Abstract
وقد تم إحراز تقدم كبير خلال العقد الماضي نحو تحديد وتوصيف الأنزيمات المشاركة في التوليف (cyclases diguanylate) وتدهور (phosphodiesterases) من رسول الثاني ج-دي-GMP. في المقابل، لا توجد معلومات المتاحة عن الآليات الجزيئية والمكونات الخلوية من خلالها هذا الجزيء يشير ينظم مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية. معظم البروتينات المستجيب معروفة تنتمي إلى عائلة بيلز أو تحولت cyclases diguanylate أو phosphodiesterases التي تخلت عن الحفز واعتمدت وظيفة المستجيب. وهكذا، إلى تعريف أفضل للشبكة ج-دي-GMP الخلوية في مجموعة واسعة من البكتيريا مطلوبة الطرق التجريبية لتحديد والتحقق من صحة المستجيبات الجديدة التي يمكن الاعتماد عليها في التنبؤات سيليكون وتفشل.
لقد وضعت مؤخرا لقطة مجمع رواية الطيف الكتلي (CCMS) القائمة على التكنولوجيا كأداة قوية لتحديد كيميائيا وتوصيف البروتينات ملزمة ج-دي-GMP. وقد سبق وذكرت هذه التقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع من الكائنات الحية 1. هنا نقدم وصفا مفصلا لالبروتوكول الذي نحن نستخدم لتحقيق هذه المكونات الإشارات. وكمثال على ذلك، ونحن نستخدم الزائفة الزنجارية، وهو ممرض الانتهازية التي ج-دي-GMP يلعب دورا حاسما في الفوعة وبيوفيلم السيطرة. حددت CCMS 74٪ (38/51) من المكونات المعروفة أو المتوقعة للشبكة ج-دي-GMP. توضح هذه الدراسة إجراء CCMS بالتفصيل، ويضع على أنها أداة قوية وتنوعا لتحديد مكونات جديدة تشارك في إشارة جزيء صغير.
Introduction
ج-دي-GMP هو رسول الثاني الرئيسي الذي يستخدمه معظم البكتيريا للسيطرة على مختلف جوانب النمو والسلوك. على سبيل المثال، ج-دي-GMP ينظم تقدم دورة الخلية، الحركة والتعبير عن exopolysaccharides وadhesins سطح 2-4. من خلال تنسيق عمليات من هذا القبيل ج-دي-GMP يعزز تشكيل بيوفيلم، وهي عملية ترتبط العدوى المزمنة من مجموعة واسعة من البكتيريا المسببة للأمراض 5. ج-دي-GMP وsynthetized بواسطة إنزيمات تسمى cyclases diguanylate (DGCS) التي تأوي مجال GGDEF الحفاز 4. بعض DGCS تمتلك موقع المثبطة التي تنظم أسفل النشاط محلقة على ج-دي-GMP ملزمة. يتم تحفيز تدهور ج-دي-GMP من قبل اثنين من فصول متميزة من phosphodiesterases (المعادلات التفاضلية الجزئية) بإيواء إما EAL الحفاز أو HD-GYP نطاق 6،7.
الغالبية العظمى من البروتينات المستجيب المعروفة التي تربط ج-دي-GMP مباشرة تنتمي إلى واحدة من الفئات الثلاث فقط من البروتينات: الحفازGGDEF أو EAL المجالات الخاملة حليف والمجالات بيلز، ومفاتيح الجزيئية الصغيرة التي تخضع لتغييرات بتكوين على ج-دي-GMP ملزمة 8. وتتميز كذلك DGCS، المعادلات التفاضلية الجزئية وبيلز البروتينات ويمكن التنبؤ المجالات الخاصة بهم في سيليكون بسلام نسبيا. وتركز اهتمام خاص الآن على تحديد فئات جديدة من المستجيبات ج-دي-GMP. وقد وصفت بعض المؤثرات ج-دي-GMP بزخارف ملزمة مختلفة مثل هذا مؤخرا في CRP / FNR Bcam1349 الأسرة البروتين في بوركهولدريا cenocepacia أو FleQ منظم النسخي في P. الزنجارية 9،10. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحديد مؤخرا riboswitches ج-دي-GMP محددة، وأظهرت للسيطرة على التعبير الجيني بطريقة ج-دي-GMP-تعتمد 11. زخارف ج-دي-GMP ملزمة من المؤثرات المختلفة يتم حفظها بشكل سيئ فقط جعل التنبؤات بيوينفورمتيك هذه البروتينات صعوبة. لمعالجة هذه المسألة، قمنا بتطوير طريقة الكيمياء الحيوية، والتي تقوم على استخدام جمعية مهندسي البترول ج-دي-GMPمجمع التقاط محدَّدة جنبا إلى جنب مع مطياف الكتلة 1،12،13.
لقد المهندسة مؤخرا ثلاثي التكافؤ رواية مجمع ج-دي-GMP القبض على (صندوق الإيداع والتدبير-CC، الشكل 1) 1. وتتألف هذه سقالة الكيميائي لل: 1) شاردة ج-دي-GMP تستخدم كطعم للقبض ج-دي-GMP البروتينات ملزمة، 2) مجموعة رد الفعل للأشعة فوق البنفسجية photoactivatable تستخدم لعبور الارتباط صندوق الإيداع والتدبير-CC للبروتينات ملزمة و 3) البيوتين لعزل البروتينات استولت باستخدام الخرز streptavidin المغلفة المغناطيسية. صندوق الإيداع والتدبير-CC يمكن استخدامها لالتقاط المستجيبات ج-دي-GMP مباشرة وتحديدا من خليط معقد من الجزيئات كما لست] الخلية. القبض على مجمع أساس وسبق وذكرت النهج الكيميائية البروتيوميات القائم على أن تنطبق على مجموعة واسعة من الكائنات الحية، على سبيل المثال العنيقاء crescentus، السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية وP. الزنجارية 1،14.
في هذه الورقة المنهجية،نحن نقدم لفي وصف عمق الإجراء CCMS باستخدام مقتطفات من P. الزنجارية كمثال على ذلك. وتحدد هذه الدراسة CCMS كأداة قوية وتنوعا لتحديد كيميائيا مكونات جديدة تشارك في إشارة جزيء صغير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد المحللة
- تنمو P. خلايا الزنجارية في LB إلى OD المطلوب.
ملاحظة: للحصول على إرشادات: استخدام ≈ 100 مل ثقافة / عينة للثقافات مرحلة ثابتة و≈ 500 مل الثقافيه / عينة للثقافات المرحلة السجل (OD ل 600Nm = 0.5). - بيليه بواسطة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 5،000 ز س.
- في resuspend 0.5-1 غرام من بيليه في 1 مل العازلة تحلل (6.7 ملي MES، 6.7 ملي HEPES، 200 مم كلوريد الصوديوم، 6.7 ملي شركة الخطوط الجوية الكويتية، DDT 1 ملم، ودرجة الحموضة 7.5) وإضافة مثبطات الأنزيم البروتيني (ميني كاملة، خالية من EDTA)، وكذلك كما DNaseI.
- ليز الخلايا بنسبة 3 مقاطع من خلال خلية ضغط الفرنسية، في 20،000 رطل (انظر قائمة المواد).
- فائقة الطرد المركزي المحللة الخلية في 100،000 ز س لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
- حفظ طاف (انتقل إلى الخطوة 2).
- غسل بيليه مع 1 مل 1X العازلة تحلل من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
- نابذة فائقة السرعة في 100،000 ز س لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
- فلاش-تجميد بيليه فيالنيتروجين السائل وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى استخدامها لإلقاء القبض على بروتينات الغشاء (راجع الخطوة 3).
2. إزالة مجانية ج-دي-GMP وغيره من النيوكليوتيدات (الكسر القابلة للذوبان فقط)
- غسل عمود PD10 تحلية (انظر قائمة المواد) مع 10 مل من تحلل العازلة البارد.
- صب طاف ≈ (1 مل) على PD10 من أجل إزالة النيوكليوتيدات.
- أزل مع 4 مل تحلل الباردة عازلة (500 الخطوات ميكرولتر).
- حدد الكسور الأكثر تركيزا على النحو الذي يحدده برادفورد الفحص، وتجميع لهم.
3. إعادة تعليق بيليه والإذابة (الكسر غشاء فقط)
- Resuspend وبيليه في 500 إلى 1،000 ميكرولتر من التقاط 1X عازلة (دون المنظفات) (انظر الجدول 1).
ملاحظة: بيليه صعب ل resuspend. ينصح ماصة الأول صعودا وهبوطا مع ماصة ل resuspend ما يقرب من بيليه، ثم استخدام حقنة 27 G إلى التجانس جيدا الحل. - إضافة 1٪ (ث / ت) ن دوديسيل-β-D-maltopyranoside (DDM).
- احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة (أو O / N) على عجلة دوارة.
- نابذة فائقة السرعة في 100،000 ز س لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
- حصاد طاف.
4. البروتين قياس تركيز
- قياس تركيز البروتين برادفورد فحص (عن طريق فحص BCA لجزء الغشاء).
- تعيين تركيز البروتين الكلي إلى 10 ملغ / مل.
5. لقطة
- مزيج 300 ميكروغرام من البروتين مع 1 ملم من الناتج المحلي الإجمالي، GTP، ATP، CTP، و 20 ميكرولتر من التقاط 5X العازلة (100 ملي HEPES، 250 ملي شركة الخطوط الجوية الكويتية، 50 ملي MgAc، 5٪ الجلسرين، ودرجة الحموضة 7.5) (الجدول 1). ضبط حجم رد الفعل إلى 100 ميكرولتر مع H 2 O.
ملاحظة: يتضمن إجمالي حجم حجم صندوق الإيداع والتدبير-CC وج-دي-GMP في حالة سيطرة المنافسة (انظر الخطوة 5.3 و الجدول 2).
ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب في 200 &# 181؛ ل 12 أنبوب شرائط PCR (الحرارية العلمية).
ملاحظة: لجزء الغشاء، تأكد من أن تبقي دائما تركيز DDM فوق تركيز مذيلة الحرج (0.01٪ ث / ت) حتى الخطوة البروتين الإذابة في 8 M اليوريا (الخطوة 7.1). - احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على عجلة دوارة.
- إضافة 10 ميكرومتر صندوق الإيداع والتدبير-CC (تركيز النهائي).
ملاحظة: تشمل السيطرة من دون صندوق الإيداع والتدبير-CC (يشار إليه بأنه "السيطرة حبة")، والتحكم تستكمل مع 1 ملم ج-دي-GMP ("السيطرة المنافسة") (انظر الجدول 2).
ملاحظة: يمكن تعديل تركيز صندوق الإيداع والتدبير-CC 1-10 ميكرومتر. - احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة (O / N لجزء الغشاء) على عجلة دوارة، في الظلام.
- بعد زيادة ونقصان قصيرة، عبر الارتباط التي كتبها تفعيل شاردة رد الفعل من صندوق الإيداع والتدبير-CC مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 4 دقائق، وذلك باستخدام CaproBox (انظر قائمة المواد، λ = 310 نانومتر، تشعيع ≥10 ميغاواط / سم ²، وبعد المسافة من المصدر = 2 سم). ملاحظة: إزالة الغطاء من شرائط مسبق عبر ربط.
- إضافة 25 ميكرولتر 5X غسل العازلة (5 M كلوريد الصوديوم، و 250 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.5)، و 50 ميكرولتر من معلق كذلك حبات مغناطيسية streptavidin، التجانس بلطف.
- احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على عجلة دوارة.
6. غسل خطوات
ملاحظة: (مغناطيس: انظر قائمة المواد). تبدأ مع القبض على حبات مغناطيسية في شريط غطاء PCR، مع المغناطيس. ثم استبدال الشريط PCR من قبل واحدة جديدة تحتوي على حل غسل المقبل. إزالة المغناطيس و resuspend الخرز، واحتضان 2 دقيقة. تدور باستمرار واستبدال غطاء من قبل غطاء جديد.
- خطوات الغسيل (جزء قابل للذوبان فقط)
- يغسل 6 مرات في 200 ميكرولتر 1X عازلة الغسيل.
- يغسل مرة واحدة في 200 ميكرولتر HPLC الصف H 2 O.
- يغسل 6 مرات في 200 ميكرولتر 80٪ الأسيتونتريل.
- غسل 2 مرات في 200 ميكرولتر HPLC الصف H 2 O.
- خطوات الغسيل (الاغشيهشمال شرق جزء فقط)
- يغسل 5 مرات في 200 ميكرولتر 1X غسل العازلة + 0.1٪ DDM.
- غسل 2 مرات في 200 ميكرولتر 1X غسل العازلة + 0.05٪ DDM.
- يغسل مرة واحدة في 200 ميكرولتر 1X غسل العازلة + 0.025٪ DDM.
- يغسل مرة واحدة في 200 ميكرولتر 1X غسل العازلة + 0.0125٪ DDM.
- يغسل 3 مرات في 200 ميكرولتر 100 ملي ABC (بيكربونات الأمونيوم، NH 4 CO 3) + 2 M اليوريا.
7. MS إعداد نموذج
- resuspend والخرز (مباشرة في الغطاء) في 20 ميكرولتر 100 ملي ABC (100 ملي ABC + 8 M اليوريا لجزء الغشاء) ونقل إلى 1.5 مل أنابيب.
- غشاء جزء فقط: احتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والهز في 500 دورة في الدقيقة.
- إضافة 0.5 ميكرولتر 200 ملي TCEP (تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين)، واحتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، والهز في 500 دورة في الدقيقة. يبرد إلى درجة حرارة 25 درجة مئوية.
- إضافة 0.5 ميكرولتر من الطازجة 400 ملي iodoacetamide واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، والهز لر 500 دورة في الدقيقة و في الظلام.
- إضافة 0.5 ميكرولتر 0.5 M N -acetyl السيستين واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، والهز في 500 دورة في الدقيقة.
- غشاء جزء فقط: إضافة 1 ميكرولتر ليز-C واحتضان عند 37 درجة مئوية، O / N.
- إضافة 2 ميكروغرام التربسين واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية، والهز في 500 دورة في الدقيقة (التفاف في بارافيلم لمنع جفاف).
ملاحظة: يمكن تخزين العينات في -20 ° C في هذه المرحلة.
ملاحظة: جزء غشاء فقط: إضافة 100 ملي ABC لضبط تركيز اليوريا إلى <2 M قبل إضافة التربسين. - تدور لفترة وجيزة أسفل أنابيب وجمع حبات مع المغناطيس.
- نقل طاف في أنبوب جديد 1.5 مل (كرر هذه الخطوة إذا ترك الخرز).
- إضافة 5 ميكرولتر 5٪ TFA (حمض trifluoroacetic) + 1 ميكرولتر 2 M حمض الهيدروكلوريك (15 ميكرولتر 5٪ TFA + 5 ميكرولتر 2 M حمض الهيدروكلوريك لجزء الغشاء).
- أعمدة حالة C18 MicroSpin (المجموعة عش، MA، الولايات المتحدة الأمريكية) مع 150 ميكرولتر أسيتونتريل (تدور 20 ثانية في 2،400 دورة في الدقيقة).
- متساوlibrate الأعمدة C18 2 مرات مع 150 ميكرولتر 0.1٪ TFA (تدور و 20 ثانية، 2،400 دورة في الدقيقة).
- تحميل العينة وتدور 2 دقيقة، 2،000 دورة في الدقيقة.
- تحديث الصفحة من خلال تدفق على العمود وكرر الخطوة الغزل (2 دقيقة، 2،000 دورة في الدقيقة).
- يغسل 3 مرات مع 150 ميكرولتر 0.1٪ TFA، 5٪ الأسيتونتريل (20 ثانية، 2،400 دورة في الدقيقة).
- خذ أنبوب جديد وأزل مرتين مع 150 ميكرولتر 0.1٪ TFA، 50٪ الأسيتونتريل (2 دقيقة، 2،000 دورة في الدقيقة).
- تجفيف الببتيدات في-VAC السرعة.
- resuspend في 40 ميكرولتر 98٪ H 2 O، 2٪ الأسيتونتريل، وحمض الفورميك بنسبة 0.15٪.
- يصوتن 20 ثانية (دورة نبض 0.5، السعة 100٪؛ انظر قائمة المواد)، وتدور باستمرار 5 ثانية، 12،000 دورة في الدقيقة (الفوق الطرد المركزي). دوامة 10 ثانية، وتدور باستمرار 5 ثانية، 12،000 دورة في الدقيقة. نقل في قارورة HPLC لتحليل LC-MS / MS.
- تجميد في -20 ° C.
ملاحظة: يمكن تخزين العينات في -20 ° C في هذه المرحلة.
8. LC-MS / MS تحليل
- تشغيل نانو-LC (أنظمة نانو-LC) تجهيز المنطقةإد مع عمود RP-HPLC (75 ميكرون × 37 سم) معبأة مع الراتنج C18 (ماجيك C18 عبد القدير 3 ميكرون) باستخدام الانحدار الخطي من 95٪ المذيبات ألف (حمض الفورميك بنسبة 0.15٪، 2٪ الأسيتونتريل) و 5٪ المذيبات B ( 98٪ الأسيتونتريل، وحمض الفورميك 0.15٪) إلى 35٪ المذيبات B أكثر من 60 دقيقة بمعدل تدفق 0.2 ميكرولتر / دقيقة.
- تحليل الببتيدات باستخدام LC-MS / MS (الضغط المزدوج LTQ-Orbitrap Velos مطياف الكتلة، متصلا مصدر أيون electrospray).
ملاحظة: تم تعيين وضع الحصول على البيانات للحصول على واحدة عالية الدقة MS مسح في الجزء FT من مطياف الكتلة على قرار من 60،000 FWHM تليها بالاشعة MS / MS في فخ ايون الخطي من 20 الأيونات على أشده. لزيادة كفاءة محاولات MS / MS، تم تمكين اتهم الدولة فحص عمل لاستبعاد غير المعينة ويتقاضى منفردة الأيونات. واندلعت التواطؤ الناجم عن تفكك عندما تجاوز السلائف 100 تهمة أيون. تم تعيين المدة استبعاد ديناميكية لمدة 30 ثانية. تم ضبط الوقت تراكم أيون إلى 300 مللي ثانية (MS) و 50ميللي ثانية (MS / MS).
9. قاعدة بيانات البحث
- تحميل P. الزنجارية NCBI قاعدة البيانات عن طريق موقع NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
- تحويل أطياف MS الخام إلى تعويذة الملفات العامة (إم جي إف) باستخدام أداة تحويل MassMatrix ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
- إبحث في هذا الملف إم جي إف باستخدام التميمة الإصدار 2.3 ضد P. الزنجارية NCBI قاعدة بيانات تحتوي على إدخالات إلى الأمام والبروتين عكس شرك.
- إجراء في SILICO التربسين الهضم بعد يسين وأرجينين (ما لم يتبعه البرولين) التسامح مع اثنين من غاب الانشقاقات في الببتيدات زيتية بالكامل.
- تعيين المعلمات البحث في قاعدة البيانات للسماح methionines المؤكسد (+15.99491 دا)، والتعديلات المتغيرة وcarboxyamidomethylation (+57.021464 دا) من بقايا السيستين كما التعديل الثابتة. لالتميمة بالبحث لنابالاشعة عالية الدقة جي، تعيين التسامح الشامل تمهيدا ل15 جزء في المليون وتعيين التسامح الشامل جزء إلى 0.6 دا. وأخيرا، تعيين البروتين روزفلت إلى 1٪.
- استيراد عمليات البحث التميمة من P. تجارب الزنجارية CCMS إلى سقالة (Proteomesoftware، الإصدار 3)، تعيين المعلمات للحصول على فرانكلين روزفلت على مقربة من البروتين إلى 1٪، واستخراج مجموع التهم الطيفية.
- لنتائج ممثلة قدمت في هذه الورقة، استخدمنا اختبار T المقترنة مقارنة التجربة مع مراقبة المنافسة، واعتبر فقط يضرب بقيمة ص أقل من 0.1، ونسبة عدد الطيفية فوق 2 (تجربة التهم الطيفية / تحكم المنافسة الطيفية التهم).
- يمكن تصدير البيانات في أي برنامج جداول البيانات لمزيد من التحليل.
10. تسمية خالية الكمي
- استيراد ملفات الخام إلى تكاثر مبكر LC-MS البرمجيات (الديناميات غير الخطية، الإصدار 4.0).
- أداء LC-MS المحاذاة والكشف عن ميزة في SETTI الافتراضيخ ع.
- تصدير البيانات في شكل إم جي إف من تكاثر مبكر LC-MS.
- بحث أطياف MS / MS باستخدام التميمة ضد NCBI P. قاعدة بيانات تحتوي على الزنجارية إلى الأمام وإدخالات البروتين عكس شرك.
- استيراد نتائج البحث قاعدة البيانات إلى تكاثر مبكر LC-MS ورسم خريطة للالببتيدات التعرف على الميزات MS1.
- لتقييم البيانات (حساب مستويات الأهمية، ونسب أضعاف تغيير) تم استخدام النصي ProteinSQAnalysis من SafeQuant (عتبة: قيمة ف أقل من 0.1، ونسبة عدد الطيفية فوق 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتحديد رواية المستجيبات ج-دي-GMP في P. الزنجارية استخدمنا منهجية CCMS لتحليل الكسور القابلة للذوبان وغشاء P. الزنجارية سلالة PAO1 من ثقافة مرحلة سجل (OD 600 = 0.5). نحن هنا تلخيص ومناقشة نتائج ممثلة لهذه رحلة صيد. استخدمت أربع النسخ المتماثلة البيولوجية مستقلة. لكل تجربة استخدمت اثنين من تركيزات صندوق الإيداع والتدبير-CC مختلفة (5 ميكرومتر و 10 ميكرومتر). للتحقيق للخصوصية، أجريت تجارب في وجود أو عدم وجود 1 ملم ج-دي-GMP كما منافس، وأخيرا، مع جهاز تحكم عن حبة (أي من دون صندوق الإيداع والتدبير-CC) (الجدول 1).
عند اتباع الطريقة الموصوفة بالتفصيل أعلاه (الشكل 2) أنتجنا قائمة البروتينات المأسورة في شكل سقالة. تم إزالة الملوثات المحتملة. وشملت هذه البروتينات الريباسي، streptavidin، التربسين، الزلال في الدم، الكيراتين والبروتينات البشرية الأخرى. البروتينتم تعيين تحديد معدل اكتشاف كاذبة (FDR) إلى 1٪ باستخدام برنامج سقالة، والبيانات تصديرها إلى التفوق. ويمكن تحويل عدد الانضمام المقدمة من سقالة إلى أرقام موضع باستخدام وظيفة VLOOKUP في Excel مرتبط إلى قائمة P. أرقام موضع الزنجارية. في هذه المرحلة، وتضم قائمة ضرب 768 البروتينات لجزء قابل للذوبان و 433 البروتينات لجزء الغشاء. ومع ذلك، لا يتم إثراء معظم البروتينات بشكل كبير في التجربة الالتقاط. وهكذا، تم إزالة البروتينات التي من المرجح يتم التقاطها غير تحديدا (الإيجابية في السيطرة حبة أو فقط في وجود ج-دي-GMP منافس). حسبنا نسبة عدد الطيفية بين التجربة القبض والسيطرة المنافسة والبروتينات تعتبر فقط مع نسبة أكبر من اثنين. وبالإضافة إلى ذلك قمنا بتوظيف تقرن اختبار t على التهم الطيفية لتوفير قدر أهمية بين التجربة القبض والسيطرة والمنافسة، ووضع عتبة متساهلة 0.1. أخيرا، رأيناها فقط ضربات قوية مع أربعة على الأقل الببتيدات التي تم تحديدها في أربع تجارب لتركيزات مجمع 2 القبض اتخذت تماما. ينبغي تعديل هذه المعايير وفقا لاحتياجات واستخدام التحقق منها وتوقع ج-دي-GMP البروتينات ملزمة وفقا لمعايير لضبط عتبة. بعد الفرز، وقد انخفضت هذه القائمة إلى 76 ضربات لجزء القابلة للذوبان، و 133 البروتينات لجزء الغشاء. وشمل ذلك 13 القابلة للذوبان و21 بروتينات الغشاء من P. الزنجارية التي يعرف أو يتوقع أن ربط ج-دي-GMP (الجدول 2). 63 قابل للذوبان و 112 بروتينات غشاء أخرى هي بروتينات المفترضة جديدة ج-دي-GMP ملزمة التي لا تحتوي على واحد من المجالات ملزمة ج-دي-GMP المعروفة. هذه الزيارات لها الآن أن التصديق عليها من قبل اختبار محددة لها ملزمة لج-دي-GMP.
في الشاشة السابقة نحن صيد GlyA2 (PA2444)، GlyA3 (PA4602) وGsp69 (PA1127) 1. تم استنساخ هذه البروتينات 3، overexpressed، وتنقيته منE. coli و يمكن التحقق من صحة لربط ج-دي-GMP في التجارب ربط الأشعة فوق البنفسجية عبر استخدام 33 P المسمى ج-دي-GMP 15. تم تحديد K د ق إلى 1.0، 2.0 و 6.9 ميكرومتر على التوالي، مشيرا إلى أن المستجيبات جديدة في الواقع يمكن تحديدها باستخدام CCMS.
وبالإضافة إلى هذا المثال التمثيلي، استخدمنا CCMS مع مقتطفات من الخلايا التي تحصد من شروط النمو المختلفة ومع مختلف تركيزات ج-دي-GMP داخل الخلايا (ن = 24). عموما نحن القبض على 74٪ (38/51) من المعروف أو توقع P. الزنجارية PAO1 ج-دي-GMP مكونات الإنذار (24/32 البروتينات القابلة للذوبان، 14/19 بروتينات الغشاء). وبالنظر إلى أن عرضت تسعة على الأقل من هذه الجينات أن يتم نسخها في ظل ظروف محددة (الاكسدة، والاستشعار عن النصاب، الأغشية الحيوية) 16 وأن البعض قد لا تربط ج-دي-GMP في كل شيء، هذه الدرجة من تغطية قد تكون قريبة من التشبع. هذا مع ملاحظة أن معظم هذه المكونات ثيحرث أسر مع خصوصية عالية (الجدول 2) يجادل بقوة أن هذه التقنية فعالة وقوية.
الشكل 1: التركيب الكيميائي للج-دي-GMP مجمع لقطة.
الشكل 2: CCMS ملخص سير العمل بعد تحلل الميكانيكية تتم إزالة النيوكليوتيدات الحرة باستخدام عمود استبعاد PD10. يتم تحضين البروتينات من كسور قابلة للذوبان أو الغشاء مع صندوق الإيداع والتدبير-CC ويتعرض الخليط للأشعة فوق البنفسجية إلى عبر الارتباط البروتينات القبض عليه. يتم تنفيذ خطوات غسل قاسية مع مركبات بد أن streptavidin الخرز المغناطيسي المغلفة. على حبة يوفر الهضم زيتية الببتيدات،يتم بعد ذلك فصل من الخرز والبروتونية لتحديد قياس الطيف الكتلي الخاصة بهم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: Volcanoplots من P. البروتينات الزنجارية أثرت بشكل كبير من قبل CCMS. وبعد تحليل LC-MS / MS وخالية من التسمية الكمي، تم فرز بروتينات كما هو موضح في النص. تم حساب نسبة Log2 الحدة من الببتيد الكشف بين القبض والمنافسة التجارب ورسم مقابل القيم المستمدة من تحليل الدلالة (تعديل إحصاء t، التجريبية طريقة بايز 17). البروتينات داخل العتبات أهمية لف القيم <نسب 0.05 وكثافة> 1.5 أضعاف ما indicatإد في مربع رمادي. 4 يعيد لجزء قابل للذوبان (A) وجزء الغشاء (B) تم تنفيذها في وجود 10 ميكرومتر ج-دي-GMP-CC، والتجربة المنافسة مع 1 ملم ج-دي-GMP. النقاط حلقت تتوافق مع البروتينات ملزمة ج-دي-GMP المعروفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| القبض على: | عازلة | مادة كيميائية | مصدر | تركيز | |||||
| بكتيريا الاحتياطي تحلل 10X | MES | سيغما | 67 ملي | ||||||
| الرقم الهيدروجيني 7.5 | HEPES | سيغما | 67 ملي | ||||||
| كلوريد الصوديوم | أناRCK | 2 M | |||||||
| نا خلات | ميرك | 67 ملي | |||||||
| DTT | Fluka | 10 ملي | |||||||
| DNaseI | روش | 20 U / مل | |||||||
| كامل البروتياز المانع كوكتيل | روش | علامة التبويب 1/10 مل | |||||||
| التقاط العازلة 5X | HEPES | سيغما | 100 ملي | ||||||
| شركة الخطوط الجوية الكويتية | سيغما | 250 ملي | |||||||
| MgAc (اللامائية) | سيغما | 50 ملي | |||||||
| الغليسيرول | سيغما | 50٪ (V / V) | |||||||
| الناتج المحلي الإجمالي، GTP، ATP، CTP | سيغما | 1 ملم كل | غسل 5X عازلة | تريس، حمض الهيدروكلوريك | ميرك | 1 M | |||
| (لجزء قابل للذوبان) | EDTA | سيغما | 0.5 M | ||||||
| الرقم الهيدروجيني 7.5 | كلوريد الصوديوم | سيغما | 5 M | ||||||
| ن الأوكتيل-β-D-glucopyranoside | Anagrade (Affymetrix) | 42.5 ميكرومتر | |||||||
| غسل 5X عازلة | تريس، حمض الهيدروكلوريك | ميرك | 1 M | ||||||
| (لجزء الغشاء) | EDTA | سيغما | 0.5 M | ||||||
| الرقم الهيدروجيني 7.5 | كلوريد الصوديوم | سيغما | 5 M | ||||||
| المواد الكيميائية الأخرى: | بيكربونات الأمونيوم (ABC) | Fluka | |||||||
| اليوريا | Applichem | ||||||||
| MS تحضير العينة: | عازلة | مادة كيميائية | مصدر | تركيز | |||||
| C18 العازلة A | TFA | ثقب | 0.1٪ (V / V) | ||||||
| H 2 O HPLC الصف | 99.9٪ (V / V) | ||||||||
| C18 B الاحتياطي | TFA | ثقب | 0.1٪ (V / V) | ||||||
| الأسيتونتريل | Biosolve | 49.9٪ (V / V) | |||||||
| H 2 O HPLC الصف | 50٪ (V / V) | ||||||||
| C18 العازلةC | TFA | ثقب | 0.1٪ (V / V) | ||||||
| الأسيتونتريل | Biosolve | 5٪ (V / V) | |||||||
| H 2 O HPLC الصف | 94.9٪ (V / V) | ||||||||
| LC العازلة A | حمض الفورميك | سيغما | 0.15٪ (V / V) | ||||||
| الأسيتونتريل | Biosolve | 2٪ | |||||||
| H 2 O HPLC الصف | 97.85٪ | ||||||||
| المواد الكيميائية الأخرى: | تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين (TCEP) | سيغما | |||||||
| iodoacetamide (IAA) | سيغما | ||||||||
| N -acetyl السيستين | سيغما | ||||||||
| Endoproteinase ليز-C | واكو | ||||||||
| التربسين | PROMEGA |
الجدول 1: مخازن تكوين ملخص للمخازن تكوينها، والمواد الكيميائية والموردين. يتم تضمين-GMP التقاط ج-دي المركب، ج-دي-GMP (لمراقبة المنافسة)، streptavidin الخرز المغناطيسي المغلفة، والتقاط العازلة، وغسل العازلة في caproKit.
| السيطرة حبة | القبض على التجربة | السيطرة المنافسة | |
| استخراج البروتين (10 ملغ / مل) | 30 ميكرولتر | 30 ميكرولتر | 30 ميكرولتر |
| ج-دي-GMP (10 ملي) | 0 ميكرولتر | 0 ميكرولتر | 10 ميكرولتر |
| النيوكليوتيدات (10 ملم من كل النوكليوتيدات) | 10 ميكرولتر | 10 ميكرولتر | 10 ميكرولتر |
| 5X التقاط عازلة | 20 ميكرولتر | 20 ميكرولتر | 20 ميكرولتر |
| H 2 O | 42 ميكرولتر | 32 ميكرولتر | 22 ميكرولتر |
| 30 دقيقة حضانة | |||
| ج-دي-GMP ~ CC (الأسهم 100 ميكرومتر) | 0 ميكرولتر | 5-10 ميكرولتر | 5-10 ميكرولتر |
| تركيزات النهائي: | السيطرة حبة | القبض على التجربة | السيطرة المنافسة |
| ج-دي-GMP ~ CC (ميكرومتر) | 0 ميكرومتر | 5-10 ميكرومتر | 5-10 ميكرومتر |
| منافس ج-دي-GMP (ميكرومتر) | 0 ميكرومتر | 0 ميكرومتر | 1،000 ميكرومتر |
الجدول 2: القبض على مزيج رد فعل ملخص من مزيج رد فعل لمراقبة حبة (أي دون القبض على مركب)، التجربة القبض على (مع ج-دي-GMP-CC)، ومراقبة المنافسة التي تحتوي على فائض كبير من ج دي-GMP. التركيز النهائي ج-دي-GMP-CC يمكن تعديلها، وعادة ما يتم تعيين ما بين 5 و 10 ميكرومتر.
| اسم البروتين | مكان ID | العمارة المجال | القبض على التجربة / المنافسة التجربة 1 | ||||||||||||||||||
| أ) جزء القابلة للذوبان | صندوق الإيداع والتدبير-CC = 5 ميكرومتر | صندوق الإيداع والتدبير-CC = 10 ميكرومتر | |||||||||||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF * | 14/0 | 14/0 | 13/0 | 11/0 | 14/0 | 12/0 | 14/0 | 14/0 | |||||||||||
| WspR | PA3702 | REC-GGEEF * | 9/0 | 9/0 | 10/0 | 9/0 | 11/0 | 10/0 | 11/0 | 11/0 | |||||||||||
| - | PA2567 | GAF-SPTRF-EAL | 8/0 | 4/0 | 9/0 | 0/0 | 7/0 | 3/0 | 8/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | بيلز | 11/0 | 12/0 | 13/0 | 12/0 | 12/0 | 10/0 | 11/0 | 12/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 5/0 </ td> | 3/0 | 6/0 | 5/0 | 8/0 | 5/0 | 6/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA5295 | GDDEF-EAL | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 1/0 | 6/0 | 6/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| FimX | PA4959 | PAS-GDSIF-EVL | 23/1 | 21/0 | 21/0 | 11/0 | 24/3 | 23/2 | 22/0 | 20/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | بيلز | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 0/0 | 3/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | بيلز | 3/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | بيلز | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | ||||||||||||
| - | PA4324 | بيلز | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3177 | GGEEF | 2/0 | 1/0 | 3/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4396 | REC-DEQHF | 0/0 | 1/0 | 4/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 5/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0169 | GGEEF * | 3/0 | 2/0 | 6/0 | 7/0 | 7/1 | 6/2 | 9/1 | 7/1 | |||||||||||
| - | PA2799 | بيلز | 1/0 | 0/0 | 2/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA5017 | PAS-GAF-PAS-ASNEF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 3/2 | 0/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA5487 | GGEEF * | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| ب) جزء غشاء | صندوق الإيداع والتدبير-CC = 5 ميكرومتر | صندوق الإيداع والتدبير-CC = 10 ميكرومتر | |||||||||||||||||||
| - | PA2072 | CHASE4-TM-PAS-GGDEF-EAL | 13/1 | 25/0 | 27/0 | 19/0 | 36/0 | 36/0 | 31/0 | 23/0 | |||||||||||
| - | PA0861 | TM-PAS-GGDEF-ELL | 6/1 | 14/0 | 13/0 | 10/0 | 17/0 | 18/0 | 13/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | بيلز | 6/0 | 10/0 | 9/0 | 7/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 5/0 | |||||||||||
| - | PA3343 | 5TM-GGDEF | 3/0 | 7/0 | 7/0 | 4/0 | 12/0 | 10/0 | 7/0 | 7/0 | |||||||||||
| - | PA1181 | MASE1-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-ELL | 3/0 | 6/0 | 9/0 | 3/0 | 12/0 | 12/0 | 5/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA0847 | TM-CHASE4-HAMP-PAS-GGDEF | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 1/0 | 15/0 | 13/0 | 8/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA0575 | PBPb-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL | 1/0 | 7/0 | 6/0 | 3/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 2/0 | |||||||||||
| yfiN | PA1120 | 2TM-HAMP-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 3/0 | 5/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 1/0 | 4/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 5/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4929 | 7TMR: DISMED2-7TMR: DISMED2-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | |||||||||||
| مورا | PA4601 | TM-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL | 3/0 | 7/0 | 7/3 | 5/0 | 9/0 | 10/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| - | PA1851 | 5TM-GGDEF | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA2870 | TM-GGDEF | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3311 | TM-MHYT-MHYT-MHYT-AGDEF-EAL | 1/1 | 5/0 | 7/1 | 4/0 | 8/0 | 8/0 | 5/1 | 3/0 | |||||||||||
| bifA | PA4367 | TM-GGDQF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 2/1 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | بيلز | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 3/0 | 3/0 | 2/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4332 | 5TM-GGEEF | 1/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | بيلز | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | بيلز | 4/0 | 8/0 | 7/0 | 7/0 | 5/2 | 11/2 | 7/2 | 8/3 | |||||||||||
| - | PA1433 | HAMP-RGGEF-KVL | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF | 0/0 | 0/0 | 1/1 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | * = GGDEF النطاق التي تحتوي على موقع I | ||||||||||
| 1 عدد من التهم الطيفية من الببتيدات التي تم تحديدها | |||||||||||||||||||||
الجدول 3: P. الزنجارية المعروف ج-دي-GMP يشير مكونات استولت على وجه التحديد. تم فرز البروتينات التي تم تحديدها أولا كما هو موضح في النص. ويتم تحديد البروتينات مع لاسم ومكان عددهم، وتبين لنا توقعت العمارة مع قاعدة البيانات أداة NCBI الحفاظ المجال على الانترنت (ن = 4، صندوق الإيداع والتدبير-CC = 5 ميكرومتر أو 10 ميكرومتر) وذلك لإظهار القبض على خصوصية واستنساخ هذه الطريقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وينبغي إيلاء عناية خاصة في عدة خطوات للبروتوكول. تركيز البروتين هو معلمة حرجة مع تركيز 10 ملغ / مل يجري يصعب الوصول إليها عندما تزرع الخلايا تحت ظروف النمو محددة (مثل الأغشية الحيوية أو المتغيرات مستعمرة صغيرة). وبالتالي، ينبغي إجراء إعادة تعليق بيليه في حجم منخفض من تحلل العازلة. يمكن انخفضت تركيزات البروتين إلى 8 ملغ / مل. مقارنة مع الطريقة التي نشرتها Nesper وآخرون. 1، واضاف نحن المختلفة النيوكليوتيدات لالتقاط رد فعل للحد من اسر غير محدد من النوكليوتيدات ملزم البروتينات. على الرغم من أن إضافة النيوكليوتيدات تحسنت خصوصية، فقد في نفس الوقت منع القبض على البروتينات التي تربط النيوكليوتيدات المختلفة في نفس الموقع. على سبيل المثال FleQ المستجيب، التي كانت تظهر في الآونة الأخيرة لربط ATP وصيد ج-دي-GMP 18 على وجه التحديد في غياب ATP في تجربتنا السابقة 1، ولكن ليس بعد الآن في دآتا المقدمة هنا في وجود فائض من ATP.
صندوق الإيداع والتدبير-CC يجب أن تكون محمية بعناية من الضوء. على الرغم من أن الضوء المحيط يحتوي فقط على جزء صغير من الأشعة فوق البنفسجية، فمن المستحسن للحفاظ على المخزون القبض على مركب ملفوفة في رقائق الألومنيوم، فضلا عن مزيج القبض قبل التنشيط من خلال أشعة فوق البنفسجية. خطوات الغسيل التي تتبع يمكن أن يكون صارما جدا لزيادة خصوصية، حيث أن البروتينات القبض وتساهميا ملزمة لصندوق الإيداع والتدبير-CC. وفيما يتعلق تحليل LC-MS / MS، ينبغي إجراء التجارب في بيئة خالية من الكيراتين نظيفة. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تستخدم مخازن متوافقة HPLC، خصوصا بعد خطوات الغسيل. ويضم قائمة المرشحين عادة ما بين 300 و 800 البروتينات (لquadruplicate)، مع وجود اختلافات قليلة بين مكررات (انظر الجدول 2 كمثال).
قد تحتاج بعض المعلمات مثل البروتين وتركيز صندوق الإيداع والتدبير-CC أن يكون الأمثل اعتمادا على الكائنات الحية علىnalyzed. منذ البروتينات وفيرة منخفضة أو البروتينات أعرب إلا في ظل ظروف محددة يمكن أن تضيع بسهولة، ينبغي توخي الحذر فيما يتعلق بظروف ثقافة العاملين. ويمكن التغلب على هذه المشكلة من خلال مقارنة قائمة الاغتيالات مع ATLAS البروتين العالمية التي تم جمعها لظروف الثقافة نفسها. وأخيرا، وتعظيم الاستفادة من المنظفات يمكن أن يكون تحديا، لأنه يحتاج إلى أن يكون الأمثل فيما يتعلق بقدرته على إذابة البروتينات الغشاء ويجب أن يكون MS متوافقة أيضا.
يحتاج المرء أن نأخذ في الاعتبار أن جزيء ج-دي-GMP من CC يتم تعديل كيميائيا، كما يرتبط ذلك عبر مجموعة 2'OH من الريبوز واحد لبقية السقالة. هذا التعديل يمكن أن يغير قدرته على ربط بعض المؤثرات وبالتالي توفير-السلبيات كاذبة. وفي هذا السياق تجدر الإشارة إلى أننا لم القبض على البروتينات التي تؤوي مجال EAL ولكنها تفتقر مجال GGDEF في P. الزنجارية، على الرغم من أن تم القبض على البروتينات EAL في الأنواع الأخرى، مثل سلى الرأسcrescentus obacter. وهذا يمكن أن يكون راجعا إلى وصول الفقراء أو تقارب منخفضة من صندوق الإيداع والتدبير-CC إلى موقع ملزم، أو إلى تدهور صندوق الإيداع والتدبير-CC من البروتينات EAL. في المقابل، تم القبض على العديد من البروتينات ملزم النوكليوتيدات مع خصوصية منخفضة نسبيا، وإلى درجة كبيرة، وربما ايجابيات كاذبة. مزيد من التحقق من صحة محددة ملزمة لج-دي-GMP باستخدام تقنيات مثل DRaCALA 20، الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط 15، المسح التفاضلي fluorimetry (DSF) 21، thermophoresis الميكروسكيل (MST) 22، الكالوري متساوي الحرارة (ITC) 23-24 ... هو وبالتالي لزم الأمر.
ومن الممكن أيضا أن جزءا من شاردة ج-دي-GMP من القبض على مركب والتي تدهورت بفعل phosphodiesterases من المحللة الخلية. هذا هو واحد من الأسباب التي تجعل لديه إجراءات التي يتعين الاضطلاع بها في 4 درجات مئوية، وبالتالي الحد من النشاط phosphodiesterases قبل عبر ربط.
وproceduإعادة يمكن تكييفها لكثير من الأنواع البكتيرية، واستخدمت بنجاح لمدة 3 الأنواع البكتيرية المختلفة مع تعديلات طفيفة جدا 1. القبض على مجمع القائمة على التكنولوجيا يمكن أن تقلل-ايجابيات كاذبة باستخدام الغسل الكامل (على سبيل المثال 1 M الملح، وتركيز المنظفات عالية، 2 M اليوريا في حالة البروتينات الغشاء، 80٪ الأسيتونتريل)، بالمقارنة مع غيرها من التقنيات التي لا تعتمد على التساهمية ملزمة. وبالنظر إلى أن المصادقة على المرشحين يمكن أن يكون عملية شاقة وتستغرق وقتا طويلا، وهذا هو ميزة كبيرة لطرق بديلة مثل البروتينات الكيميائية على أساس النهج 14.
يحدد هذا الأسلوب الفيديو يتضح CCMS كأداة قوية وتنوعا لتحديد وتوصيف مكونات جديدة تشارك في إشارة جزيء صغير. في المستقبل، التجمعات لقطة مماثلة بإيواء مجموعات الانتقائية أخرى يمكن استخدامها لالتقاط البروتينات المشاركة في إشارات الجزيء الصغيرة، مثل الرواية المستجيبات ج-دي-AMP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
References
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Hengge, R.
- Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You've come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
- Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
- Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
- Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
- Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
- Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
- Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
- Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
- Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
- Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
- Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
- Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
- Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
- Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
- Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
- DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
- Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
- Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).
