Abstract
Se ha logrado un progreso considerable en la última década hacia la identificación y caracterización de las enzimas implicadas en la síntesis (guanilato diguanylate) y degradación (fosfodiesterasas) del segundo mensajero c-di-GMP. Por el contrario, hay poca información disponible acerca de los mecanismos moleculares y componentes celulares a través del cual esta molécula de señalización regula una amplia gama de procesos celulares. La mayoría de las proteínas efectoras conocidas pertenecen a la familia Pilz o se degeneró guanilato diguanylate o fosfodiesterasas que han renunciado a la catálisis y han adoptado la función efectora. Por lo tanto, para definir mejor la red de c-di-GMP celular en una amplia gama de bacterias se requieren métodos experimentales para identificar y validar nuevos efectores para el cual fiable en las predicciones in silico fallar.
Recientemente hemos desarrollado una novela de captura compuesto Espectrometría de Masas (CCMS) tecnología basada como una poderosa herramienta parabioquímicamente identificar y caracterizar proteínas de unión a c-di-GMP. Esta técnica ha sido previamente informado para ser aplicable a una amplia gama de organismos 1. Aquí se da una descripción detallada del protocolo que utilizamos para investigar tales componentes de señalización. Como un ejemplo, usamos Pseudomonas aeruginosa, un patógeno oportunista en la que c-di-GMP juega un papel crítico en el control de la virulencia y la biopelícula. CCMS identificó 74% (38/51) de los componentes conocidos o previstos de la red de c-di-GMP. Este estudio explica el procedimiento CCMS en detalle, y lo establece como una herramienta potente y versátil para identificar nuevos componentes que participan en la señalización de pequeña molécula.
Introduction
c-di-GMP es un segundo mensajero clave usada por la mayoría de las bacterias para controlar varios aspectos de su crecimiento y comportamiento. Por ejemplo, c-di-GMP regula la progresión del ciclo celular, la motilidad y la expresión de exopolisacáridos y adhesinas de superficie 2-4. A través de la coordinación de tales procesos de c-di-GMP promueve la formación de biofilm, un proceso que está asociado con infecciones crónicas de una gama de bacterias patógenas 5. c-di-GMP se sintetiza por enzimas llamadas guanilato diguanylate (PED) que albergan un dominio catalítico GGDEF 4. Algunos PED poseen un sitio de inhibidor que regula hacia abajo la actividad de la adenilato sobre c-di-GMP de unión. La degradación de c-di-GMP está catalizada por dos clases distintas de las fosfodiesterasas (PDE) que alberga ya sea un EAL catalítica o HD-GYP de dominio 6,7.
La mayoría de las proteínas efectoras conocidas que se unen directamente c-di-GMP pertenecen a una de las tres clases de proteínas: catalíticaGGDEF o EAL dominios aliado inactivos y dominios Pilz, pequeños interruptores moleculares que experimentan cambios conformacionales a vinculantes c-di-GMP 8. PED, PDE y Pilz proteínas están bien caracterizados y sus dominios se pueden predecir en silico relativamente segura. Un especial interés se centra ahora en la identificación de nuevos tipos de efectores c-di-GMP. Algunos efectores de c-di-GMP con diferentes motivos de unión se describieron recientemente como el CRP / FNR Bcam1349 familia de proteínas en Burkholderia cenocepacia o la FleQ regulador transcripcional en P. aeruginosa 9,10. Además, riboswitches-GMP-específico c-di han sido recientemente identificados y muestran para controlar la expresión génica de una manera c-di-GMP-11 dependiente. Los motivos c-di-GMP de unión de diferentes efectores son sólo mal conservadas hacer predicciones bioinformáticas de tales proteínas difícil. Para solucionar este problema, hemos desarrollado un método bioquímico, que se basa en el uso de un spe c-di-GMPcaptura compuesto espe- combinada con espectrometría de masas 1,12,13.
Hemos diseñado recientemente una captura compuesto c-di-GMP novela trivalente (CDG-CC, la Figura 1) 1. Este andamio química se compone de: 1) un resto de c-di-GMP utilizado como cebo para capturar c-di-GMP proteínas de unión, 2) un grupo reactivo fotoactivable-UV utiliza para reticular el CDG-CC a las proteínas unidas y 3) una biotina para aislar las proteínas capturadas usando perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. El CDG-CC se puede utilizar para capturar directa y específicamente efectores de c-di-GMP a partir de una mezcla compleja de macromoléculas como lisados celulares. Compuesto de captura basada y han sido previamente informado enfoques químicos proteómica basadas ser aplicable a una amplia gama de organismos, por ejemplo, Caulobacter crescentus, Salmonella enterica serovar typhimurium y P. aeruginosa 1,14.
En este trabajo metodológico,proporcionamos una descripción en profundidad del procedimiento CCMS utilizando extractos de P. aeruginosa como un ejemplo. Este estudio establece CCMS como una herramienta poderosa y versátil para identificar bioquímicamente nuevos componentes que participan en la señalización de pequeña molécula.
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Protocol
1. Preparación de lisado
- Crecer P. aeruginosa células en LB a la DO deseada.
NOTA: Para obtener orientación: utilizar ≈ 100 ml de cultivo / muestra para cultivos en fase estacionaria y ≈ 500 ml cultur / muestra para cultivos en fase log (OD 600 nm = 0,5). - Pellet por centrifugación durante 20 min a 5000 x g.
- Resuspender 0,5-1 g de sedimento en 1 ml de tampón de lisis (MES 6,7 mM, 6,7 mM de HEPES, NaCl 200 mM, 6,7 mM Kac, DDT 1 mM, pH 7,5) y se añade inhibidor de la proteasa (mini completo, libre de EDTA), así como DNaseI.
- Lisan las células mediante 3 pasos a través de una célula de presión francesa, a 20.000 psi (ver Lista de Materiales).
- Ultra-centrifugar el lisado celular a 100.000 x g durante 1 hora a 4 ° C.
- Guardar el sobrenadante (vaya al paso 2).
- Lavar el sedimento con 1 ml de 1x tampón de lisis pipeteando arriba y abajo.
- Ultracentrífuga a 100.000 x g durante 1 hora a 4 ° C.
- Flash congelar el sedimento ennitrógeno líquido y se almacena a -20 ° C hasta su utilización para la captura de las proteínas de membrana (ver paso 3).
2. La eliminación de los nucleótidos libres c-di-GMP y Otros (Fracción Soluble solamente)
- Lavar una columna de desalación PD10 (ver Lista de Materiales) con 10 ml de tampón de lisis frío.
- Verter el sobrenadante (≈ 1 ml) en el PD10 con el fin de eliminar los nucleótidos.
- Se eluye con 4 ml de tampón de lisis frío (500 l pasos).
- Seleccione las fracciones más concentradas como se determina mediante el ensayo de Bradford, y los mismos se agrupen.
3. Pellet resuspensión y solubilización (fracción de membrana solamente)
- Resuspender el precipitado en 500 a 1.000 l de búfer de captura 1x (sin detergente) (ver Tabla 1).
NOTA: El pellet es difícil para volver a suspender. Se aconseja primera pipeta de arriba abajo con una pipeta para volver a suspender el sedimento o menos, luego de usar una jeringa de 27 G para así homogeneizar la solución. - Añadir 1% (w / v) n-dodecil-β-D-maltopiranósido (DDM).
- Incubar a 4 ° C durante al menos 2 horas (o O / N) en una rueda giratoria.
- Ultracentrífuga a 100.000 x g durante 1 hora a 4 ° C.
- Se recoge el sobrenadante.
4. Proteína de medición de concentración
- Medir la concentración de proteína por el ensayo de Bradford (mediante ensayo BCA para la fracción de membrana).
- Ajuste la concentración de proteína total a 10 mg / ml.
5. Captura
- Mezclar 300 g de proteína con 1 mM del PIB, GTP, ATP, CTP, y 20 l de tampón de captura de 5x (mM HEPES 100 mM, KAc 250 mM, MgAc 50, 5% de glicerol, pH 7,5) (Tabla 1). Ajuste el volumen de reacción de 100 l con H 2 O.
NOTA: el volumen total incluye el volumen del CDG-CC y c-di-GMP en el caso del control de la competencia (véase el paso 5.3 y la Tabla 2).
NOTA: todos los experimentos se llevaron a cabo en 200 y# 181; l tiras de PCR de 12 tubos (Thermo Scientific).
NOTA: para la fracción de membrana, asegúrese de mantener siempre la concentración DDM encima de la concentración micelar crítica (0,01% w / v) hasta la etapa de solubilización de proteínas en urea 8 M (Paso 7.1). - Incubar a 4 ° C durante 30 min en una rueda giratoria.
- Añadir 10 mM CDG-CC (concentración final).
NOTA: incluir un control sin CDG-CC (referido como "el control del grano"), y un control suplementado con 1 mM de c-di-GMP ("control de la competencia") (ver Tabla 2).
NOTA: la concentración CDG-CC se puede ajustar de 1 a 10 mM. - Incubar a 4 ° C durante al menos 2 h (O / N para la fracción de membrana) en una rueda giratoria, en la oscuridad.
- Después de un giro corto, cross-link mediante la activación del resto reactivo de la CDG-CC con luz UV durante 4 min, utilizando un CaproBox (ver Lista de Materiales, λ = 310 nm, irradiancia ≥10 mW / cm², distancia de la fuente = 2 cm). Nota: Retire la tapa de las tiras de reticulación previa.
- Añadir 25 l de 5x tampón de lavado (NaCl 5 M, Tris 250 mM, pH 7,5) y 50 l de perlas magnéticas de estreptavidina así resuspendidos, homogeneizar suavemente.
- Incubar a 4 ° C durante 1 hora en una rueda giratoria.
6. Los pasos de lavado
NOTA: (Imán: ver Lista de Materiales). Comience con una captura de las perlas magnéticas en la tira tapa PCR, con el imán. A continuación, reemplace la tira de PCR por uno nuevo que contenga la siguiente solución de lavado. Retire el imán y volver a suspender las perlas, y se incuba 2 min. Centrifugar y reemplazar la tapa por una tapa fresco.
- Las etapas de lavado (fracción soluble únicamente)
- Lavar 6 veces en 200 l de tampón de lavado 1x.
- Lavar una vez en 200 l de calidad HPLC H 2 O.
- Lavar 6 veces en 200 l 80% de acetonitrilo.
- Lavar 2 veces en 200 l de calidad HPLC H 2 O.
- Las etapas de lavado (membrafracción ne solamente)
- Lavar 5 veces en 200 l de tampón de lavado 1x + 0,1% DDM.
- Lavar 2 veces en 200 l de tampón de lavado 1x + 0,05% DDM.
- Lavar una vez en 200 l de tampón de lavado 1x + 0,025% DDM.
- Lavar una vez en 200 l de tampón de lavado 1x + 0,0125% DDM.
- Lavar 3 veces en 200 l mM ABC 100 (bicarbonato de amonio, NH 4 CO 3) + 2 M urea.
7. MS Preparación de la muestra
- Resuspender las perlas (directamente en la tapa) en 20 l mM ABC 100 (mM ABC 100 + 8 M urea para la fracción de membrana) y transferir a tubos de 1,5 ml.
- Fracción de membrana única: se incuba a 60 ° C durante 5 min, agitando a 500 rpm.
- Añadir 0,5 l mM TCEP 200 (tris (2-carboxietil) fosfina) y se incuba a 60 ° C durante 1 hora, con agitación a 500 rpm. Enfriar a 25 ° C.
- Añadir 0,5 l de 400 mM recién preparada yodoacetamida y se incuba a 25 ° C durante 30 minutos, agitando unaT 500 rpm y en la oscuridad.
- Añadir 0,5 l 0,5 M N-acetil-cisteína y se incuba a 25 ° C durante 10 min, agitando a 500 rpm.
- Fracción de membrana única: añadir 1 l Lys-C e incubar a 37 ° C, O / N.
- Añadir 2 g de tripsina y se incuba O / N a 37 ° C, agitando a 500 rpm (wrap en Parafilm para evitar el secado).
NOTA: las muestras se pueden almacenar a -20 ° C en esta etapa.
NOTA: fracción de membrana solamente: añadir mM ABC 100 para ajustar la concentración de urea a <2 M antes de la adición de tripsina. - Brevemente centrifugar los tubos y recoger bolitas con el imán.
- Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml (repita este paso si los granos se dejan).
- Añadir 5 l 5% de TFA (ácido trifluoroacético) + 1 l 2 M HCl (15 l 5% TFA + 5 l 2 M HCl para la fracción de membrana).
- Condición columnas C18 MicroSpin (El Grupo Nest, MA, EE.UU.) con 150 l de acetonitrilo (spin 20 segundos a 2.400 rpm).
- Equilibrate las columnas C18 2 veces con 150 l 0,1% TFA (giro 20 s, 2400 rpm).
- Cargue la muestra y girar 2 min, 2000 rpm.
- Actualizar el flujo a través en la columna y repetir la etapa de hilatura (2 min, 2000 rpm).
- Lavar 3 veces con 150 l 0,1% de TFA, 5% de acetonitrilo (20 segundos, 2400 rpm).
- Tomar un tubo nuevo y se eluye dos veces con 150 l 0,1% de TFA, 50% de acetonitrilo (2 min, 2000 rpm).
- Seque los péptidos en una velocidad-vac.
- Resuspender en 40 l 98% H 2 O, 2% de acetonitrilo, ácido fórmico 0,15%.
- Sonicar 20 seg (ciclo de pulso 0,5, amplitud 100%; ver Lista de Materiales) y centrifugar 5 seg, 12.000 rpm (centrífuga de mesa). Vortex 10 seg, y de girar 5 seg, 12.000 rpm. Transferencia en un vial de HPLC para el análisis de LC-MS / MS.
- Congelar a -20 ° C.
NOTA: las muestras se pueden almacenar a -20 ° C en esta etapa.
8. LC-MS / MS Analysis
- Ejecutar un nano-LC (sistemas nano-LC) equipped con una columna RP-HPLC (75 m x 37 cm) rellena con resina C18 (magia C18 AQ 3 m) usando un gradiente lineal de disolvente A (ácido fórmico al 0,15%, 2% de acetonitrilo) 95% y 5% de disolvente B ( 98% de acetonitrilo, ácido fórmico 0,15%) a 35% de disolvente B durante 60 min a un caudal de 0,2 l / min.
- Analizar los péptidos utilizando LC-MS / MS (doble presión LTQ-Orbitrap Velos espectrómetro de masas, conectado a una fuente de iones de electrospray).
NOTA: El modo de adquisición de datos se creó para obtener una alta resolución MS Analizar en la parte FT del espectrómetro de masas con una resolución de 60.000 FWHM seguido por MS / MS de las exploraciones en la trampa de iones lineal de los 20 iones más intensos. Para aumentar la eficiencia de los intentos de MS / MS, el modus proyección estatal encargada estaba habilitado para excluir sin asignar y solitariamente cobra iones. Colusión disociación inducida se desencadenó cuando el precursor superó los 100 recuentos de iones. La duración dinámica de exclusión se fijó a 30 seg. El tiempo de acumulación de iones se fijó a 300 mseg (MS) y 50mseg (MS / MS).
9. Base de datos de búsqueda
- Descargue el P. aeruginosa NCBI-base de datos a través de la página de NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
- Convertir los espectros MS prima en archivos genéricos de la mascota (MGF) utilizando la herramienta de conversión MassMatrix ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
- Buscar en este archivo mgf usando MASCOTA versión 2.3 contra la P. aeruginosa NCBI-base de datos que contiene adelante y entradas de proteínas inversa señuelo.
- Realizar una en la digestión de tripsina silico después de lisina y arginina (a no ser seguido por prolina) tolerando dos perdidas divisiones en péptidos plenamente tríptico.
- Establezca los parámetros de búsqueda de base de datos para permitir metioninas oxidado (15.99491 Da) como variable modificaciones y carboxiamidometilación (57.021464 Da) de residuos de cisteína como fijo modificación. Para MASCOTA nos buscaing escaneos de alta resolución, establecer la tolerancia de masa precursor de 15 ppm y establecer la tolerancia de masa fragmento de 0,6 Da. Por último, establezca la proteína FDR al 1%.
- Importe las búsquedas de la mascota de P. experimentos aeruginosa CCMS en Andamios (Proteomesoftware, Versión 3), establecen los parámetros para obtener una proteína FDR cercano al 1%, y extraer los recuentos espectrales totales.
- Para que los resultados representativos presentan en este documento, se utilizó una prueba t pareada para comparar el experimento con el control de la competencia, y sólo se consideran golpes con un valor de p inferior a 0,1, y un índice de recuento espectral por encima del 2 (experimentar recuentos espectrales / espectral control de la competencia recuentos).
- Los datos se pueden exportar en cualquier software de hoja de cálculo para su posterior análisis.
10. Cuantificación-Label gratis
- Importe los archivos RAW en el software progénesis LC-MS (Dinámica no lineal, versión 4.0).
- Realizar LC-MS alineación y detección de características en setti defectoNGS.
- Exportación de los datos en formato mgf de progénesis LC-MS.
- Buscar en los espectros MS / MS utilizando la mascota contra el NCBI P. base de datos que contiene aeruginosa hacia adelante y entradas de proteínas inversa señuelo.
- Importe los resultados de búsqueda de base de datos en progénesis LC-MS y un mapa de los péptidos identificaciones a características MS1.
- Para la evaluación de datos (cálculo de los niveles de significación, plegables cambio proporciones) se utilizó el guión ProteinSQAnalysis de SafeQuant (umbral: el valor q por debajo de 0,1, índice de recuento espectral superior a 2).
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Representative Results
Para identificar nuevos efectores c-di-GMP en P. aeruginosa se utilizó sistemáticamente CCMS para analizar las fracciones solubles y de membrana de P. aeruginosa cepa PAO1 de un cultivo en fase log (OD 600 = 0,5). Aquí resumimos y discutimos los resultados representativos de esta expedición de pesca. Se utilizaron cuatro réplicas biológicas independientes. Para cada experimento se utilizaron dos concentraciones CDG-CC diferentes (5 mM y 10 mM). Para investigar la especificidad, los experimentos se llevaron a cabo en presencia o ausencia de 1 mM de c-di-GMP como competidor y, por último, con un control de talón (es decir, sin CDG-CC) (Tabla 1).
Cuando se sigue el método descrito en detalle anteriormente (Figura 2) produjimos una lista de proteínas capturadas en un formato de andamio. Se eliminaron contaminantes probable. Esto incluyó proteínas ribosomales, estreptavidina, tripsina, albúmina de suero, la queratina y otras proteínas humanas. La proteínatasa de falso descubrimiento de identificación (FDR) se establece en 1% en el uso del software Andamios, y los datos exportados a Excel. El número de acceso proporcionado por Andamios se puede convertir en números locus utilizando la función BUSCARV en Excel vinculado a una lista de la P. números locus aeruginosa. En esta etapa, la lista de resultados 768 comprende proteínas de la fracción soluble y 433 proteínas para la fracción de membrana. Sin embargo, la mayoría de las proteínas no se enriquecen de manera significativa en el experimento de captura. Por lo tanto, se eliminaron las proteínas que probablemente son capturados de forma no específica (positivos en el control del talón o sólo en la presencia de c-di-GMP competidor). Se calculó un índice de recuento espectral entre el experimento de captura y el control de la competencia y de las proteínas sólo se consideran con una proporción mayor que dos. Además se empleó un ensayo t por parejas en los recuentos espectrales para proporcionar una medida significativa la diferencia entre el experimento de captura y el control de la competencia, y establecer un umbral permisiva de 0,1. Por último, Hemos considerado sólo éxitos robustos con al menos cuatro péptidos identificados en los cuatro experimentos para las concentraciones de compuesto 2 de captura tomadas en conjunto. Estos criterios deben ser ajustados de acuerdo a las necesidades y utilizando el verificados y predijeron c-di-GMP proteínas de unión como estándar para establecer el umbral. Después de la clasificación, la lista se redujo a 76 golpes para la fracción soluble, y 133 proteínas de la fracción de membrana. Esto incluyó 13 soluble y 21 proteínas de membrana de P. aeruginosa que son conocidas o previstas para unirse c-di-GMP (Tabla 2). Los otros 63 soluble y proteínas de la membrana 112 son nuevas proteínas putativas c-di-GMP de unión que no contienen uno de los dominios de unión a c-di-GMP conocidos. Estos éxitos ahora tienen que ser validados por probar su unión a c-di-GMP específica.
En la pantalla anterior pescamos GlyA2 (PA2444), GlyA3 (PA4602) y Gsp69 (PA1127) 1. Estas 3 proteínas se clonaron, sobreexpresados, y purificarse a partirE. coli y podría ser validado para obligar a c-di-GMP en experimentos de enlace-UV transversal utilizando 33 P etiquetados c-di-GMP 15. Los K d s se determinaron a 1,0 mM, 2,0 y 6,9, respectivamente, lo que indica que, efectivamente, nuevos efectores pueden ser identificados mediante el uso de CCMS.
Además de este ejemplo representativo, se utilizó CCMS con extractos de células recogidas de diferentes condiciones de crecimiento y con diversas concentraciones de c-di-GMP intracelulares (n = 24). En general hemos capturado el 74% (38/51) de los conocidos o previstos P. componentes aeruginosa PAO1 c-di-GMP de señalización (24/32 proteínas solubles, proteínas de membrana 14/19). Teniendo en cuenta que al menos nueve de estos genes, se mostró a ser transcrito en condiciones específicas (estrés oxidativo, la detección de quórum, biofilms) 16 y que algunos pueden no obligar c-di-GMP en absoluto, este grado de cobertura podría estar cerca de la saturación. Esto, junto con la observación de que la mayoría de estos componentes were capturado con una alta especificidad (Tabla 2) sostiene firmemente que esta técnica es eficaz y potente.
Figura 1: Estructura química de la captura compuesto c-di-GMP.
Figura 2:. CCMS resumen del proceso Después de la lisis mecánica los nucleótidos libres se eliminan utilizando una columna de exclusión PD10. Las proteínas de las fracciones solubles o de membrana se incuban con el CDG-CC y la mezcla se expone a la irradiación de UV a las proteínas capturadas de entrecruzamiento. Pasos de lavado dura se realizan con compuestos unidos a estreptavidina perlas magnéticas recubiertas. On-talón digestión tríptica proporciona péptidos,que luego se separó de las perlas y protonada para su identificación espectrometría de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.
Figura 3: Volcanoplots de P. proteínas aeruginosa considerablemente enriquecido por CCMS. Tras el análisis LC-MS / MS y la cuantificación sin etiquetas, las proteínas se clasifican como se describe en el texto. Log2 ratio de intensidad de péptido detectado entre la captura y la competencia experimentos se calcula y se representa frente a los valores derivados del análisis de la significación (t-estadística modificado, el método empírico de Bayes 17). Las proteínas dentro de los umbrales de significación de los valores de p <0,05 y coeficientes de intensidad> 1,5 veces son indicated en un cuadro gris. El 4 repeticiones para la fracción soluble (A) y la fracción de membrana (B) se realizaron en presencia de 10 mM c-di-GMP-CC, y el experimento de competición con 1 mM c-di-GMP. Los puntos de círculos corresponden a las proteínas de unión de c-di-GMP conocidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.
| Captura: | Buffer | Químico | Fuente | Concentración | |||||
| Bacteriana tampón de lisis 10x | MES | Sigma | 67 mM | ||||||
| pH 7,5 | HEPES | Sigma | 67 mM | ||||||
| NaCl | Merck | 2 M | |||||||
| Na Acetato de | Merck | 67 mM | |||||||
| TDT | Fluka | 10 mM | |||||||
| DNaseI | Roche | 20 U / ml | |||||||
| Completo cóctel inhibidor de la proteasa | Roche | 1 TAB / 10 ml | |||||||
| Capture Buffer 5x | HEPES | Sigma | 100 mM | ||||||
| KAc | Sigma | 250 mM | |||||||
| MgAc (anhidro) | Sigma | 50 mM | |||||||
| Glicerol | Sigma | 50% (V / V) | |||||||
| PIB, GTP, ATP, CTP | sigma | 1 mM de cada uno | 5x tampón de lavado | Tris-HCl | Merck | 1 M | |||
| (Para la fracción soluble) | EDTA | Sigma | 0,5 M | ||||||
| pH 7,5 | NaCl | Sigma | 5 M | ||||||
| n-octil-β-D-glucopiranósido | Anagrade (Affymetrix) | 42,5 mM | |||||||
| 5x tampón de lavado | Tris-HCl | Merck | 1 M | ||||||
| (Para la fracción de membrana) | EDTA | Sigma | 0,5 M | ||||||
| pH 7,5 | NaCl | Sigma | 5 M | ||||||
| Otros productos químicos: | El bicarbonato de amonio (ABC) | Fluka | |||||||
| Urea | Applichem | ||||||||
| MS preparación de la muestra: | Buffer | Químico | Fuente | Concentración | |||||
| C18 Buffer A | TFA | Atravesar | 0,1% (V / V) | ||||||
| H 2 O grado HPLC | 99,9% (V / V) | ||||||||
| C18 Buffer B | TFA | Atravesar | 0,1% (V / V) | ||||||
| El acetonitrilo | Biosolve | 49,9% (V / V) | |||||||
| H 2 O grado HPLC | 50% (V / V) | ||||||||
| C18 BufferC | TFA | Atravesar | 0,1% (V / V) | ||||||
| El acetonitrilo | Biosolve | 5% (V / V) | |||||||
| H 2 O grado HPLC | 94,9% (V / V) | ||||||||
| LC Tampón A | Ácido fórmico | Sigma | 0.15% (V / V) | ||||||
| El acetonitrilo | Biosolve | 2% | |||||||
| H 2 O grado HPLC | 97.85% | ||||||||
| Otros productos químicos: | tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) | Sigma | |||||||
| yodoacetamida (IAA) | Sigma | ||||||||
| N-acetil-cisteína | Sigma | ||||||||
| Endoproteinasa Lys-C | Wako | ||||||||
| La tripsina | Promega |
Tabla 1: Los tampones composición Resumen de los tampones composición, los productos químicos y proveedores.. El c-GMP-di-captura compuesto, c-di-GMP (para el control de la competencia), perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina, búfer de captura, y tampón de lavado se incluyen en el caproKit.
| El control del grano | Experimento de captura | Control de la Competencia | |
| Extracto de proteína (10 mg / ml) | 30 l | 30 l | 30 l |
| c-di-GMP (10 mM) | 0 l | 0 l | 10 l |
| Los nucleótidos (10 mM de cada nucleótido) | 10 l | 10 l | 10 l |
| 5x búfer de captura | 20 l | 20 l | 20 l |
| H 2 O | 42 l | 32 l | 22 l |
| 30 min de incubación | |||
| c-di-GMP ~ CC (madre 100 mM) | 0 l | 5-10 l | 5-10 l |
| Las concentraciones finales: | El control del grano | Experimento de captura | Control de la Competencia |
| c-di-GMP ~ CC (M) | 0 mM | 5-10 mM | 5-10 mM |
| Competidor c-di-GMP (M) | 0 mM | 0 mM | 1,000 mM |
Tabla 2:. Mezcla de reacción Capture Resumen de la mezcla de reacción para el control del talón (es decir, sin compuesto de captura), el experimento de captura (con la c-di-GMP-CC), y el control de la competencia, que contiene un gran exceso de c- di-GMP. La concentración final c-di-GMP-CC se puede ajustar, y se encuentra típicamente entre 5 y 10 mM.
| Nombre de la proteína | Locus ID | La arquitectura de dominio | captura experimento / competencia experimento 1 | ||||||||||||||||||
| a) fracción soluble | CDG-CC = 5 mM | CDG-CC = 10 mM | |||||||||||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF * | 14/0 | 14/0 | 13/0 | 11/0 | 14/0 | 12/0 | 14/0 | 14/0 | |||||||||||
| WSPR | PA3702 | REC-GGEEF * | 9/0 | 9/0 | 10/0 | 9/0 | 11/0 | 10/0 | 11/0 | 11/0 | |||||||||||
| - | PA2567 | GAF-SPTRF-EAL | 8/0 | 4/0 | 9/0 | 0/0 | 7/0 | 3/0 | 8/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | Pilz | 11/0 | 12/0 | 13/0 | 12/0 | 12/0 | 10/0 | 11/0 | 12/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 5/0 </ Td> | 3/0 | 6/0 | 5/0 | 8/0 | 5/0 | 6/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA5295 | GDDEF-EAL | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 1/0 | 6/0 | 6/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| Fimx | PA4959 | PAS-GDSIF-EVL | 23/1 | 21/0 | 21/0 | 11/0 | 24/3 | 23/2 | 22/0 | 20/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | Pilz | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 0/0 | 3/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | Pilz | 3/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | Pilz | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | ||||||||||||
| - | PA4324 | Pilz | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3177 | GGEEF | 2/0 | 1/0 | 3/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4396 | REC-DEQHF | 0/0 | 1/0 | 4/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 5/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0169 | GGEEF * | 3/0 | 2/0 | 6/0 | 7/0 | 7/1 | 6/2 | 9/1 | 7/1 | |||||||||||
| - | PA2799 | Pilz | 1/0 | 0/0 | 2/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA5017 | PAS-GAF-PAS-ASNEF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 2.3 | 0/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA5487 | GGEEF * | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| b) fracción de membrana | CDG-CC = 5 mM | CDG-CC = 10 mM | |||||||||||||||||||
| - | PA2072 | CHASE4-TM-PAS-GGDEF-EAL | 13/1 | 25/0 | 27/0 | 19/0 | 36/0 | 36/0 | 31/0 | 23/0 | |||||||||||
| - | PA0861 | TM-PAS-GGDEF-ELL | 6/1 | 14/0 | 13/0 | 10/0 | 17/0 | 18/0 | 13/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | Pilz | 6/0 | 10/0 | 9/0 | 7/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 5/0 | |||||||||||
| - | PA3343 | 5TM-GGDEF | 3/0 | 7/0 | 7/0 | 4/0 | 12/0 | 10/0 | 7/0 | 7/0 | |||||||||||
| - | PA1181 | MASE1-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-ELL | 3/0 | 6/0 | 9/0 | 3/0 | 12/0 | 12/0 | 5/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA0847 | TM-CHASE4-el HAMP-PAS-GGDEF | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 1/0 | 15/0 | 13/0 | 8/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA0575 | PbPb-TM-PAS-PAS-PAS-Pas-GGDEF-EAL | 1/0 | 7/0 | 6/0 | 3/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 2/0 | |||||||||||
| yfiN | PA1120 | 2TM-el HAMP-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 3/0 | 5/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 1/0 | 4/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 5/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4929 | 7TMR: DISMED2-7TMR: DISMED2-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | |||||||||||
| Mora | PA4601 | TM-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL | 3/0 | 7/0 | 7/3 | 5/0 | 9/0 | 10/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| - | PA1851 | 5TM-GGDEF | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA2870 | TM-GGDEF | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3311 | TM-MHYT-MHYT-MHYT-AGDEF-EAL | 1/1 | 5/0 | 7/1 | 4/0 | 8/0 | 8/0 | 5/1 | 3/0 | |||||||||||
| BIFA | PA4367 | TM-GGDQF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 2/1 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | Pilz | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 3/0 | 3/0 | 2/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4332 | 5TM-GGEEF | 1/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | Pilz | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | Pilz | 4/0 | 8/0 | 7/0 | 7/0 | 5/2 | 2.11 | 7/2 | 8/3 | |||||||||||
| - | PA1433 | El HAMP-RGGEF-KVL | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF | 0/0 | 0/0 | 1/1 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | * = GGDEF dominio que contiene un sitio I | ||||||||||
| 1 número de recuentos espectrales de péptidos identificados | |||||||||||||||||||||
Tabla 3: P. aeruginosa conocido c-di-GMP señalización componentes capturados específicamente. proteínas identificadas se clasifica por primera vez como se describe en el texto. Las proteínas se identificaron con su nombre y número de locus, y que indican su arquitectura predecirse con la herramienta de línea de base de datos NCBI conservadas de dominio (n = 4, CDG-CC = 5 M o 10 mM) con el fin de mostrar la especificidad de captura y la reproducibilidad del método.
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Discussion
Especial cuidado se debe tomar en varias etapas del protocolo. La concentración de proteínas es un parámetro crítico con una concentración de 10 mg / ml siendo difícil de alcanzar cuando las células se cultivan bajo condiciones de crecimiento específicas (por ejemplo biofilms o pequeñas variantes de colonias). Por lo tanto, la resuspensión de pellets se debe realizar en un bajo volumen de tampón de lisis. Las concentraciones de proteína se pueden reducir a 8 mg / ml. En comparación con el método publicado por Nesper et al. 1, hemos añadido varios nucleótidos a la reacción de captura para minimizar la captura no específica de proteínas de unión de nucleótidos. Aunque la adición de nucleótidos mejoró la especificidad, puede al mismo tiempo evitar la captura de proteínas que se unen nucleótidos diferentes en el mismo sitio. Por ejemplo, el FleQ efector, que se ha demostrado recientemente que se unen ATP y c-di-GMP 18 fue pescado específicamente en la ausencia de ATP en nuestro experimento anterior 1, pero ya no en el data presentado aquí en presencia de un exceso de ATP.
El CDG-CC debe ser cuidadosamente protegida de la luz. Aunque la luz ambiente contiene sólo una pequeña fracción de la radiación UV, se recomienda mantener el stock de compuesto de captura envuelto en papel de aluminio, así como la mezcla de captura antes de la activación por irradiación UV. Las etapas de lavado que siguen pueden ser muy estrictas para aumentar la especificidad, ya que las proteínas capturadas están unidos covalentemente a la CDG-CC. En cuanto al análisis LC-MS / MS, los experimentos deben realizarse en un ambiente libre de queratina limpio. Por otra parte, los tampones compatibles HPLC se deben utilizar, sobre todo después de las etapas de lavado. La lista de candidatos comprende típicamente entre 300 y 800 proteínas (para una cuadruplicado), con bajos variaciones entre las repeticiones (véase la Tabla 2 como un ejemplo).
Algunos parámetros como la proteína y la concentración CDG-CC que tenga que ser optimizado en función de los organismos analyzed. Dado que las proteínas o proteínas de baja abundancia expresadas sólo en condiciones específicas fácilmente se puede perder, se debe tener cuidado con las condiciones de cultivo empleadas. Este problema se puede superar mediante la comparación de la lista de resultados con un atlas de proteínas globales recogidos por las mismas condiciones de cultivo. Por último, la optimización del detergente puede ser un reto, ya que debe ser optimizado con respecto a su capacidad para solubilizar proteínas de membrana y también tiene que ser compatible MS.
Uno tiene que tener en cuenta que la molécula de c-di-GMP de la CC se modifica químicamente, ya que está vinculado a través del grupo 2'OH de una ribosa al resto del andamio. Esta modificación podría alterar su capacidad para unirse a algunos efectores proporcionando así falsos negativos. En este contexto hay que destacar que nunca hemos capturado proteínas que albergan un dominio EAL pero carecen de un dominio GGDEF en P. aeruginosa, aunque fueron capturados proteínas EAL en otras especies, como Caulcrescentus obacter. Esto podría ser debido a una falta de acceso o una baja afinidad del CDG-CC al sitio de unión, o para la degradación del CDG-CC por proteínas EAL. En contraste, muchas proteínas de unión a nucleótidos fueron capturadas con una especificidad relativamente baja y, en gran medida, son probablemente falsos positivos. Además validación de la unión a c-di-GMP usando técnicas tales como DRaCALA 20 específica, la reticulación UV 15, fluorimetría de exploración diferencial (DSF) 21, termoforesis microescala (MST) 22, calorimetría isotérmica (ITC) 23-24 ... es por lo tanto necesario.
También es posible que una fracción de la fracción de c-di-GMP del compuesto de captura se degrada por fosfodiesterasas a partir del lisado celular. Esta es una de las razones por las cuales el procedimiento tiene que llevarse a cabo a 4 ° C, por lo tanto, limitar la actividad fosfodiesterasas antes de la reticulación.
El procedire puede adaptarse a muchas especies bacterianas, y ha sido utilizado con éxito durante 3 especies bacterianas diferentes con modificaciones muy menores 1. Tecnología basada captura compuesto puede reducir los falsos positivos mediante el uso de un lavado a fondo (por ejemplo, 1 M de sal, de alta concentración de detergente, 2 M de urea en el caso de proteínas de membrana, 80% de acetonitrilo), en comparación con otras técnicas que no se basan en la unión covalente. Dado que la validación de los candidatos puede ser un proceso tedioso y requiere mucho tiempo, esta es una de las principales ventajas de los métodos alternativos como la proteómica químicos basados en enfoques de 14.
Este método de vídeo ilustra establece CCMS como una herramienta poderosa y versátil para identificar y caracterizar nuevos componentes que participan en la señalización de pequeña molécula. En el futuro, compuestos de captura similares que albergan otros grupos de selectividad se podrían utilizar para capturar las proteínas implicadas en la señalización de pequeña molécula, tales como los nuevos efectores c-di-AMP.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
References
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