3. ترك العينات على الجليد في الظلام لمدة 20 دقيقة.
  4. إضافة 250 مل تريس، حمض الهيدروكلوريك العازلة (100 ملي، ودرجة الحموضة 7.5) أو الماء (HPLC الصف) إلى تعليق ومزيج من قبل vortexing.
  5. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 12،000 دورة في الدقيقة (13،523 x ج) لمدة 5 دقائق لفصل قطبي من المراحل المائية. المرحلة الكلوروفورم غير القطبية التي تحتوي على مقتطفات isoprenoid هو في القاع.
  6. نقل المرحلة إلى أنبوب الطرد المركزي الجديدة.
  7. إضافة 500 مل إضافية كلوروفورم إلى المرحلة المائية، وإجراء الاستخراج الثاني دوامة والطرد المركزي كما هو موضح أعلاه.
  8. الجمع بين مستخلصات الكلوروفورم وتقديم عينات للجفاف باستخدام المبخر وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى التحليل.
  9. إضافة 50 مل خلات الإيثيل (HPLC الصف) لاستخراج isoprenoid المجففة لتنحل هذه المادة.
  10. ضخ 3 مل الصعود إلى C18 العمود باستخدام وحدة فصل UPLC ACQUITY. وينبغي أن تتضمن التدرج تستخدم لفصل المواد الملونة؛ ج: الميثانول / H 2 0 (50:50) وB: خلات أسيتونتريل / الإيثيلي (75:25)، والظروف الأولية وينبغي أن يكون 30٪ (ت / ت) وب 70٪ (ت / ت) ذاهب الى 100 ٪ B أكثر من 6 دقائق. استخدام معدل تدفق 0.6 مل / دقيقة.
  11. رصد شطافة باستمرار مع مجموعة صور ديود (PDA) كاشف 250-600 نانومتر.
  12. تحديد المكونات التي كتبها المشارك اللوني والطيفي المقارنات بين المعايير الأصيلة، وبيتا كاروتين (طليعة الفيتامين A)، phytoene، الليكوبين، وتين وزياكسانثين.
  13. أداء الكمي من منحنيات الاستجابة للجرعة.
  14. تأكيد المركبات باستخدام LC-MS؛ استخدام الظروف الكروماتوغرافي مماثلة. وينبغي أن يتم الكشف باستخدام APCI تأين في وضع إيجابي بأداة Q-TOF.
  15. القيام التعديلات لتحديد توكوفيرول مع المواد المجففة تجميد 25 ملغ التي تم استخراجها والتصبين في 6٪ KOH عند 50 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.

الطبقة = "jove_title"> 8. استخراج الحمض النووي الريبي RNA تسلسل ل

هذا البروتوكول يجمع Trizol استخراج الحمض النووي الريبي مع مجموعة RNeasy للحصول على الحمض النووي الريبي جودة عالية.

  1. طحن 100 ملغ من المواد النباتية المجمدة في 2 مل أنابيب الطرد المركزي مع الكرة المعدنية بنسبة طاحونة خلاط.
  2. إضافة 1 مل Trizol.
  3. أجهزة الطرد المركزي في المواد لمدة 10 دقيقة في 12،000 XG في 4 درجات مئوية.
  4. نقل طاف في أنبوب رد فعل جديدة.
  5. إضافة 200 ميكرولتر كلوروفورم، عكس الأنبوب عدة مرات، واحتضان 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. أجهزة الطرد المركزي لهذا المزيج لمدة 15 دقيقة في 12،000 XG في 4 درجات مئوية.
  7. نقل المرحلة المائية العليا (حوالي 700 ميكرولتر) في أنبوب رد فعل جديدة.
  8. إضافة حوالي 2.5 أحجام من الإيثانول (100٪)، عكس الأنبوب عدة مرات، واحتضان لمدة 30 دقيقة في -80 درجة مئوية.
  9. نقل العينة بما في ذلك أي راسب إلى عمود الدوران من عدة.
  10. أجهزة الطرد المركزي العمود لمدة 15 ثانية في 8000 x ج، وتجاهل ومنخفضة من خلال.
  11. إضافة 700 ميكرولتر العازلة RW1 إلى عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 8،000 ز س. تجاهل التدفق من خلال.
  12. إضافة 500 ميكرولتر العازلة RPE إلى العمود تدور أجهزة الطرد المركزي والعمود لمدة 15 ثانية في 8،000 ز س. تجاهل التدفق من خلال.
  13. إضافة 500 ميكرولتر العازلة RPE إلى عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 8،000 ز س.
  14. وضع عمود الدوران إلى أنبوب جديد 1.5 مل التفاعل وإضافة 50 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية المياه.
  15. أجهزة الطرد المركزي العمود لمدة 1 دقيقة في 8،000 x ج لأزل الحمض النووي الريبي.
  16. إزالة الحمض النووي المتبقية باستخدام كيت خالية من الحمض النووي AMBION وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  17. تحديد نوعية الحمض النووي الريبي. يجب أن يكون الحمض النووي الريبي أرقام سلامة الحمض النووي الريبي (رين) أعلاه 8.
  18. إرسال قبالة الحمض النووي الريبي للجيل القادم التسلسل.

Representative Results

الملف الشخصى HPLC في الشكل 1 يبين نتيجة ممثل تحليل isoprenoid من N. مقتطفات ورقة glauca. تم الكشف عن isoprenoids مختلفة من C40 وأعلاه باستخدام صفيف ديود صور (PDA) كاشف. تم المشروح قمم على أساس التعاون اللوني والمقارنة بين المعايير الطيفية أصيلة، بيتا كاروتين (طليعة الفيتامين A)، phytoene، الليكوبين، وتين وزياكسانثين. والاستشرابية MS اثنين في الشكل 2 تظهر نتيجة تحليل المستقلب الرئيسي من N. ورقة glauca والمواد الجذعية، على التوالي. يظهر يعطى أيضا الطيف MS من ذروة الموافق سيرين (المشار إليها بواسطة السهم) كمثال. الشكل 3 Bioanalyzer تستخدم لتحديد نوعية الحمض النووي الريبي وإخراج ممثل من الجهاز. قمم الرئيسيان في اللوني الموافق 18 S و 25 S الريباسي الحمض النووي الريبي، مشيرا إلى الحمض النووي الريبي سليمة في العينة. قمم إضافية من ضلع مجزأةويبدو osomal الحمض النووي الريبي في حالة الحمض النووي الريبي المتدهورة جزئيا أو بشكل كبير.

الشكل 1
الشكل 1. الشخصى HPLC تظهر isoprenoids موجودة في مقتطفات من ورقة N. glauca. معظم isoprenoids من C40 وأعلاه ليست قابلة للتحليل GC-MS. لذا كنا فصل HPLC مع الكشف عن مجموعة الضوئي. ويرد اللوني نموذجية سجلت في 450 نانومتر. أصباغ الكاروتين هي نموذجية من الأنسجة الضوئي مع غلبة اللوتين. الحاضر أيضا وزياكسانثين، والتي نادرا ما وجدت في الأنسجة ورقة إلا إذا وضعت تحت الضغط ضوء ارتفاع. مستويات زياكسانثين جعله مصدرا جيدا لهذا المركب عالية القيمة. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر الخامسersion من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. اللوني وMS الطيف من N. ويرد glauca مقتطفات الأنسجة. إجمالي أيون MS اللوني (TIC) من ورقة ووقف مقتطفات تقاس GC-MS (70-600 م / ض). تم إجراء تحليل GC-MS كما هو موضح سابقا في 15. تم الكشف عن المشروح قمم باستخدام مكتبة علامات الطيفية الشامل. ويرد MS الطيف من سيرين (2TMS) كمثال. MS اللوني: محور X ومحور Y تشير الوقت الاحتفاظ (دقيقة) وكثافة (وفرة) للإشارة، MS الطيف: محور X ومحور Y تشير إلى نسب M / Z وكثافة (وفرة) للإشارة، على التوالي. انقر هنا لعرض أكبرالصورة.

الرقم 3
الرقم 3. قياس Bioanalyzer من الحمض النووي الريبي التي أعدت ليليها من الحمض النووي الريبي N. المواد ورقة glauca. للحصول على الحمض النووي الريبي نقية للغاية اللازمة ليليها RNA نحن استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام Trizol كاشف وتنقيته من الحمض النووي الريبي باستخدام أعمدة من عدة RNeasy البسيطة (في Qiagen، هيلدن، ألمانيا) في وقت لاحق. نحن مصممون على نوعية الحمض النووي الريبي باستخدام Bioanalyzer (اجيلنت، Waldbronn، ألمانيا) المعروضة على اليسار. ويرد مثال على الناتج Bioanalyzer على اليمين. قمم الرئيسيان في العينة تمثل 18 S و 25 S الريباسي الحمض النووي الريبي. وأظهرت عينة الحمض النووي الريبي لدينا عدد النزاهة (رين) من 9.2، وهو أعلى بكثير من القيمة المطلوبة من 8. اضغط لهاالبريد لمشاهدتها بشكل اكبر.

Discussion

البروتوكولات المعروضة هنا توفر إطارا شاملا لتحليل أوراق شجرة التبغ لنواتج الأيض والنصوص. ومن المتوقع أن هذه الجهود مجتمعة أن تقدم لنا رؤى جديدة في العمليات التي يستند إليها التوليف وقذف من الهيدروكربونات والمركبات عالية القيمة موجودة في هذا النسيج. لذا ينبغي لهذه النهج تعطينا فهما أفضل لكيفية يتم توليفها المركبات. بالإضافة إلى الجوانب شجرة التبغ من العمل، ويهدف أيضا إلى تحسين الكتلة الحيوية الحور، وخاصة استهداف lignification هيكل الجدار الثانوي، ولكن أيضا لاستكشاف ما إذا كنا نستطيع استخدام لحاء لاستخراج المركبات قيمة.

الطرق الواردة في هذه الورقة هي تعديلات طفيفة من أساليب موحدة لالتنميط المستقلب. هذه الأساليب هي محدودة بطبيعة الحال لمحات التمثيل الغذائي المعروفة، وأنه من الممكن أن عدة قمم جديدة الأيضية يمكن الحصول على لثhich لا يعرف المجمع. نأمل أن وضع هذه المركبات في السياق إلى نواتج أخرى من خلال الجمع بين سلوك الأيض والنصوص على مدى سلسلة زمنية التنموية.

أيا من الأساليب المعروضة هنا يتم تغيير ملحوظ من الطرق التي تستخدم عادة لمواد النبات. الجانب المثير يكمن في مزيج من الأساليب لفهم الإطار الأساسي لإنتاج سلسلة طويلة الهيدروكربونية أساسا والتعديل في أوراق شجرة التبغ. واحدة من الخطوات الحاسمة للحصول على هذه المعلومات هي مزيج لاحقة من أنواع بيانات مختلفة. نحن نتصور أنه سيتم تقسيم البيانات على التقييم الأول إلى مجموعات مختلفة على أساس سلوك الأيض / النصوص على التنمية والتي سيتم استخدامها هذه البيانات للاستدلال نص مقابل السلوكيات الأيض، وأيضا يحتمل أن تكون لتعيين بعض نواتج الأيض لمسارات . بالإضافة إلى ذلك، يتم التحليلات المستندة إلى شبكة أكثر تفصيلا ثم تصور رس استغلال العلاقات السببية.

سوف البروتوكولات التحليلية المقدمة هنا أيضا توفير أساس للالتجارب الميدانية والاستغلال الصناعي من الكتلة الحيوية. لإنجاز هذا، وكونسورتيوم MultiBioPro يحتوي على العديد من الشركاء الصناعيين التي لديها القدرة على مواصلة استكشاف الكتلة الحيوية، وذلك بهدف توفير وقود الديزل الحيوي، الإيثانول والمركبات عالية القيمة الأخرى. وسيتم تقييم هذه الأنواع من استغلال الكتلة الحيوية على أساس؛ (1) اختبار متانة وجودة المنتجات الحيوية المنتجة (سيتم تنفيذ اختبارات نموذجية معيار الصناعة خارج لضمان المنتجات المولدة لها قيمة جيدة في السوق)، (2)، سيتم تنفيذ تقييم الاقتصادية والاجتماعية والبيئية للتكنولوجيات باستخدام مصادر الأدب والمقابلات والمواد التي يتم إنشاؤها أثناء التجارب الميدانية وتقييم معامل تكرير أحيائية محطة تجريبية. وسوف تشمل هذه الأنشطة التكاليف والفوائد وتحليل دورة الحياة، وجيل من ملف البيئة والسوق وفي busineاستراتيجيات ق ق. ونحن نعتقد أن هذا الخط سوف تصبح مزيجا مفيدا من الأوساط الأكاديمية، والعلوم التطبيقية والاستغلال الصناعي للمزيد من الحور والتبغ الكتلة الحيوية شجرة للمنتجات المستهلك النهائي.

Disclosures

تلقت البحوث التي تؤدي إلى هذه النتائج على تمويل من البرنامج الإطاري السابع الأوروبية ([FP7/2007-2013]) بموجب اتفاقية منحة رقم 311804.

Acknowledgments

سوف MultiBioPro أود أن أشكر الشعب التالية التي تساهم أيضا في المشروع: دومينيك سوينتون (الوقود الأخضر)، وتوماس لوري (الوقود الأخضر)، وسام Buekenhout (Capax)، وسيلفيا Drouven (Capax).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizol reagent Invitrogen 15596-026
Chloroform Merck 102445
Ethanol Merck 101986
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
TURBO Dnase Invitrogen AM2238
RNA 6000 Nano Kit Agilent G2938-90034
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Agilent G2939AA
1.5 ml and 2 ml safe-lock tubes Eppendorf 0030 120.086, 0030 120.094
Steel balls Geyer Berlin GmbH VA2mm
Mixer mill MM 300 Retsch YO-04182-09
Microcentrifuge Eppendorf 5424

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, J. H., et al. chemistry, biofuels, and biorefinery. Annu Rev Chem Biomol Eng. 3, 183-207 (2012).
  2. Carroll, A., Somerville, C. Cellulosic biofuels. Annu Rev Plant Biol. 60, 165-182 (1146).
  3. Vanholme, B., et al. Towards a carbon-negative sustainable bio-economy. Front Plant Sci. 4, (2013).
  4. United Nations Environment Programme (UNEP). Global Environment Outlook: Environment for Development. 4, UNEP. New York. (2007).
  5. Boerjan, W. Biotechnology and the domestication of forest trees. Curr Opin Biotechnol. 16 (2), 159-166 (2005).
  6. Curt, M. D., Fernández, J. Production of Nicotiana glauca R.C. Graham aerial biomass in relation to irrigation regime. Biomass. 23 (2), 103-115 (1990).
  7. De Vos, R. C. H., et al. Untargeted large-scale plant metabolomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (4), 778-791 (2007).
  8. Smith, C. A., et al. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using Nonlinear peak alignment, matching, and identification. Anal Chem. 78 (3), 779-787 (2006).
  9. Morreel, K., et al. Mass spectrometry-based fragmentation as an identification tool in lignomics. Anal Chem. 82 (19), 8095-8105 (2010).
  10. Morreel, K., et al. Mass spectrometry-based sequencing of lignin oligomers. Plant Physiol. 153 (4), 1464-1478 (1104).
  11. Tohge, T., Fernie, A. R. Web-based resources for mass-spectrometry-based metabolomics: A user's guide. Phytochemistry. 70 (4), 450-456 (2009).
  12. Tohge, T., Fernie, A. R. Combining genetic diversity, informatics and metabolomics to facilitate annotation of plant gene function. Nat Protoc. 5 (6), 1210-1227 (2010).
  13. Mortimer, C. L., et al. The identification and rapid extraction of hydrocarbons from Nicotiana glauca: a potential advanced renewable biofuel source. Phytochem Lett. 5 (3), 455-458 (2012).
  14. Fraser, P. D., et al. Application of high-performance liquid chromatography with photodiode array detection to the metabolic profiling of plant isoprenoids. Plant J. 24 (4), 551-558 (2000).
  15. Lisec, J., et al. Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nat Protoc. 1 (1), 387-396 (2006).

Tags

العلوم البيئية، العدد 87، علم النبات، النباتات، Biorefining، الحور، شجرة التبغ، نبات الأرابيدوبسيس، سوبيرين، اللجنين، جدران الخلايا، والكتلة الحيوية، والهيدروكربونات طويلة السلسلة، isoprenoids،

Erratum

Formal Correction: Erratum: Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry
Posted by JoVE Editors on 06/30/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry.

There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:

Juan Pedro Navarro

to:

Juan Navarro-Aviñó

نص والمستقلب التنميط لتقييم شجرة التبغ والحور كمادة وسيطة لصناعة القائمة على الحيوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruprecht, C., Tohge, T., Fernie, A., … More

Ruprecht, C., Tohge, T., Fernie, A., Mortimer, C. L., Kozlo, A., Fraser, P. D., Funke, N., Cesarino, I., Vanholme, R., Boerjan, W., Morreel, K., Burgert, I., Gierlinger, N., Bulone, V., Schneider, V., Stockero, A., Navarro-Aviñó, J., Pudel, F., Tambuyser, B., Hygate, J., Bumstead, J., Notley, L., Persson, S. Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry. J. Vis. Exp. (87), e51393, doi:10.3791/51393 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter