Transcript en Metabolite Profiling voor de Evaluatie van de Boom en Poplar Tabak als grondstof voor de bio-gebaseerde industrie

Summary

Plantaardige biomassa biedt een hernieuwbare grondstof voor meerdere producten, waaronder brandstof, diervoeders, levensmiddelen en een verscheidenheid aan materialen. In deze paper onderzoeken we de eigenschappen van de boom tabak (Nicotiana glauca) en populier als geschikte bronnen voor een bioraffinage pijplijn.

Abstract

De wereldwijde vraag naar voedsel, veevoer, energie en water vormt buitengewone uitdagingen voor de toekomstige generaties. Het is duidelijk dat robuuste platforms voor de exploratie van hernieuwbare hulpbronnen die nodig zijn om deze uitdagingen te overwinnen zijn. Binnen het multinationale kader MultiBioPro wij ontwikkelen bioraffinage pijpleidingen naar het gebruik van plantaardige biomassa maximaliseren. Meer in het bijzonder, maken we gebruik van populier en boom tabak (Nicotiana glauca) als doelwit gewas voor het verbeteren van versuikering, isoprenoide, lange inhoud keten koolwaterstof, vezels kwaliteit en suberine en lignine inhoud. De methoden die worden gebruikt om deze uitgangen te bereiken onder andere GC-MS, LC-MS en RNA sequencing platforms. De metaboliet leidingen zijn goed ingeburgerd tools waarmee dit soort gegevens te genereren, maar ook de beperkingen die alleen goed gekarakteriseerd metabolieten worden gebruikt. De diepe sequencing zal ons toelaten om alle transcripten aanwezig tijdens de ontwikkelingsstadia van de boom tabaksbladeren, maar h bevattenzo worden toegewezen naar de sequentie van Nicotiana tabacum. Met deze set-ups, richten we ons op een fundamenteel begrip van de onderliggende processen en bij de oprichting van een industrieel kader om de resultaten te exploiteren. In een meer lange termijn, zijn wij van mening dat de gegevens die hier gegenereerd middelen zal zorgen voor een duurzame bioraffinage proces met behulp van populier en tabak boom als grondstof. Om de basale niveau van metabolieten dateren in de monsters zijn geanalyseerd en de protocollen gebruikt worden in dit artikel.

Introduction

Bevolking en de economische groei hebben een toenemende vraag naar voedsel, water en brandstoffen veroorzaakt. Een groot deel van deze voorraden worden geproduceerd, verwerkt en vervoerd met behulp van eindige fossiele middelen, zoals aardolie. Het is echter duidelijk dat deze praktijk is niet duurzaam, en de ontwikkeling van alternatieve middelen zal daarom van groot belang ^1. Veel hernieuwbare bronnen zijn, in verschillende mate, momenteel wordt uitgebuit, waaronder wind, water beweging, zon, aardwarmte, en golf gebaseerd energiebronnen. Een ander duurzaam en grotendeels onontgonnen bron is de biomassa van planten. Deze bron biedt ook een zeer kosteneffectieve manier om zonne-energie omzetten in afgeleide brandstoffen ^2. Naast het bieden van bio-gebaseerde brandstof, de plantaardige biomassa biedt ook unieke mogelijkheden voor alternatieve producten, zoals plastics, wasmiddelen, en waardevolle chemicaliën.

De celwand plant, die grotendeels uit suiker gebaseerde polymeren, MAKes het grootste deel van de biomassa van de plant en veel inspanning wordt momenteel geïnvesteerd in de efficiënte omzetting naar bio-ethanol. De resterende biomassa kan vervolgens worden verwerkt tot biogas en olie-gerelateerde producten ^3. Een groot deel van de overblijvende plant soorten, waaronder grassen en bomen, die grote hoeveelheden van cellulosehoudende biomassa te produceren meestal groeien het best in de gematigde zones. Echter, ongeveer 20% van het landoppervlak is semi-aride, en is daarom ook gevoelig voor droogte ^4. Uiteraard, zou het interessant zijn om ook cultiveren deze droge gronden met planten die effectief kunnen bijdragen aan de duurzame productie van energie en materiaal. Deze planten moeten een optimale efficiëntie van watergebruik en droogte weerstand hebben en zou de boom tabak (Nicotiana glauca) en soorten uit het geslacht Agave bevatten.

De MultiBioPro consortium streeft naar een geïntegreerde bioraffinage pijplijn uit te voeren, met behulp van de twee belangrijke crop soorten, populier en boom tabak. Populier heeft ontpopt als een veelbelovende biobrandstof gewas als het groeit snel, gemakkelijk klonaal gepropageerd en zeer aanpasbaar aan een breed scala van klimaat en de bodemgesteldheid. Het biedt ook een breed scala van hout, vezels, brandstof hout en andere bosproducten ^5. De boom tabak is ook naar voren gekomen als een geschikte plant voor biobrandstoffen en bioraffinage doeleinden. Het produceert kenmerkend aanzienlijke hoeveelheden biomassa, bevat grote hoeveelheden niet-structurele koolhydraten ^6, en heeft ook de zeldzame mogelijkheid om grote hoeveelheden van gemakkelijk extraheerbare eetbare olie (lange keten C _{29-C 31} verzadigde koolwaterstoffen en triterpenoïden) die geschikt zijn voor biodiesel accumuleren productie. De boom tabak is bovendien vatbaar voor genetische verbetering, heeft een hoge capaciteit kiemen, en groeit gelukkig op semi-aride gronden niet voor de voedselproductie. Het blijkt dan ook dat zowel de populier en de boom tabak intrinsieke potentieel voor multipOEL gewassen, dwz als nieuwe hoogwaardige grondstoffen voor een integratieve biogebaseerde industrie. In dit artikel richten we ons op diverse reeks benaderingen onderscheiden hoe tabak boom deposito lange keten koolwaterstoffen.

In een poging om de onderliggende moleculaire mechanisme verantwoordelijk voor de productie en secretie van de verzadigde lange-keten koolwaterstoffen voor tabaksbladeren identificeren we moderne "omica" gebaseerde technologieën toepassen. Dit omvat RNA volgende van een ontwikkelingsstoornis bladreeks (tien etappes), en multiplatform metaboliet profilering benadert via LC-en GC-MS (voor polaire en niet-polaire metabolieten en lipidomics). Deze gegevens worden gebruikt om delven genexpressie die correleert met of vooraf gaat, treedt de biosynthese van de bovengenoemde moleculen. Genen en wegen die veelbelovend uit deze inspanningen lijken zullen worden gebruikt voor functionele testen in het model soort Arabidopsis en kon uiteindelijk vatbaar voor biotechnologische techniek in tob zijnAcco boom.

Protocol

1. Plant Material

Grow Nicotiana glauca planten in 30 cm diameter potten met M2 professionele groeimedium. Groeien planten in kassen, met een dagtemperatuur van 20-25 ° C en nachtelijke temperatuur van 15 ° C. Gebruik een 16 uur licht en 8 uur donker cyclus als aanvullend licht regime.

2. Monstervoorbereiding

1. Voor primaire metabolieten:
   1. Oogst plantaardige materialen (bladeren en stengels van N. glauca) en vries materiaal onmiddellijk.
   2. Lyofiliseren bevroren plantaardige materialen door vriesdrogen voor drie dagen.
   3. Grind gevriesdroogde monsters door mixer molen met metalen ballen.
   4. Portie fijn gemalen droge materialen in een 2 ml centrifugebuis of glazen flacon.
2. Voor secundaire metabolieten:
   1. Oogst plantaardige weefsels en vries materiaal onmiddellijk.
   2. Grind bevroren plantenweefsel door mIxer molen met roestvrij stalen kogel of door mortier en een stamper.
   3. Aliquot fijngeslepen weefsels in 2 ml centrifugebuis (ongeveer 20 mg nat gewicht).

3. Extraction Protocol voor Metabolite Profiling voor primaire metabolieten met behulp van GC-MS

1. Portie gemalen droog plantaardig materiaal (10 mg blad en 20 mg van stamcellen materialen) in 2 ml, schroefdop, ronde bodem buizen.
2. Voeg 1.400 ul 100% methanol en vortex gedurende 10 seconden.
3. Voeg 60 ul van ribitol (0,2 mg / ml voorraad in _H2O) als interne standaard kwantitatieve en vortex gedurende 10 seconden.
4. Voeg een roestvrij staal (of zirkonia) bal en homogeniseren materiaal met een Kogeltrilmolen gedurende 2 minuten bij 25 Hz.
5. Centrifugeer het mengsel gedurende 10 min bij 11.000 x g.
6. Breng de bovenstaande om een ​​glazen flesje.
7. Voeg 750 ul van chloroform.
8. Voeg 1500 pl _H2O en vortex het mengsel gedurende 10 sec.
9. Breng 150 pi van hetbovenste fase (polaire fase) in een schoon 1,5 ml centrifugebuis.
10. Droge monsters met behulp van een Speed ​​Vac. Het is noodzakelijk dat de monsters drooggedampt van tussen 3 en 24 uur totdat geen restvloeistof aanwezig is.
11. Voeg 40 ul van methoxyamine hydrochloride (20 mg / ml in pyridine).
12. Schud het mengsel in een horizontale verwarmingsblok schudder gedurende 2 uur bij 37 ° C.
13. Voeg 70 ul N-methyl-N - (trimethylsilyl)-trifluoraceetamide MSTFA mix.
14. Schud het mengsel gedurende 2 uur bij 37 ° C.
15. Spin down de druppels op de cover van een kort centrifugeren ~ 1 min bij 11.000 x g.
16. Breng de vloeistof in glazen flesjes geschikt voor GC-MS-analyse.

4. Extraction voor Metabolite Profiling voor secundaire metabolieten met LC-MS

1. Voeg 500 ul methanol om de bevroren grond monsters.
2. Schud met een thermomixer gedurende 15 minuten bij 70 ° C (1.000 sec ^-1).
3. Centrifugeer de monsters (5 min, 20.000 xg) en de vloeibare fase overgebracht naar een 1,5 ml centrifugebuis.
4. Lyofiliseren de vloeibare fase met een centrifugale verdamper (speedvac).
5. Voeg 100 ul cyclohexaan en 100 ul milliQ water aan de droge pellet.
6. Schud de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (gebruik vortex).
7. Centrifugeer de monsters (5 minuten, 20.000 xg).
8. Overdracht 80 ul van de waterfase (onderste fase) aan LC-MS injectieflacons met conische bodem voor LC-MS analyse.

5. Data Analysis

1. Configureren Xcalibur, MarkerLynx, Metalign ⁷ of XCMS ⁸ en selecteer de data-analyse te verwerken.
2. Maak een tabel van de gedetecteerde pieken van uw interesse in overeenstemming met klasse verbindingen in tabel 1.
3. Identificeer pieken door co-elutie van standaardverbindingen.
4. Vervolgens annoteren gedetecteerd pieken met MSN-analyse, structurele karakterisering algoritmen ^9,10, literatuur survey en metaboliet databaseonderzoek ^11,12.

6. Koolwaterstoffenanalyse Extraction ¹³

1. Dompel vers geoogste N. glauca bladeren (~ 200 mg) in een oplosmiddel (methanol, ethanol, chloroform, hexaan of petroleumether (kookpunt 40-60 ° C of 60-80 ° C) (5 ml, HPLC-kwaliteit) gedurende 2 tot 20 minuten.
2. Verwijder de bladeren en droog af oplosmiddelen volledig door roterende verdamping.
3. Hersuspenderen monsters in hexaan (1 ml; HPLC-kwaliteit).
4. Voer GC-MS-analyse met behulp van gaschromatografie en afgebroken tot een 5973MSD. Bedrijfsomstandigheden dienen als volgt te zijn; dragergas helium met een stroomsnelheid van 0,9 ml min ^-1 / 11 psi. Injecteer monsters (1 pi) met een splitless injector bij 280 ° C. Houd de gaschromatografische oven bij 70 ° C gedurende 5 minuten voor aanlopen bij 4 ° C / min tot 320 ° C. Houd de eindtemperatuur gedurende 10 min, wat een totale tijd van 67,5 minuten. Stel de interface met de MS bij 280 ° C en perform MS in volledige scan met 70 eV EI + en gescand 10-800 D.
5. Aanvankelijk verwerken het chromatogram componenten door geautomatiseerde MS deconvolutie en identificatiesysteem, en degenen die zijn geïdentificeerd met behulp van het NIST 98 MS bibliotheek.
6. Bevestig de identificatie van verzadigde lange keten alkaan koolwaterstoffen (hexacosenol, nonacosaan, triacontane, octacosenol, nonacosonal, hentriacontane, dotriacontane en tritriacontane) door retentietijden en klassieke fragmentatiepatronen vergelijken met bekende authentieke normen.
7. Bepaal kwantitatief koolwaterstoffen door vergelijking geïntegreerde piekoppervlakten de dosis respons curven (0,07 tot 2,5 mg), gemaakt van authentieke standaarden.
8. Bereken middelen en standaardafwijking van de middelen (SEM) met behulp van Excel software.

7. Analyse van Isoprenoïden ¹⁴

1. Voer homogenisatie zoals beschreven in paragraaf 2. Weeg 10 mg gehomogeniseerd gevriesdroogd poeder in een centrifugebuis.
2. Voeg achtereenvolgens 250 ml methanol op het poeder, meng het, voeg dan 500 ml chloroform (laboratorium pa), en meng het door vortexen.
3. Laat de monsters op ijs in het donker gedurende 20 minuten.
4. Voeg 250 ml Tris-HCl buffer (100 mM, pH 7,5) of water (HPLC-kwaliteit) om de schorsing en door vortexen gemengd.
5. Centrifugeer het mengsel bij 12.000 rpm (13.523 x g) gedurende 5 minuten om de polaire scheiden van waterige fasen. De polaire chloroform fase die isoprenoïde extracten onderaan.
6. Breng de fase naar een nieuwe centrifugebuis.
7. Voeg nog eens 500 ml chloroform aan de waterfase, en voeren een tweede extractie van vortex en centrifugeren zoals boven beschreven.
8. Combineer de chloroformextracten en breng de monsters droog met de verdamper en bewaar bij -20 ° C tot analyse.
9. Voeg 50 ml ethylacetaat (HPLC-kwaliteit) aan het gedroogde extract isoprenoïde het materiaal opnieuw op te lossen.
10. Injecteer 3 ml op een C18kolom met een UPLC Acquity scheiding module. De gradiënt wordt gebruikt om de pigmenten te scheiden moet bevatten; A: methanol / H ₂ 0 (50:50) en B: acetonitril / ethylacetaat (75:25), en beginvoorwaarden moet een 30% (v / v) en B 70% (v / v) naar 100 % B meer dan 6 minuten. Gebruik een stroomsnelheid van 0,6 ml / min.
11. Bewaak het eluaat constant met een Photo Diode Array (PDA) detector 250-600 nm.
12. Componenten te identificeren door co-chromatografie en spectrale vergelijkingen tussen authentieke normen, Bèta-caroteen (pro-vitamine A), fytoeen, lycopeen, luteïne en zeaxanthine.
13. Voer kwantificering van dosis-respons curves.
14. Bevestig verbindingen met behulp van LC-MS; gebruiken gelijkaardige chromatografische omstandigheden. Opsporing te worden gedaan met behulp van APCI ionisatie in positieve modus met een Q-Tof instrument.
15. Doe de wijzigingen voor tocoferol bepaling met 25 mg gevriesdroogd materiaal dat is gewonnen en verzeping in 6% KOH bij 50 ° C gedurende 1,5 uur.

Dit protocol combineert Trizol RNA-extractie met een RNeasy kit van hoge kwaliteit RNA te verkrijgen.

1. Maal 100 mg van bevroren plantmateriaal in 2 ml centrifuge buizen met een metalen bal door een mixer molen.
2. Voeg 1 ml Trizol.
3. Centrifugeer het materiaal gedurende 10 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C.
4. Breng de bovenstaande in een nieuwe reactie buis.
5. Voeg 200 ul chloroform, keer de buis een paar keer, en incubeer 3 min bij kamertemperatuur geroerd.
6. Centrifugeer het mengsel gedurende 15 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C.
7. Breng de bovenste waterige fase (ongeveer 700 pl) in een nieuwe reactiebuis.
8. Voeg ongeveer 2,5 volumes ethanol (100%), keer de buis een paar keer, en incubeer gedurende 30 minuten bij -80 ° C.
9. Verplaats de steekproef inclusief eventueel neerslag de spin kolom van kit.
10. Centrifugeer de kolom voor 15 sec bij 8.000 xg en de f gooilaag door.
11. Voeg 700 ul buffer RW1 de spin kolom en centrifugeer 15 sec bij 8.000 x g. Gooi de stroom door.
12. Voeg 500 ul buffer RPE de spin kolom en centrifugeer de kolom voor 15 sec bij 8.000 x g. Gooi de stroom door.
13. Voeg 500 ul buffer RPE de spin kolom en centrifugeer gedurende 2 min bij 8.000 x g.
14. Plaats de spin kolom in een nieuwe 1,5 ml reageerbuisje en voeg 50 ul-RNase vrij water.
15. Centrifugeer de kolom gedurende 1 min bij 8000 xg om het RNA te elueren.
16. Resten DNA met een Ambion DNA-vrije kit volgens de instructies van de fabrikant.
17. Bepaal de kwaliteit van het RNA. Het RNA zou RNA integriteit nummers (RIN) hebben boven 8.
18. Stuur van de RNA voor de volgende generatie sequencing.

Representative Results

De HPLC-profiel in figuur 1 toont een representatief resultaat van de analyse van isoprenoïde N. glauca bladextracten. De verschillende isoprenoïden van C40 en hoger werden gedetecteerd met behulp van een Photo Diode Array (PDA) detector. De pieken werden geannoteerd op basis van co-chromatografie en spectrale vergelijking tussen authentiek normen, Bèta-caroteen (pro-vitamine A), fytoeen, lycopeen, luteïne en zeaxanthine. De twee MS chromatogrammen in figuur 2 tonen de resultaten van de primaire metaboliet analyse van N. glauca blad en stengel materiaal, respectievelijk. De MS spectrum van een piek serine (aangegeven door een pijl) wordt ook gegeven als voorbeeld. Figuur 3 toont de Bioanalyzer gebruikt om de kwaliteit van het RNA en een representatieve uitvoer van het systeem. De twee pieken in het chromatogram overeenkomend met 18 S en 25 S ribosomaal RNA, wat aangeeft intact RNA in het monster. Extra toppen van gefragmenteerde ribosomal RNA lijkt in het geval van gedeeltelijk of zwaar gedegradeerde RNA.

Figuur 1. HPLC-profiel waarin isoprenoïden aanwezig in bladextracten van N. glauca. meeste isoprenoïden van C40 en hoger zijn niet vatbaar voor GC-MS analyse. Daarom gebruikte HPLC scheidingen met fotodiode detectie. Een chromatogram geregistreerd bij 450 nm wordt getoond. De carotenoïde pigmenten zijn typerend voor fotosynthetische weefsels met luteïne overheersen. Ook aanwezig is zeaxanthine, die zelden wordt aangetroffen in bladweefsel tenzij onder hoge licht onder druk gezet. De niveaus van zeaxanthine maken het een goede bron van deze hoogwaardige verbinding. Klik hier om een grotere v bekijkenersion van dit cijfer.

Figuur 2. MS chromatogram en spectrum van N. glauca weefsel extracten. Totaal ionen-MS chromatogram (TIC) van het blad en de steel extracten gemeten met GC-MS wordt gepresenteerd (70-600 m / z). GC-MS analyse werd uitgevoerd zoals eerder beschreven ^15. Gedetecteerde pieken werden geannoteerd met de massaspectrale labels bibliotheek. MS spectrum van serine (2TMS) wordt getoond als een voorbeeld. MS chromatogram: X-as en Y-as geven retentietijd (min) en intensiteit (overvloed) van het signaal, MS spectrum: X-as en Y-as geven de M / Z verhouding en de intensiteit (overvloed) van het signaal, respectievelijk. Klik hier voor vergrotingafbeelding.

Figuur 3. Bioanalyzer meting van RNA bereid RNA volgende van N. glauca bladmateriaal. om hoogzuivere RNA nodig voor RNA-seq we RNA geëxtraheerd met Trizol reagens en vervolgens gezuiverd RNA met de kolommen van de RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) te verkrijgen. We bepaalden de RNA kwaliteit met behulp van de Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Duitsland) aan de linkerkant. Een voorbeeld van een Bioanalyzer output wordt gegeven aan de rechterkant. De twee belangrijkste pieken van het monster vertegenwoordigen 18 S en 25 S ribosomaal RNA. Onze steekproef toonde een RNA integriteit nummer (RIN) van 9.2, dat is ruim boven de vereiste waarde van 8. Klik op haare voor grotere afbeelding.

Discussion

De hier gepresenteerde protocollen voorzien in een breed kader aan tabak boombladeren analyseren voor metabolieten en transcripties. Het is de bedoeling dat deze gecombineerde inspanningen moet ons voorzien van nieuwe inzichten in de processen die ten grondslag liggen aan de synthese en extrusie van de koolwaterstoffen en de hoge waarde die aanwezig zijn in dit weefsel. Deze benaderingen moeten daarom geven ons een beter begrip voor de manier waarop de stoffen worden gesynthetiseerd. Naast de tabak boom aspecten van de werkzaamheden wordt ook gericht op verbetering populier biomassa, vooral gericht lignification van de secundaire wandstructuur, maar ook om te bepalen of we de schors kunnen gebruiken voor de winning van waardevolle verbindingen.

De informatie in dit document methoden zijn lichte wijzigingen van gestandaardiseerde methoden voor metaboliet profilering. Deze methoden zijn uiteraard beperkt tot bekende metabolische profielen, en het is mogelijk dat verschillende nieuwe metabole pieken worden verkregen which geen verbinding bekend. We hopen deze stoffen in de context van andere metabolieten zetten door het combineren van het gedrag van metabolieten en transcripties over de ontwikkeling tijdreeksen.

Geen van de hier gepresenteerde methoden zijn aanzienlijk veranderd van methoden doorgaans gebruikt voor plantaardige materialen. Het interessante aspect ligt in de combinatie van methoden om de onderliggende kader voornamelijk lange keten koolwaterstof wijziging van de tabak boombladeren begrijpen. Een van de kritische stappen voor het verkrijgen van deze informatie is de volgende combinatie van de verschillende gegevens. Wij voorzien dat de gegevens als een eerste evaluatie worden verdeeld in verschillende clusters gebaseerd op het gedrag van de metabolieten / transcripten via ontwikkeling en dat deze gegevens worden gebruikt om transcriptie afgeleid vs metaboliet gedrag, alsmede bepaalde metabolieten die toewijzen trajecten . Daarnaast worden meer uitgebreid netwerk gebaseerde analyses dan beoogd to exploiteren causale verbanden.

De analytische protocollen hier gepresenteerde zal ook een basis voor veld-proeven en industriële exploitatie van de biomassa. Om dit te bereiken, de MultiBioPro consortium bevat een aantal industriële partners, die de mogelijkheden hebben om verder onderzoeken van de biomassa, met het doel om biodiesel, bio-ethanol en andere hoogwaardige verbindingen te leveren. Deze vormen van uitbuiting biomassa zal worden beoordeeld op basis van; (1) het testen van de robuustheid en de kwaliteit van de biologische producten die zijn geproduceerd (typisch industriële standaard tests zullen worden uitgevoerd om de gegenereerde producten hebben een goede marktwaarde), (2), een economische, sociale en ecologische evaluatie van de technologie zal worden uitgevoerd met behulp van literatuur bronnen, interviews en materiaal dat wordt gegenereerd tijdens veldproeven en proeffabriek bioraffinage assessments. Deze activiteiten omvatten kostenvoordeel en analyse van de levenscyclus, het genereren van een milieu-dossier en de markt en Business strategieën. Wij geloven dat deze leiding een handige mix van de academische wereld zal worden, toegepaste wetenschap en industriële exploitatie verder populier en tabak boom biomassa voor consumenten eindproducten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol reagent	Invitrogen	15596-026
Chloroform	Merck	102445
Ethanol	Merck	101986
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
TURBO Dnase	Invitrogen	AM2238
RNA 6000 Nano Kit	Agilent	G2938-90034
2100 Electrophoresis Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
1.5 ml and 2 ml safe-lock tubes	Eppendorf	0030 120.086, 0030 120.094
Steel balls	Geyer Berlin GmbH	VA2mm
Mixer mill MM 300	Retsch	YO-04182-09
Microcentrifuge	Eppendorf	5424