Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

תמליל והמטבוליט Profiling להערכת של טבק ועץ צפצפה כחומר גלם לתעשייה המבוססת על ביו

Published: May 16, 2014 doi: 10.3791/51393
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 3,4, 3,4, 3,4, 3,4, 5,6, 5,6, 7, 8, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 13, 1,14
1Max Planck Institute for Molecular Plant Physiology, 2School of Biological Sciences, Plant Molecular Science, Centre for Systems and Synthetic Biology, Royal Holloway, University of London, 3Department of Plant Systems Biology, VIB, 4Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, UGhent, 5Institute for Building Materials, ETH Zurich, 6Applied Wood Materials, EMPA, 7Division of Glycoscience, School of Biotechnology, AlbaNova University Center, Royal Institute of Technology (KTH), 8European Research and Project Office GmbH, 9ABBA Gaia S.L., 10Pflanzenöltechnologie, 11Capax Environmental Services, 12Green Fuels, 13Neutral Consulting Ltd, 14Plant Cell Biology Research Centre, School of Botany, University of Melbourne

ERRATUM NOTICE

Summary

ביומסה במפעל מציע משאב מתחדש למספר רב של מוצרים, כוללים דלק, מזון, מזון ומגוון רחב של חומרים. במאמר זה אנו לחקור את המאפיינים של עץ טבק (Nicotiana glauca) ומקורות מתאימים כמו צפצפה לצינור biorefinery.

Abstract

הביקוש העולמי למזון, מזון, אנרגיה ומים מציב אתגרים יוצאי דופן לדורות הבאים. ניתן לראות כי פלטפורמות חזקות לחקר משאבים מתחדשים הן הכרחיות כדי להתגבר על אתגרים אלה. במסגרת רב לאומית MultiBioPro אנו מפתחים צינורות biorefinery למקסם את השימוש של ביומסה במפעל. באופן ספציפי יותר, אנו משתמשים בצפצפה ועץ טבק (Nicotiana glauca) כיבול יעד מינים לשיפור saccharification, isoprenoid, תכולת פחמימנים שרשרת ארוכה, באיכות סיבים, ותכנים שעימן וליגנין. השיטות המשמשות לקבל פלטים אלה כוללות GC-MS, LC-MS ופלטפורמות רצף RNA. צינורות המטבוליט מבוססים היטב בכלים כדי לייצר סוגים אלה של נתונים, אבל יש גם יכולות לשמש את המגבלות שבמטבוליטים רק מאופיינים היטב. רצף העמוק יאפשר לנו לכלול את כל התמלילים הנוכחים במהלך שלבי ההתפתחות של עלה עץ הטבק, אבל hכמו להיות ממופה חזרה לרצף של tabacum Nicotiana. עם להגדיר קופצים אלה, אנו שואפים בהבנה בסיסית של תהליכים הבסיסיים ובהקמת מסגרת תעשייתית לנצל את התוצאות. בראייה ארוכת טווח יותר, אנו מאמינים כי הנתונים שנוצרו כאן יספק אמצעי לתהליך biorefinery קיימא באמצעות עץ צפצפה וטבק כחומר גלם. עד כה ברמה הבסיסית של מטבוליטים בדגימות כבר ניתח והפרוטוקולים מנוצלים מסופקים במאמר זה.

Introduction

אוכלוסייה וצמיחה כלכלית גרמו לביקוש הולך וגובר למזון, מים ודלק. חלק גדול מציוד אלה מיוצרים, מעובד ומועבר באמצעים מבוססי מאובנים סופיים, כגון נפט. היא, לעומת זאת, ברורה שבפועל זה לא בר קיימא, והפיתוח של משאבים חלופיים יהיה אפוא להיות חשיבות רבה 1. משאבים מתחדשים רבים, בדרגות שונות, כיום מנוצלים לרעה, כוללים רוח, תנועת מים, שמש, אנרגיה גיאותרמית, ולנופף במקורות אנרגיה מבוססות. משאב בר קיימא ומידה רב בלתי מנוצל נוסף הוא ביומסה מצמחים. משאב זה גם מציע דרך יעילה וחסכונית מאוד להמרת אנרגיה מתאים הסולאריים לדלקים 2. מלבד לספק דלק ביו מבוסס, ביומסה במפעל גם מציעה הזדמנויות ייחודיות למוצרים חלופיים, כוללים פלסטיק, חומרי ניקוי וכימיקלים יקרי ערך.

קיר צמח התא, אשר מורכב בעיקר של פולימרים מבוססי סוכר, Makes את העיקר העיקרי של ביומסה במפעל והרבה מאמץ בימים אלה מושקע בגיור שלה יעיל לbioethanol. ביומסה הנותרת רשאים לאחר מכן תעובד לתוך יוגז ומוצרי נפט הקשורות 3. חלק גדול מהמינים הרב שנתי הצמח, כוללים עשבים ועצים, המייצרים כמויות גדולות של ביומסה תאית בדרך כלל לגדול ביותר באזורים הממוזגים. עם זאת, כ 20% מהשטח הוא צחיח למחצה, ולכן הוא גם נוטה לבצורות 4. ברור, זה יהיה עניין גם לעבד את האדמה הצחיחה אלה עם צמחים שיעילות יכולה לתרום לייצור בר קיימא של אנרגיה וחומר. צמחים אלה צריכים להיות יעילות שימוש במים אופטימלי והתנגדות בצורת ויכלול את עץ הטבק (Nicotiana glauca) ומינים מהסוג אגבה.

קונסורציום MultiBioPro שואף ליישם צינור biorefinery משולב, תוך שימוש בשני CR החשובמיני אופ, צפצפה ועץ טבק. צפצפה התפתחה כיבול דלק ביולוגי מבטיח כפי שהוא גדל במהירות, בקלות מופצות על clonally וישימה מאוד למגוון רחב של תנאי אקלים וקרקע. הוא גם מספק מגוון רחב של עץ, סיבים, עץ דלק, ומוצרי יער אחרים 5. עץ הטבק התפתחה גם כצמח מתאים למטרות דלק ביולוגיים וbiorefinery. זה בדרך כלל מייצר כמויות ניכרות של ביומסה, מכיל כמויות גבוהות של פחמימות nonstructural 6, וגם יש לו את היכולת נדירה לצבור כמויות גדולות של שמנים שניתן להפיק בקלות nonfood (כוללים שרשרת ארוכה C 29-C 31 בפחמימנים וtriterpenoids רוויים) שמתאימות לביודיזל ייצור. עץ הטבק הוא, יתר על כן, ניתנים לשיפור גנטי, יש לו יכולת נביטה גבוהה, וגדל בשמחה על קרקעות צחיחות למחצה אינו משמשות לייצור מזון. נראה אפוא כי לשתי צפצפה ועץ טבק פוטנציאל מהותי לmultipגידולי urpose, כלומר כחומר זינת ערך גבוה חדש לתעשייה ביו מבוסס אינטגרטיבית. במאמר זה אנו מתמקדים בקבוצה מגוונת של גישות להבחין פחמימנים שרשרת כמה זמן פיקדונות עץ טבק.

בניסיון לזהות את המנגנון המולקולרי שבבסיס אחראי על הייצור והפרשה של פחמימנים הרוויים ארוכת שרשרת עליי טבק, אנחנו מיישמים "omics" המודרני מבוסס טכנולוגיות. זה כולל seq RNA של סדרה התפתחותית עלה (עשרה שלבים), ופרופיל המטבוליט מרובה גישות באמצעות LC-וGC-MS (למטבוליטים וlipidomics קוטב פולריים). נתונים אלה ישמשו לשלי לביטוי גנים שעולה בקנה אחד עם, או מקדים, את התחלתה של ביוסינתזה של המולקולות שצוינו לעיל. הגנים ומסלולים המופיעים מבטיח ממאמצים אלה ישמשו לבדיקות פונקציונליות בארבידופסיס מיני מודל וסופו של דבר יכולים להיות נוח להנדסה ביוטכנולוגית בTobעץ עכו.

Protocol

1. צמח חומר

לגדל צמחי Nicotiana glauca ב30 סירים בקוטר סנטימטר המכילים בינוני הולך וגדל מקצועי M2. לגדל צמחים בחממה, עם טמפרטורה יומית של 20-25 ° C וטמפרטורה לילית של 15 ° C. השתמש אור 16 שעות ומחזור חשכה 8 שעות כמשטר אור משלים.

2. לדוגמא הכנה

  1. למטבוליטים עיקריים:
    1. חומרי צמח קציר (עלים וגבעולים של glauca נ ') וחומר הקפאה באופן מיידי.
    2. Lyophilize חומרים צמחיים קפואים הקפאת ייבוש במשך שלושה ימים.
    3. טוחנים דגימות lyophilized ידי טחנת מיקסר עם כדורי מתכת.
    4. חומרים יבשים קרקע בסדר aliquot לתוך צינור צנטריפוגות 2 מיליליטר או בקבוקון זכוכית.
  2. למטבוליטים משניים:
    1. רקמות צמח קציר וחומר הקפאה באופן מיידי.
    2. טוחן את רקמות צמח קפוא על ידי מ 'טחנת ixer עם הנירוסטה כדור או על ידי מכתש ועלי.
    3. רקמות aliquot בסדר קרקע ל2 צינור צנטריפוגות מיליליטר (משקל רטוב כ 20 מ"ג).

3. הפקת פרוטוקול המטבוליט Profiling למטבוליטים ראשוניים על ידי GC-MS

  1. חומרי קרקע aliquot יבשים צמח (10 מ"ג של עלים ו20 מ"ג של חומרי גזע) ב2 מיליליטר, בורג כובע, צינורות תחתית עגולים.
  2. הוספת 1,400 μl של מתנול 100% ומערבולת 10 שניות.
  3. הוסף 60 μl של Ribitol (0.2 מ"ג / מיליליטר מניות בH 2 O) כסטנדרט פנימי כמותיים ומערבולת 10 שניות.
  4. הוספת פלדה אל חלד אחד (או zirconia) כדור וhomogenize חומר עם מיל מיקסר למשך 2 דקות ב 25 הרץ.
  5. צנטריפוגה התמהיל 10 דקות ב 11,000 X גרם.
  6. מעביר את supernatant לבקבוקון זכוכית.
  7. הוסף 750 μl של כלורופורם.
  8. הוספת 1,500 μl של H 2 O ו מערבולת התערובת ל10 שניות.
  9. העבר 150 μl משלב עליון (שלב קוטבי) לתוך צינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר טרי.
  10. דגימות יבשים באמצעות VAC מהירות. זה הכרחי כי הדגימות מופחתות ליובש לבין 3 ל 24 שעות עד שלא נוזל שיורית הוא הווה.
  11. הוסף 40 μl של hydrochloride methoxyamine (20 מ"ג / מיליליטר בפירידין).
  12. לנער את התערובת שבייקרה גוש חום אופקי לשעה 2 ב 37 ° C.
  13. הוספת 70 μl N-מתיל-N - (trimethylsilyl)-trifluoroacetamide תמהיל MSTFA.
  14. לנער את התערובת לשעה 2 ב 37 ° C.
  15. ספין למטה הטיפות על העטיפה על ידי צנטריפוגה קצרה ~ 1 דקות ב11,000 X גרם.
  16. מעביר את הנוזל לתוך צלוחיות זכוכית מתאימות לניתוח GC-MS.

4. החילוץ להמטבוליט Profiling למשני מטבוליטים על ידי LC-MS

  1. הוסף 500 מתנול μl לדגימות קרקע הקפואות.
  2. Shake עם thermomixer ל15 דקות ב 70 מעלות צלזיוס (1,000 -1 שניות).
  3. צנטריפוגה הדגימות (5 ק"מn, 20,000 XG) ושלב הנוזל הועבר לצינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר.
  4. Lyophilize השלב הנוזלי עם מאייד צנטריפוגלי (speedvac).
  5. הוספת 100 cyclohexane μl ו100 מים milliQ μl לגלולה היבשה.
  6. נער את הדגימות למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר (מערבולת שימוש).
  7. צנטריפוגה הדגימות (5 דק ', XG 20,000).
  8. העבר 80 μl של שלב המים (שלב נמוך יותר) לבקבוקוני הזרקת LC-MS עם תחתית חרוטי לניתוח LC-MS.

5. ניתוח נתונים

  1. קבע את תצורת Xcalibur, MarkerLynx, 7 Metalign או XCMS 8 ובחר את ניתוח נתונים לעיבוד.
  2. הכן טבלה של פסגות זוהו העניין שלך בהתאם לרמת מתחם בטבלה 1.
  3. זהה את הפסגות על ידי שיתוף elution של תרכובות סטנדרטיות.
  4. בהמשך לכך יסמן פסגות זוהו באמצעות ניתוח MSN, אלגוריתמי אפיון מבניים 9,10, ספרות שלurvey והמטבוליט חיפוש באתר 11,12.

6. פחמימן הפקת 13

  1. לצלול נ 'טרי שנקטפו העלים glauca (~ 200 מ"ג) בממס (מתנול, אתנול, כלורופורם, הקסאן או אתר נפט (נקודת C ° 40-60 או 60-80 C ° רתיחה) (5 מיליליטר; HPLC כיתה) ל2-20 דקות.
  2. הסר את העלים ולייבש את הממסים לחלוטין על ידי אידוי סיבובי.
  3. דגימות resuspend בהקסאן (1 מיליליטר; HPLC כיתה).
  4. ביצוע ניתוח GC-MS באמצעות גז כרומטוגרפיה ומקף ל5973MSD. תנאי הפעלה צריכים להיות כדלקמן; גז מוביל, הליום עם קצב זרימה של 0.9 מיליליטר דקות -1/11 psi. הזרק דגימות (μl 1) עם מזרק splitless ב280 ° C. החזק את תנור גז כרומטוגרפיה ב-C ° 70 למשך 5 דקות לפני ramping על 4 מעלות צלזיוס / דקה ל320 ° C. החזק את הטמפרטורה הסופית לעוד 10 דקות, מה שהופך את הזמן כולל של 67.5 דקות. הגדר את הממשק עם MS ב280 מעלות צלזיוס, עמ 'erform MS במצב סריקה מלא באמצעות 70 eV EI + ונסרק 10-800 ד
  5. בתחילה לעבד את רכיבי הכרומתוגרמה על ידי מערכת זיהוי deconvolution MS האוטומטית ו, ואלה שמזוהים באמצעות ספריית MS NIST 98.
  6. לאשר את זיהוי של פחמימנים רוויים ארוכי שרשרת alkane (hexacosenol, nonacosane, triacontane, octacosenol, nonacosonal, hentriacontane, dotriacontane וtritriacontane) על ידי השוואת זמני שמירה ודפוסי פיצול קלאסיים לסטנדרטים אותנטיים ידועים.
  7. לקבוע פחמימנים כמותית על ידי השוואת אזורי שיא משולבים עם עקומות מינון תגובה (.07-2.5 מ"ג), שנבנו מתקנים אותנטיים.
  8. לחשב אמצעים וסטיית התקן של האמצעי (SEM) באמצעות תוכנת Excel.

7. ניתוח 14 Isoprenoids

  1. בצע homogenisation כפי שתואר בסעיף 2. לשקול ב10 מ"ג של אבקה מיובשת בהקפאה הומוגני לתוך צינור צנטריפוגות.
  2. להוסיף ברצף 250 מתנול מיליליטר על האבקה, לערבב אותו, ולאחר מכן להוסיף 500 מיליליטר כלורופורם (כיתה מגיב מעבדה), ולערבב אותו על ידי vortexing.
  3. השאר את הדגימות על קרח בחושך עבור 20 דקות.
  4. הוסף 250 מיליליטר חיץ טריס-HCl (100 מ"מ, pH 7.5) או מים (HPLC כיתה) להשעיה ומערבבים על ידי vortexing.
  5. צנטריפוגה את התערובת על 12,000 סל"ד (13,523 XG) במשך 5 דקות כדי להפריד את nonpolar משלבים מימיים. שלב כלורופורם הפולרי המכיל תמציות isoprenoid הוא בתחתית.
  6. מעביר את השלב לצינור צנטריפוגות חדש.
  7. הוספת כלורופורם 500 מיליליטר נוסף לשלב המימית, ולנהל חילוץ שני על ידי מערבולת וצנטריפוגה כפי שתואר לעיל.
  8. מערבבים את תמציות כלורופורם ולהביא דוגמאות ליובש באמצעות המאייד ולאחסן ב -20 ° C עד ניתוח.
  9. הוסף 50 אתיל אצטט מיליליטר (HPLC כיתה) לתמצית isoprenoid המיובש לredissolve החומר.
  10. הזרק 3 מיליליטר על C18 עמודה באמצעות מודול הפרדת UPLC Acquity. השיפוע משמש להפרדת פיגמנטים צריך לכלול; : מתנול / H 2 0 (50:50) ו-B: אצטט אצטוניטריל / אתיל (75:25), ותנאי התחלה צריך להיות 30% (v / v) ו-B 70% (V / V) הולך 100 % B מעל 6 דקות. השתמש בקצב זרימה של 0.6 מיליליטר / דקה.
  11. לפקח eluate ברציפות עם מערך התמונה דיודה גלאי (PDA) 250-600 ננומטר.
  12. זהה את הרכיבים על ידי שיתוף כרומטוגרפיה והשוואות רפאים בין תקנים אותנטיים, בטא קרוטן (provitamin), phytoene, ליקופן, לוטאין וזאקסנטין.
  13. בצע כימות מעקומות מינון תגובה.
  14. לאשר תרכובות באמצעות LC-MS; להשתמש בתנאי chromatographic דומים. איתור צריך להיעשות באמצעות יינון APCI במצב חיובי עם מכשיר Q-תוף.
  15. האם השינויים לקביעת טוקופרול עם חומר יבש 25 הקפאת מ"ג שכבר חילוץ וסבון בKOH 6% ב50 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות.

class = "jove_title"> 8. RNA חילוץ לרנ"א Seq

פרוטוקול זה משלב מיצוי RNA Trizol עם קיט RNeasy להשיג RNA באיכות גבוהה.

  1. טוחנים של חומר צמחי קפוא 100 מ"ג ב2 צינורות צנטריפוגה מיליליטר עם כדור מתכת על ידי טחנת מיקסר.
  2. הוסף 1 מיליליטר Trizol.
  3. צנטריפוגה את החומר ל10 דקות ב 12,000 XG ב 4 ° C.
  4. מעביר את supernatant לתוך צינור תגובה חדש.
  5. הוסף 200 כלורופורם μl, להפוך את הצינור מספר פעמים, דגירה 3 דקות בטמפרטורת חדר.
  6. צנטריפוגה התערובת ל15 דקות ב 12,000 XG ב 4 ° C.
  7. מעביר את השלב העליון המימית (כ 700 μl) לתוך צינור תגובה חדש.
  8. להוסיף כ 2.5 כרכים של אתנול (100%), להפוך את הצינור מספר פעמים, ודגירה במשך 30 דקות ב -80 ° C.
  9. הזז את המדגם לרבות כל משקע לעמודת הספין מהערכה.
  10. צנטריפוגה עמודה במשך 15 שניות ב8,000 XG, וזורקים את fנמוך דרך.
  11. הוסף 700 μl הצפת RW1 לעמודת הספין ו צנטריפוגות במשך 15 שניות ב8,000 x גרם. מחק את הזרימה דרכו.
  12. הוסף 500 μl הצפת הרשתית לעמודת הספין וצנטריפוגות העמודה במשך 15 שניות ב8,000 x גרם. מחק את הזרימה דרכו.
  13. הוסף 500 μl הצפת הרשתית לעמודת הספין ו צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 8,000 x גרם.
  14. מניחים את טור הספין לתוך צינור תגובה חדש 1.5 מיליליטר ולהוסיף 50 מים RNase ללא μl.
  15. צנטריפוגה העמודה 1 דקות ב8,000 XG לelute RNA.
  16. הסר את ה-DNA שיורית באמצעות ערכה ללא DNA Ambion על פי הוראות יצרן.
  17. לקבוע את האיכות של RNA. RNA צריך להיות מספרי שלמות RNA (רין) מעל 8.
  18. שלח את ה-RNA לרצפים של הדור הבא.

Representative Results

פרופיל HPLC באיור 1 מראה תוצאת נציג ניתוח isoprenoid של נ ' תמציות עלים glauca. איזופרנואידים של C40 ומעלה התגלו באמצעות מערך התמונה דיודה גלאי (מחשב כף יד). הפסגות היו מפורשות המבוססות על שיתוף כרומטוגרפיה והשוואה רפאים בין תקנים אותנטיים, בטא קרוטן (provitamin), phytoene, ליקופן, לוטאין וזאקסנטין. שני chromatograms MS באיור 2 מראה את התוצאה של ניתוח המטבוליט עיקרי מנ חומרים עלה glauca וגזע, בהתאמה. ספקטרום MS של שיא המקביל לסרין (מסומן על ידי חץ) ניתן גם לדוגמא ירושלים. איור 3 מציג את Bioanalyzer המשמש לקביעת האיכות של RNA ופלט נציג מהמכשיר. שתי הפסגות העיקריות בהכרומתוגרמה המתאימה 18 S ו25 RNA ריבוזומלי S, המציין RNA שלם במדגם. פסגות נוספות של צלעות מקוטעותosomal RNA היה מופיע במקרה של RNA באופן חלקי או בכבדות המושפל.

איור 1
איור 1. פרופיל HPLC מראה isoprenoids הווה בתמציות עלה מנ glauca. רוב isoprenoids של C40 ומעלה אינם ניתן לניתוח GC-MS. לפיכך, אנו משמשים הפרדות HPLC עם זיהוי מערך דיודת אור. הכרומתוגרמה טיפוסית נרשמה ב450 ננומטר מוצגת. פיגמנטים קרוטנואידים אופייניים לרקמות פוטוסינתזה עם ראשן לוטאין. גם בהווה הוא זאקסנטין, אשר נמצא ברקמת עלה רק לעתים נדירות, אלא אם כן הניחה תחת לחץ אור גבוה. הרמות של זאקסנטין להפוך אותו למקור טוב של מתחם בעלי ערך גבוה זה. אנא לחץ כאן כדי להציג v גדולersion של נתון זה.

איור 2
איור 2. הכרומתוגרמה MS וספקטרום של נ ' תמציות רקמת glauca. הכרומתוגרמה סה"כ יון MS (TIC) של עלים וגזע תמציות נמדדות על ידי GC-MS מוצגת (70-600 מ '/ z). ניתוח GC-MS בוצע כפי שתואר קודם לכן ב15. פסגות זוהו היו מפורשת בשימוש בספריית תגי ספקטרלי ההמוני. ספקטרום MS של סרין (2TMS) מוצג כדוגמא. הכרומתוגרמה MS: ציר X וציר Y מצביעים על זמן שמירה (דקות) ועוצמה (שפע) של האות, ספקטרום MS: ציר X וציר Y מציינים את יחס M / Z והעוצמה (שפע) של האות, בהתאמה. לחץ כאן לצפייה גדולה יותרתמונה.

איור 3
איור 3. מדידת Bioanalyzer של RNA מוכן לseq RNA של נ ' חומרים עלה glauca. כדי להשיג RNA הטהור מאוד נחוץ לseq RNA אנו חילוץ RNA באמצעות מגיב Trizol ולאחר מכן מטוהרים RNA באמצעות העמודות מקיט RNeasy מיני (Qiagen, Hilden, גרמניה). אנחנו נקבע את איכות RNA באמצעות Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, גרמניה) המופיע משמאל. דוגמא של פלט Bioanalyzer ניתנת בצד הימין. שתי הפסגות העיקריות במדגם מייצגות 18 S ו25 RNA ריבוזומלי S. המדגם שלנו הראה מספר RNA יושרה (רין) של 9.2, שהוא הרבה מעל הערך הנדרש של 8. לחץדואר לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

הפרוטוקולים שהוצגו כאן לספק מסגרת מקיפה לניתוח עלים עץ טבק למטבוליטים ותמלילים. זה שחזה כי מאמצים המשולבים אלה צריכים לספק לנו תובנות חדשות על התהליכים שבבסיס הסינתזה והחול של פחמימנים ותרכובות הערך גבוהות הנוכחים ברקמה זו. גישות אלו ולכן צריכה לתת לנו הבנה טובה יותר לאופן שבו התרכובות נמצאים מסונתזים. בנוסף להיבטי עץ הטבק של העבודה, הוא גם נועד לשפר ביומסה צפצפה, במיוחד מיקוד lignification של קיר מבנה משני, אלא גם כדי לחקור האם אנו יכולים להשתמש בקליפה להפקת תרכובות יקרות ערך.

השיטות שהוצגו במאמר זה הן שינויים קלים בשיטות סטנדרטיות לפרופיל המטבוליט. שיטות אלה הן כמובן מוגבלות לפרופילים מטבולים ידועים, וזה אפשרי שהיו יכולים להתקבל כמה פסגות חילוף חומרים חדשות עבור which ידוע אין מתחם. אנו מקווים לשים את התרכובות הללו בהקשר למטבוליטים אחרים על ידי שילוב של התנהגותם של מטבוליטים ותמלילים על הסדרה התפתחותית הזמן.

אף אחת מהשיטות שהוצגו כאן הם השתנו באופן משמעותי משיטות משמשות בדרך כלל לחומרים צמחיים. ההיבט המעניין טמון בשילוב של שיטות כדי להבין את המסגרת הבסיסית לייצור בעיקר ארוך פחמימנים שרשרת ושינוי בעץ העלים טבק. אחד הצעדים הקריטיים לקבלת מידע זה הוא השילוב הבא של סוגי נתונים השונים. אנחנו מדמיינים שאת הנתונים כהערכה ראשונה יחולקו לאשכולות שונים המבוססים על ההתנהגות של מטבוליטים / תעתיקים על הפיתוח ושנתונים אלה ישמשו להסיק תמליל לעומת התנהגויות המטבוליט, וגם פוטנציאל ללהקצות מטבוליטים מסוימים למסלולים . בנוסף, ניתוחים מבוססי רשת משוכללות יותר אז הם חזו לאo לנצל קשרים סיבתיים.

פרוטוקולי האנליטיות שהוצגו כאן גם יספק בסיס לניסויי שדה וניצול תעשייתי של ביומסה. כדי להשיג זאת, קונסורציום MultiBioPro מכיל כמה שותפים תעשייתיים שיש את היכולות כדי להמשיך לחקור ביומסה, במטרה לספק ביו דיזל, bioethanol ותרכובות בעלי ערך גבוה אחרות. הניצול ביומסה סוגים אלה ייבחנו על בסיס; (1) בדיקות החוסן ואיכות של המוצרים ביו מיוצרים (בדיקות תקן התעשייה טיפוסיות תבוצענה כדי לוודא שיש המוצרים שנוצרו ערך שוק טוב), (2), הערכה כלכלית, חברתית וסביבתית של הטכנולוגיות תבוצע שימוש במקורות ספרות, ראיונות וחומר שנוצר במהלך ניסויים שדה והערכות biorefinery מפעל פיילוט. פעילויות אלה יכללו עלות תועלת וניתוח מחזור החיים, הדור של תיק וbusine ושוק סביבתיאסטרטגיות ss. אנו מאמינים כי צינור זה יהיה שילוב שימושי של אקדמיה, מדע יישומים וניצול תעשייתי לביומסה עץ צפצפה וטבק נוספת למוצרים סופיים לצרכן.

Disclosures

המחקר שהוביל לתוצאות הללו קיבל מימון מתכנית המסגרת השביעית באירופה ([FP7/2007-2013]) תחת מספר הסכם מענק 311,804.

Acknowledgments

MultiBioPro רוצה להודות לאנשים הבאים שגם תורמים לפרויקט: דומיניק סווינטון (דלקים ירוקים), תומאס אפלולי (דלקים ירוקים), סם Buekenhout (Capax), וסילביה Drouven (Capax).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizol reagent Invitrogen 15596-026
Chloroform Merck 102445
Ethanol Merck 101986
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
TURBO Dnase Invitrogen AM2238
RNA 6000 Nano Kit Agilent G2938-90034
2100 Electrophoresis Bioanalyzer Agilent G2939AA
1.5 ml and 2 ml safe-lock tubes Eppendorf 0030 120.086, 0030 120.094
Steel balls Geyer Berlin GmbH VA2mm
Mixer mill MM 300 Retsch YO-04182-09
Microcentrifuge Eppendorf 5424

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, J. H., et al. chemistry, biofuels, and biorefinery. Annu Rev Chem Biomol Eng. 3, 183-207 (2012).
  2. Carroll, A., Somerville, C. Cellulosic biofuels. Annu Rev Plant Biol. 60, 165-182 (1146).
  3. Vanholme, B., et al. Towards a carbon-negative sustainable bio-economy. Front Plant Sci. 4, (2013).
  4. United Nations Environment Programme (UNEP). Global Environment Outlook: Environment for Development. 4, UNEP. New York. (2007).
  5. Boerjan, W. Biotechnology and the domestication of forest trees. Curr Opin Biotechnol. 16 (2), 159-166 (2005).
  6. Curt, M. D., Fernández, J. Production of Nicotiana glauca R.C. Graham aerial biomass in relation to irrigation regime. Biomass. 23 (2), 103-115 (1990).
  7. De Vos, R. C. H., et al. Untargeted large-scale plant metabolomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (4), 778-791 (2007).
  8. Smith, C. A., et al. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using Nonlinear peak alignment, matching, and identification. Anal Chem. 78 (3), 779-787 (2006).
  9. Morreel, K., et al. Mass spectrometry-based fragmentation as an identification tool in lignomics. Anal Chem. 82 (19), 8095-8105 (2010).
  10. Morreel, K., et al. Mass spectrometry-based sequencing of lignin oligomers. Plant Physiol. 153 (4), 1464-1478 (1104).
  11. Tohge, T., Fernie, A. R. Web-based resources for mass-spectrometry-based metabolomics: A user's guide. Phytochemistry. 70 (4), 450-456 (2009).
  12. Tohge, T., Fernie, A. R. Combining genetic diversity, informatics and metabolomics to facilitate annotation of plant gene function. Nat Protoc. 5 (6), 1210-1227 (2010).
  13. Mortimer, C. L., et al. The identification and rapid extraction of hydrocarbons from Nicotiana glauca: a potential advanced renewable biofuel source. Phytochem Lett. 5 (3), 455-458 (2012).
  14. Fraser, P. D., et al. Application of high-performance liquid chromatography with photodiode array detection to the metabolic profiling of plant isoprenoids. Plant J. 24 (4), 551-558 (2000).
  15. Lisec, J., et al. Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nat Protoc. 1 (1), 387-396 (2006).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 87 בוטניקה צמחים Biorefining צפצפה עץ טבק ארבידופסיס שעימן ליגנין קירות תא ביומסה פחמימנים ארוך שרשרת isoprenoids, ביולוגיה של מערכות

Erratum

Formal Correction: Erratum: Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry
Posted by JoVE Editors on 06/30/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry.

There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:

Juan Pedro Navarro

to:

Juan Navarro-Aviñó

תמליל והמטבוליט Profiling להערכת של טבק ועץ צפצפה כחומר גלם לתעשייה המבוססת על ביו
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruprecht, C., Tohge, T., Fernie, A., … More

Ruprecht, C., Tohge, T., Fernie, A., Mortimer, C. L., Kozlo, A., Fraser, P. D., Funke, N., Cesarino, I., Vanholme, R., Boerjan, W., Morreel, K., Burgert, I., Gierlinger, N., Bulone, V., Schneider, V., Stockero, A., Navarro-Aviñó, J., Pudel, F., Tambuyser, B., Hygate, J., Bumstead, J., Notley, L., Persson, S. Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry. J. Vis. Exp. (87), e51393, doi:10.3791/51393 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter