ホールマウントラット網膜における免疫組織化学的およびカルシウムイメージング法
Summary
免疫組織化学プロトコルは、網膜中の特定のタンパク質の局在化を研究するために使用される。カルシウムイメージング技術は、網膜神経節細胞および軸索のカルシウム動態を研究するために使用される。
Abstract
本論文では、ツール、試薬、およびのために必要とされる実践的な手順を説明します。免疫組織化学のためのホールマウント網膜の1）成功した準備をして、網膜内カルシウムシグナル伝達を媒介する電位依存性カルシウムチャネル（VGCC）の研究のための2）カルシウムイメージング神経節細胞。われわれが記述するカルシウムイメージング法は、神経節細胞層内に変位アマクリン細胞の非特異的荷重に関する問題を回避する。
Introduction
現在の1,2チャネルCaは全細胞のこれらの成分の薬理学的遮断を介して決定される網膜神経節細胞（RGC）は、L、N – 、P / Q-およびT-型VGCCを発現する。 VGCCは伝達物質放出、遺伝子転写、細胞調節とシナプス可塑性の3,4,5に関与している膜貫通多量体タンパク質である。チャネルの生物物理学的および薬理学的特性を確立するサブユニットを形成する大規模な、膜貫通α1細孔、2δサブユニットと細胞内のβサブユニットα、主に細胞外の補助：機能VGCCsはサブユニットの少なくとも3つの別個のクラスで構成されています。異なるα1サブユニットと、後者の2つのフォームヘテロメリック複合体および原形質膜6へのチャネルのゲーティング動態および人身売買を変える。
ここ数十年にわたり、多くの技術は、タンパク質expreを研究するために使用されてきたそのような免疫組織化学、酵素免疫測定法、ウエスタン分析およびフローサイトメトリーなどのssion、。これらの技術は、関心対象の所与のタンパク質の検出のための特異的抗体の使用を必要とし、異なる組織における特定のタンパク質の局在化および分布のための強力なツールを提供する。抗体が容易でない場合に、in situハイブリダイゼーション 、cDNAマイクロアレイおよびリボヌクレアーゼ保護アッセイにおいて 、ノーザンブロット分析、RT-PCRなどの特定のタンパク質のmRNA発現レベルを検出および定量するために使用される技法は、リアルタイム定量的RT-PCRは、別のアプローチを提供する入手可能であるか、または特定のタンパク質の発現レベルが7低い場合。しかし、このような分子技術の使用への1つの制限は、遺伝子配列の同定が必要である。
網膜中のタンパク質を局在化するために、免疫組織化学は、ホールマウント網膜上で実行することができる。 RGCのアクセシビリティ、ホールマウントにより準備はRGC細胞体とその軸索に特定のタンパク質の局在を研究するための優れたプラットフォームを提供します。
それらの局在に加えて、RGCの中VGCCsのいくつかの機能的特性は、カルシウムイメージング技術の使用によって実証することができる。私たちは、選択的に細胞内カルシウム動態を測定するためにカルシウム指示薬色素でのRGCを標識するカルシウムイメージングプロトコルを記述する。異なる細胞区画内カルシウムシグナルの異なるVGCCsの寄与は、サブタイプ特異的カルシウムチャネル遮断薬を用いて単離することができる。
おそらく、ここで説明するカルシウムイメージング法の最も有益な側面の一つは、同時に独立複数のRGCおよびその軸索を記録する機能である。例えば、全細胞パッチクランプ記録のような多くの生理学的技術は、高時間分解能の膜電流の記録を、体細胞またはthesというの軸索源を提供するが記録された電子電流が判別できず、記録は、一度に1つのニューロンから作ることができる。多重電極アレイ（MEAは）同時に多数のセルからのスパイクを記録することが可能であるが、カルシウムチャネルの、例えば、異なるサブタイプの活性化を検出することも、区別することもできない。 MEAは、優先的に大きなスパイク9を生成する細胞から、指定された電極8とレコードの近くに位置している細胞から記録します。光学イメージング方法は、単一細胞の微小電極およびパッチクランプ記録とMEAの記録から得られた情報と統合することができる細胞の全集団の同時かつ独立の録音を可能にするための代替戦略を提供する。ここで説明するカルシウムイメージング技術は、RGCのカルシウム動態を研究するために使用されたが、パッチクランプおよびMEAはまた、イオン電流およびRGCのスパイク特性を解明するために並列で使用することができる。
<pクラス= "jove_content">避難アマクリン細胞は10網膜マウスにおける神経節細胞層におけるニューロンの人口の約60％を占めているので、私たちの目標は、選択的に、合成カルシウム指示染料でのRGCを標識するローディング技術を使用していたホールマウントの準備。合成カルシウム指示薬色素が細胞内カルシウム動態の研究のための優れたプラットフォームを提供するが、その広範な使用が効果的に与えられたネットワーク内のニューロンの特定の集団をロードすることができないことによって妨げられてきた。そのようなバルク·ロード11及びエレクトロポレーション8,12などの多くの技術が、細胞の全体の集団が、しかしながら、このような技術は、特定の細胞型を区別しないロードするために行われている。遺伝的にコードされたカルシウム指示薬しかしながら、このような方法は、トランスジェニック動物13の生成を必要とする、選択的に細胞の特定の集団を標識する能力を提供する。私たちの技術は、メトを記述dは選択的にカルシウム指示薬色素の視神経の切り株の注射を介してホールマウント準備でのRGCを標識する。総合すると、この資料に記載されている構造的および生理学的な技法は、RGCを、それらの軸索内局在およびカルシウムシグナルにVGCCsの寄与を研究するためのプラットフォームを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
網膜神経節細胞とその軸索のカルシウム動態を解析するために、網膜wholemountsにおける神経節細胞へのFluo-4の局在化、2）カルシウムイメージングを示すために1）免疫組織化学：この記事では、2つの異なる技術を記載している。
wholemountsを用いた免疫組織化学は、げっ歯類網膜20-23におけるタンパク質の局在を明らかにするために使用されてきた。ただし、いく?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、カルシウムイメージングプロトコルへの貢献のために博士S.ステラとヘレンヴォンに感謝します。私たちは、インタビューのシーンを撮影するための博士K.シートに感謝します。私たちは、原稿の彼女のコメントに博士アーリーン平野に感謝します。この研究開発プロジェクトは、遠隔医療·先端技術UCLAの医学デビッドゲフィン学校で著者によって実施され、米国陸軍医学研究および資材コマンド（USAMRMC）により授与され、投与された請負契約により可能になるとW81XWH-10-2-0077：契約番号の下MDフォートデストリックで研究センター（TATRC）、、。これらの研究のためのサポートも、NIH EY04067およびVAメリットレビュー（NB）から来た。 NCBは、VAのキャリア研究員である。
Materials
| Straight scissors | WPI | 14124-G | dissecting tools |
| Straight Forceps | WPI | 501985 | dissecting tools |
| curved iris scissors | WPI | 504487 | dissecting tools |
| Cellulose filter paper | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | Vector | H-1000 | Mounting Media for Fluorescence |
| Fluo-4 pentapotassium | Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | anesthesia |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Zeiss LSM 5 Pascal microscope | Zeiss | ||
| Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Molecular Probes | A-11034 | Secondary antibody |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | A rabbit polyclonal antibody was generated against the N-terminus of the RBPMS polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA). |
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