Avskrift og Metabolitt Profilering for bedømmelse av tobakk Tree and Poplar som råstoff for bio-basert industri

Summary

Plant biomasse tilbyr en fornybar ressurs for flere produkter, inkludert drivstoff, strøm, mat og en rekke materialer. I denne artikkelen undersøker vi egenskapene til tobakks treet (Nicotiana glauca) og poppel som egnede kilder for et bioraffineri rørledning.

Abstract

Den globale etterspørselen etter mat, fôr, energi og vann utgjør ekstraordinære utfordringer for fremtidige generasjoner. Det er tydelig at robuste plattformer for utforskningen av fornybare ressurser er nødvendig for å overvinne disse utfordringene. Innenfor den multinasjonal ramme MultiBioPro utvikler vi bioraffineri rørledninger for å maksimere bruken av plantebiomasse. Mer spesifikt, bruker vi poppel og tobakk treet (Nicotiana glauca) som target beskjære arter for å forbedre saccharification, isoprenoidlignende, lange kjeden hydrokarboninnhold, fiber kvalitet, og suberin og lignin innholdet. Metodene som brukes for å oppnå disse utgangene inkluderer GC-MS, LC-MS og RNA sekvense plattformer. Metabolitten rørledninger er vel etablert verktøy for å generere disse typer data, men også har begrensningene ved at bare godt karakteriserte metabolitter kan anvendes. Den dype sekvensering vil tillate oss å inkludere alle utskrifter til stede i løpet av de utviklingsmessige stadier av tobakk tre blad, men hsom skal kartlegges tilbake til sekvensen av Nicotiana tabacum. Med disse set-ups, tar vi sikte på en grunnleggende forståelse for underliggende prosesser og på å etablere en industriell ramme for å utnytte resultatene. I et mer langsiktig perspektiv, mener vi at data som genereres her vil sørge for midler for en bærekraftig bioraffineri prosessen ved hjelp av poppel og tobakk tre som råstoff. Hittil basalnivået av metabolitter i prøvene har blitt analysert og protokollene som benyttes er gitt i denne artikkelen.

Introduction

Befolkning og økonomisk vekst har ført til et økende behov for mat, vann og brensel. Mye av disse leverer er produsert, bearbeidet og transportert ved hjelp av begrensede fossile baserte virkemidler, som for eksempel petroleum. Det er imidlertid klart at denne praksis ikke er bærekraftig, og utvikling av alternative ressurser vil derfor være av stor betydning ^1. Mange fornybare ressurser er, i varierende grad, som for tiden blir utnyttet, blant annet vind, vann bevegelse, solenergi, jordvarme, og vinke baserte energikilder. En annen bærekraftig og i stor grad uutnyttet ressurs er biomasse fra planter. Denne ressursen tilbyr også en svært kostnadseffektiv måte å konvertere solenergi avledet energi til brensel ^2. Bortsett fra å gi biobasert drivstoff, anlegget biomasse gir også unike muligheter for alternative produkter, inkludert plast, vaskemidler og verdifulle kjemikalier.

Anlegget cellevegg, som i stor grad består av sukker baserte polymerer, makes opp hoveddelen av anleggets biomasse og mye innsats blir nå investert i sin effektiv konvertering til bioetanol. De resterende biomassen kan senere bli behandlet i biogass og oljerelaterte produkter ^tre. Mye av de flerårige plantearter, inkludert gress og trær, som produserer store mengder av cellulose biomasse vanligvis trives best i tempererte soner. Men, er ca 20% av landarealet halvtørre, og er derfor også utsatt for tørke ^fire. Selvfølgelig ville det være av interesse å også dyrke disse tørre land med planter som effektivt kan bidra til bærekraftig produksjon av energi og materiale. Disse plantene trenger for å ha en optimal vannbruken og tørke motstand og vil inkludere tobakk treet (Nicotiana glauca) og arter fra Agave slekten.

Den MultiBioPro konsortium som mål å implementere en integrert bioraffineri rørledningen ved hjelp av to viktige crop arter, poppel og tobakk treet. Poplar har dukket opp som en lovende biodrivstoff avling som det er raskt voksende, lett clonally spredd og svært tilpasningsdyktig til et bredt spekter av klimatiske og jordbunnsforhold. Det gir også et bredt spekter av tre, fiber, brensel, og andre skogprodukter ^fem. Tobakken treet har også dukket opp som et egnet anlegg for biodrivstoff og bioraffineri formål. Den produserer vanligvis betydelige mengder av biomasse, inneholder store mengder nonstructural karbohydrater ^6, og har også den sjeldne evne til å akkumulere store mengder av lett ekstraherbare ikke-mat-oljer (inkludert langkjedede C _{29-C 31} mettede hydrokarboner og triterpenoider) som er egnet for biodiesel produksjon. Tobakks treet er dessuten mottagelig for genetisk forbedring, har høy spirende kapasitet, og vokser gjerne på halvtørre jord ikke brukes til matproduksjon. Det ser derfor ut til at både poppel og tobakk treet har egenverdi potensial for flerfaseurpose avlinger, dvs. som nye høy verdi kan benyttes i en integrerende bio-basert industri. I denne artikkelen fokuserer vi på variert sett av tilnærminger for å skjelne hvordan tobakk tre innskudd langkjedete hydrokarboner.

I et forsøk på å identifisere den underliggende molekylære maskineri som er ansvarlig for produksjon og utskillelse av de mettede langkjedede hydrokarboner på tobakksblader, kan vi anvende moderne "omics" basert teknologier. Dette inkluderer RNA seq av en utviklings blad serie (ti etapper), og multiplattform metabolitt profilering tilnærminger bruker LC-og GC-MS (for polare og upolare metabolitter og lipidomics). Disse dataene vil bli brukt til mine for genuttrykk som korrelerer med, eller forut, utbruddet av biosyntesen av molekyler som er angitt ovenfor. Gener og stier som synes lovende fra disse bestrebelser vil bli brukt for funksjonell testing i modellarter Arabidopsis og kunne til slutt være mottagelig for bioteknologisk engineering i tobacco treet.

Protocol

En. Plantemateriale

Dyrk Nicotiana glauca planter i 30 cm diameter potter som inneholder M2 profesjonell voksende medium. Dyrke planter i drivhus, med en dagtemperatur på 20-25 ° C og nattlige temperatur på 15 ° C. Bruk en 16 timers lys og 8 timers mørke syklus som supplerende lys regime.

2. Prøvepreparering

1. For primær metabolitter:
   1. Harvest-anlegg materiale (blader og stilker av N. glauca) og fryse materialet umiddelbart.
   2. Lyofiliser frosne plantematerialer ved frysetørking i tre dager.
   3. Grind frysetørkede prøver av blandebatteri mill med metallkuler.
   4. Delmengde fint malte tørre materialer i en 2 ml sentrifugerør eller hetteglass.
2. For sekundære metabolitter:
   1. Innhøsting plantevev og fryse materialet umiddelbart.
   2. Grind frosne plantevev av mmikseren mill med rustfritt stål ball eller morter.
   3. Delmengde fint malte vev i 2 ml sentrifugerør (ca. 20 mg våtvekt).

Tre. Utvinning Protokoll for Metabolitt Profiling for primære metabolittene av GC-MS

1. Delmengde bakken tørt plantemateriale (10 mg av blad og 20 mg av stilk materiale) i 2 ml skrulokk, rundbunnede rør.
2. Til 1,400 mL av 100% metanol, og vortex i 10 sek.
3. Legg 60 mL av ribitol (0,2 mg / ml lager i H ₂ O) som en intern kvantitativ standard og vortex i 10 sek.
4. Legg en rustfritt stål (eller zirkonia) ball og homogenisere materialet med en Mixer Mill for 2 min ved 25 Hz.
5. Sentrifuger blandingen i 10 min ved 11 000 x g.
6. Overfør supernatanten til et hetteglass.
7. Legg 750 pl kloroform.
8. Legg 1500 mL H ₂ O og vortex mix for 10 sek.
9. Overfør 150 mL fraøvre fase (polar fase) i en frisk 1,5 ml sentrifugerør.
10. Tørre prøver ved hjelp av en hastighet vac. Det er viktig at prøvene er redusert til tørrhet for mellom 3 og 24 timer inntil intet resterende væske er til stede.
11. Legg 40 mL av methoxyamine-hydroklorid (20 mg / ml i pyridin).
12. Rist blandingen i en horisontal varmeblokk rister i 2 timer ved 37 ° C.
13. Legg 70 pl N-metyl-N - (trimetylsilyl)-trifluoracetamid MSTFA blanding.
14. Rist blandingen i 2 timer ved 37 ° C.
15. Spinn ned dråper på omslaget av en kort sentrifugering ~ 1 min ved 11 000 x g.
16. Overfør væsken i glassflasker som er egnet for GC-MS-analyse.

4. Utvinning for Metabolitt Profiling for sekundære metabolitter av LC-MS

1. Legg 500 mL metanol til den frosne bakken prøvene.
2. Rist med en Thermo i 15 min ved 70 ° C (1000 sek ^-1).
3. Sentrifuger prøvene (5 kmn, 20,000 xg), og den flytende fase overføres til en 1,5 ml sentrifugerør.
4. Lyofiliser den flytende fase med en sentrifugal-fordamper (speedvac).
5. Tilsett 100 mL cykloheksan og 100 pl MilliQ vann til den tørre pellet.
6. Ryst prøvene i 5 min ved romtemperatur (bruk vortex).
7. Sentrifuger prøvene (5 min, 20 000 xg).
8. Overfør 80 pl av vannfasen (lavere fase) til LC-MS injeksjon ampuller med konisk bunn for LC-MS-analyse.

5. Data Analysis

1. Konfigurer Xcalibur, MarkerLynx, Metalign ⁷ eller XCMS ⁸ og velg dataanalyse som skal behandles.
2. Forbered en tabell over oppdagede toppene i din interesse i samsvar med sammensatte klasse i tabell 1.
3. Identifiser topper ved ko-eluering av standard-forbindelser.
4. Deretter kommentere oppdaget topper bruker MSN analyse, strukturell karakterisering algoritmer ^9,10, litteratur survey og metabolitt database søk ^11,12.

6. Hydrokarbon Extraction ¹³

1. Senk nyhøstet N. glauca blader (~ 200 mg) i løsningsmiddel (metanol, etanol, kloroform, heksan eller petroleter (kokepunkt 40-60 ° C eller 60-80 ° C) (5 ml, HPLC-kvalitet) i 2 til 20 min.
2. Fjern løv og tørke av løsemidler helt ved rotasjonsinndamping.
3. Resuspender prøvene i heksan (1 ml, HPLC-kvalitet).
4. Utfør GC-MS analyse ved hjelp av gasskromatografi og bindestrek til et 5973MSD. Driftsforhold bør være som følger; bærergass, helium med en strømningshastighet på 0,9 ml min ^-1/11 psi. Injisere prøver (1 mikroliter) med en splitless injektor ved 280 ° C. Hold gasskromatografi ovn ved 70 ° C i 5 min før ramping ved 4 ° C / min til 320 ° C. Hold den endelige temperatur i ytterligere 10 min, slik at en total tid på 67,5 min. Sett grensesnittet med MS ved 280 ° C og perform MS i full scan mode bruker 70 eV EI + og skannet 10-800 D.
5. I første omgang behandle kromatogrammet komponenter av automatiserte MS dekonvolusjon og identifikasjonssystem, og de som er identifisert ved hjelp av NIST 98 MS bibliotek.
6. Bekrefte identifikasjonen av mettet langkjedete alkansulfider hydrokarboner (hexacosenol, nonacosane, triacontane, octacosenol, nonacosonal, hentriacontane, dotriacontane og tritriacontane) ved å sammenligne retensjonstidene og klassiske fragmentering mønstre til kjente autentiske standarder.
7. Bestem kvantitativt hydrokarboner ved å sammenligne integrerte topparealer med dose-responskurver (0,07 til 2,5 mg), konstruert fra autentiske standarder.
8. Beregn gjennomsnitt og standard feil av gjennomsnittet (SEM) ved bruk av Excel programvare.

7. Analyse av isoprenoids ¹⁴

1. Utfør homogenisering som beskrevet i seksjon 2. Vei inn 10 mg av homogenisert frysetørket pulver i et sentrifugerør.
2. Legg sekvensielt 250 ml metanol på pulver, bland det, deretter legge 500 ml kloroform (laboratorium reagenskvalitet), og bland det med virvling.
3. La prøvene på is i mørket i 20 min.
4. Legg 250 ml Tris-HCl-buffer (100 mM, pH 7,5) eller vann (HPLC-kvalitet) til suspensjonen, og bland ved virvling.
5. Sentrifuger blandingen ved 12.000 rpm (13.523 x g) i 5 min for å separere det ikke-polare fra vandige faser. Den ikke-polare kloroformfasen innehold isoprenoid ekstrakter er på bunnen.
6. Overfør fase i et nytt sentrifugerør.
7. Til en ytterligere 500 ml kloroform til den vandige fase, og utfører en andre ekstraksjon ved vortex-og sentrifugering som beskrevet ovenfor.
8. Kombiner de kloroformekstraktene og bringe prøvene til tørrhet ved hjelp av fordamperen og oppbevar ved -20 ° C inntil analyse.
9. Tilsett 50 ml etylacetat (HPLC-kvalitet) til det tørkede isoprenoid ekstrakt for å gjenoppløse materialet.
10. Sprøyt 3 ml på en C18kolonnen ved hjelp av en UPLC Acquity separasjonsmodul. Gradienten som brukes til å separere de pigmenter bør inneholde; A: metanol / H ₂ 0 (50:50), og B: acetonitril / etylacetat (75:25), og startbetingelser bør være En 30% (v / v) og 70% B (v / v) som skal til 100 % B i løpet av 6 min. Bruke en strømningshastighet på 0,6 ml / min.
11. Overvåk eluatet kontinuerlig med et bilde Diode Array (PDA) detektor 250-600 nm.
12. Identifisere komponenter av co-kromatografi og spektral sammenligninger mellom autentiske standarder, Betakaroten (provitamin A), phytoene, lykopen, lutein og zeaxanthin.
13. Utfør kvantifisering fra doseresponskurver.
14. Bekreft forbindelser ved hjelp av LC-MS; bruke lignende kromatografiske forhold. Detection bør gjøres ved hjelp APCI ionisering i positiv modus med en Q-TOF instrument.
15. Gjøre modifikasjoner for tokoferol bestemmelse med 25 mg frysetørket materiale som er blitt trukket ut og forsåpning på 6% KOH ved 50 ° C i 1,5 timer.

Denne protokollen kombinerer Trizol RNA ekstraksjon med en RNeasy Kit for å oppnå høy kvalitet RNA.

1. Grind 100 mg av frossen plantemateriale i 2 ml sentrifugerør med en metallkule med en mikser mill.
2. Tilsett 1 ml Trizol.
3. Sentrifuger av materialet i 10 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C.
4. Overfør supernatanten til et nytt reaksjonsrøret.
5. Tilsett 200 ul kloroform, snu røret flere ganger, og inkuber i 3 min ved romtemperatur.
6. Sentrifuger blandingen i 15 min ved 12 000 x g ved 4 ° C.
7. Overfør den øvre vannfase (ca. 700 pl) inn i en ny reaksjonsrøret.
8. Til omtrent 2,5 volumer etanol (100%), snu røret flere ganger, og inkuber i 30 min ved -80 ° C.
9. Flytt prøven inkludert eventuelle bunnfall til spin kolonne fra kit.
10. Sentrifuger kolonnen for 15 sek ved 8000 xg, og kast den flav gjennom.
11. Legg 700 mL buffer RW1 til spin kolonnen og sentrifuger i 15 sek på 8000 x g. Kast strømning gjennom.
12. Legg 500 ul Buffer RPE til spin-kolonne og sentrifuger på kolonnen i 15 sekunder ved 8000 x g. Kast strømning gjennom.
13. Legg 500 mL buffer RPE til spin kolonnen og sentrifuger i 2 min ved 8000 x g.
14. Plasser spinnkolonne til et nytt 1,5 ml reaksjonsrøret og tilsett 50 ul RNase-fritt vann.
15. Sentrifuger kolonnen i 1 min ved 8000 x g for å eluere den RNA.
16. Fjern rester av DNA ved hjelp av en Ambion DNA-free kit i henhold til produsentens instruksjoner.
17. Bestemme kvaliteten av RNA. Den RNA bør ha RNA integritet tall (RIN) over åtte.
18. Send av RNA for neste generasjons sekvensering.

Representative Results

HPLC-profilen i Figur 1 viser et representativt resultat av isoprenoid analyse av N. glauca blad ekstrakter. De ulike isoprenoids av C40 og oppover ble oppdaget ved hjelp av et bilde Diode Array (PDA) detektor. Toppene ble kommentert basert på co-kromatografi og spektral sammenligning mellom autentiske standarder, Betakaroten (provitamin A), phytoene, lykopen, lutein og zeaxanthin. De to MS kromatogrammer i figur 2 viser resultatet av primære metabolitt-analyse fra N. glauca blad og stilk materiale, hhv. MS-spektrum med en topp svarende til serin (angitt med en pil) er også gitt som et eksempel. Figur 3 viser Bioanalyzer brukes for å bestemme kvaliteten av RNA, og en representativ utgang fra anordningen. De to største toppene i kromatogrammet som tilsvarer 18 S og 25 S ribosomal RNA, noe som indikerer intakt RNA i prøven. Ytterligere topper av fragmentert ribosomal RNA ville dukke opp i tilfelle av delvis eller sterkt degradert RNA.

Figur 1. HPLC profil som viser isoprenoids stede i blad ekstrakter fra N. glauca. fleste isoprenoids av C40 og ovenfor er ikke mottagelig for GC-MS analyse. Vi brukte derfor HPLC separasjoner med fotodiode rekke deteksjon. Et typisk kromatogram registrert ved 450 nm er vist. De naturlige pigmentene er typisk for foto vev med lutein predominating. Også tilstede er zeaxanthin, som er sjelden funnet i blad vev med mindre plassert under høy lys stress. Nivåene av zeaxanthin gjøre det en god kilde til dette høy verdi sammensatte. Vennligst klikk her for å se en større version av dette tallet.

Figur 2. MS kromatogram og spekteret av N. glauca vevsekstrakter. Total ion kromatogram MS (TIC) av blad og stilk ekstrakter målt ved GC-MS er presentert (70-600 m / z). GC-MS-analyse ble utført som tidligere beskrevet i ^15. Oppdagede topper ble kommentert ved hjelp av masse spektrale tags bibliotek. MS-spektrum med serin (2TMS) er vist som et eksempel. MS kromatogram: X-aksen og Y-aksen viser retensjonstid (min) og intensiteten (mengde) av signalet, MS-spektrum: X-aksen og Y-aksen indikerer M / Z-forhold og intensiteten (mengde) av signalet, respektivt. Klikk her for å se større versjonimage.

Figur 3. Bioanalyzer måling av RNA forberedt for RNA seq av N. glauca blad materiale. å oppnå høyrent RNA nødvendig for RNA seq vi hentet RNA bruker Trizol reagens og deretter renset RNA ved hjelp av kolonnene fra RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Vi er fast bestemt på RNA kvalitet ved hjelp av Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Tyskland) vises til venstre. Et eksempel på en Bioanalyzer utgang er gitt på høyre side. De to viktigste toppene i utvalget representerer 18 S og 25 S ribosomal RNA. Vår prøven viste en RNA integritet nummer (RIN) på 9,2, noe som er godt over kravet verdi på åtte. Trykk here å se større bilde.

Discussion

Protokollene som presenteres her gir et omfattende rammeverk for å analysere tobakk tre blader for metabolitter og transkripsjoner. Det er tenkt at disse kombinerte innsatsen bør gi oss ny innsikt i de prosessene som ligger bak syntese og ekstrudering av hydrokarboner og den høye verdien forbindelser til stede i dette vevet. Disse metodene bør derfor gi oss en bedre forståelse for hvordan forbindelsene blir syntetisert. I tillegg til tobakks tre aspekter av arbeidet, er det også sikte på å forbedre poppel biomasse, spesielt rettet mot lignification av den sekundære veggkonstruksjonen, men også for å undersøke om vi kan bruke barken for utvinning av verdifulle forbindelser.

Metodene som presenteres i denne artikkelen er litt modifikasjoner av standardiserte metoder for metabolitt profilering. Disse fremgangsmåter er selvsagt begrenset til kjente metabolske profiler, og det er mulig at flere nye metabolske topper kan oppnås for wjør ingen forbindelse er kjent. Vi håper å sette disse forbindelsene i sammenheng til andre metabolitter ved å kombinere oppførselen til metabolitter og transkripsjoner over utviklingstidsserier.

Ingen av de metodene som presenteres her er vesentlig endret fra metoder som vanligvis brukes for plantematerialer. Det interessante aspekt ligger i kombinasjonen av metoder for å forstå de underliggende rammeverk for hovedsakelig lang produksjonskjedet hydrokarbon og modifikasjon i tobakks tre blader. En av de kritiske trinn for å innhente denne informasjonen er den etterfølgende kombinasjon av de forskjellige datatyper. Vi ser for oss at de data som en første evaluering vil bli delt inn i ulike klynger basert på oppførselen til metabolitter / karakterutskrifter over utviklingen og at disse dataene skal brukes til å antyde transkripsjon vs metabolitt atferd, og også til potensielt tildele visse metabolitter til trasé . I tillegg er mer forseggjort nettverksbaserte analyser deretter tenkt to utnytte årsakssammenhenger.

De analytiske protokoller som presenteres her vil også gi grunnlag for feltforsøk og industriell utnyttelse av biomasse. For å oppnå dette, inneholder MultiBioPro konsortium flere industripartnere som har evner til å utforske videre biomassen, med sikte på å levere biodiesel, bioetanol og andre høyverdige forbindelser. Disse typer biomasse utnyttelse vil bli vurdert basert på; (1) å teste robustheten og kvaliteten på bio-produkter som produseres (typiske industristandard tester vil bli gjennomført for å sikre at produktene som genereres har god markedsverdi), (2), en økonomisk, sosial og miljømessig vurdering av teknologiene vil bli utført ved hjelp av kilder i litteraturen, intervjuer og materiale som er generert under feltforsøk og pilotanlegg bioraffineri vurderinger. Disse aktivitetene vil omfatte kost-nytte og livsløpsanalyse, generering av et miljø dossier og marked og business strategier. Vi tror at denne rørledningen vil bli en nyttig blanding av akademia, anvendt vitenskap og industriell utnyttelse til videre poppel og tobakk tre biomasse for forbrukersluttprodukter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol reagent	Invitrogen	15596-026
Chloroform	Merck	102445
Ethanol	Merck	101986
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
TURBO Dnase	Invitrogen	AM2238
RNA 6000 Nano Kit	Agilent	G2938-90034
2100 Electrophoresis Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
1.5 ml and 2 ml safe-lock tubes	Eppendorf	0030 120.086, 0030 120.094
Steel balls	Geyer Berlin GmbH	VA2mm
Mixer mill MM 300	Retsch	YO-04182-09
Microcentrifuge	Eppendorf	5424