Abstract
かなりの進歩は、第二メッセンジャーc-ジ-GMPの合成（ジグアニルシクラーゼ）及び分解（ホスホジエステラーゼ）に関与する酵素の同定および特徴に向けた最後の十年の間に行われている。これとは対照的に、ほとんど情報がこのシグナル伝達分子は、細胞プロセスの多様な範囲を規制を通じて分子機構と細胞成分に関する利用可能です。知らエフェクタータンパク質のほとんどは、ピルツファミリーに属するか、触媒作用をあきらめているとエフェクター機能を採用しているジグアニルシクラーゼ又はホスホジエステラーゼを縮退している。したがって、より良い細菌実験方法の広範囲の細胞c-ジGMPネットワークを定義することは失敗するインシリコ予測における信頼性のあるもののための新規のエフェクターを識別し、検証する必要がある。
我々は最近の強力なツールとしての新規捕獲化合物質量分析法（CCMS）に基づく技術を開発しました生化学的にc-ジ-GMP結合タンパク質を同定し、特徴づける。この技術は、以前に生物1の広い範囲に適用可能であることが報告されている。ここでは、我々はそのようなシグナル伝達成分を調べるために利用するプロトコルの詳細な説明を与える。例として、 緑膿菌 、c-ジ-GMPが病原性とバイオフィルム制御に重要な役割を果たしている日和見病原体を使用しています。 CCMSは、c-ジ-GMPネットワークの既知または予測コンポーネントの74パーセント（51分の38）を同定した。この研究は、詳細にCCMS手順を説明し、小分子のシグナル伝達に関与する新規成分を同定するための強力で汎用性の高いツールとしてそれを確立します。
Introduction
c-ジGMPは、その成長と行動の様々な側面を制御するために、ほとんどの細菌によって使用される重要なセカンドメッセンジャーである。例えば、c-ジGMPは、細胞周期進行、運動性およびエキソポリサッカライド及び表面アドヘシン2-4の発現を調節する。このようなプロセスのc-ジ-GMPの協調を通じて、バイオフィルム形成、病原菌5の範囲の慢性感染症に関連付けられているプロセスを促進する。 c-ジ-GMPは、触媒GGDEFドメイン4を保有するジグアニルシクラーゼ（DGCs）と呼ばれる酵素によって合成されている。いくつかのDGCsはダウンc-ジ-GMP結合の際シクラーゼ活性を調節阻害部位を有する。 c-ジ-GMPの劣化は、触媒EALまたはHD-GYPドメイン6,7のいずれかを保有するホスホジエステラーゼの二つの異なるクラス（偏微分方程式）によって触媒される。
直接c-ジGMPに結合する既知のエフェクタータンパク質の大部分は、タンパク質の唯一の3つのクラスに属する：触媒を同盟国、非アクティブGGDEFまたはEALドメインとピルツドメイン、c-ジ-GMPが8と結合すると立体構造変化を受ける小さな分子スイッチ。 DGCs、偏微分方程式とピルツタンパク質が十分に特徴付けされ、そのドメインは比較的安全にin silicoで予測することができる。特に関心は現在c-ジ-GMPエフェクターの新しいクラスの識別に焦点を当てている。別の結合モチーフを有するいくつかのc-ジ-GMPのエフェクターは、 バークホルデリアcenocepacia中のCRP / FNRタンパク質ファミリーBcam1349またはPにおける転写調節因子FleQとして最近、記載された緑膿菌 9,10。また、c-ジGMP特異的リボスイッチは、最近同定され、c-ジGMP依存性の様式11に遺伝子発現を制御することが示された。異なるエフェクターのc-ジ-GMPが結合モチーフはわずかしか保存されたようなタンパク質の生物情報学の予測を困難にしている。この問題に対処するために、我々は、c-ジGMPのSPEの使用に基づく生化学的方法を開発cific捕獲化合物は、質量分析法1,12,13と組み合わせる。
我々は最近、（CDG-CC、 図1）は、新規三価のc-ジ-GMPの捕獲化合物を設計しています1。 、c-ジ-GMP結合タンパク質を捕捉するために餌として使用1）c-ジGMP部分結合したタンパク質にCDG-CCをリンク交差するために使用する2）紫外線光活性化反応基と：この化学足場はで構成されている3）ビオチンは、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを用いて捕捉されたタンパク質を単離する。 CDG-CCは、直接かつ特異的に細胞溶解物のような高分子の複雑な混合物からc-ジGMPエフェクターを捕捉するために使用することができる。捕獲化合物系、化学プロテオミクスに基づくアプローチは、以前は、広範囲の生物に適用可能であることが報告されており、 例えばカウロバクターcrescentus、サルモネラ·エンテリカ血清型ネズミチフス菌およびP.緑膿菌 1,14。
この方法論の論文では、我々は、P。の抽出物を使用してCCMS手順の深さの説明で提供例として緑膿菌 。この研究は、生化学的に、小分子のシグナル伝達に関与する新規成分を同定するための強力で汎用性の高いツールとしてCCMSを確立します。
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Protocol
1.溶解物の準備
- P.を育てる希望ODにLBにおける緑膿菌細胞 。
注：ガイダンスについて：対数期の培養のための固定相培養のため≈100ミリリットル文化/サンプルと≈500ミリリットルのcultur /サンプル（OD 600nmが = 0.5）を使用します。 - 5000のx gで20分間の遠心分離によってペレット。
- 同様に1ミリリットルの溶解緩衝液（6.7 mMのMES、6.7 mMのHEPES、200mMのNaCl、6.7 mMのKAC、DDTを1mM、pH7.5）中、およびプロテアーゼ阻害剤を追加し（EDTAを含まない完全なミニ）でペレットを再懸濁0.5〜1グラムDNアーゼIとして。
- 溶解20,000psiでフレンチ圧力セルを通じて3継代によって細胞、（材料リストを参照してください）。
- 超遠心機で4℃で1時間、100,000×gで細胞溶解物。
- 上清を保存します（ステップ2に進み）。
- ピペッティングにより溶解バッファー1×1ミリリットルとのペレットを洗浄。
- 4℃で1時間100,000×gで超遠心機。
- ペレットをフラッシュ凍結膜タンパク質の捕捉に使用するまで-20℃で液体窒素や店舗（ステップ3を参照）。
c-ジ-GMP無料と他のヌクレオチドの2の除去（可溶性画分のみ）
- 冷溶解緩衝液10mlをPD10脱塩カラム（参照物質一覧）を洗浄する。
- ヌクレオチドを除去するために、PD10上に上清（≈1ミリリットル）を注ぐ。
- 4mlで溶出する冷溶解緩衝液（500μlのステップ）。
- Bradfordアッセイによって決定されるように最も濃縮画分を選択し、それらをプールする。
3.ペレットの再懸濁および可溶化（膜画分のみ）
- （界面活性剤なし）1×捕捉緩衝液の500〜1000μlの中にペレットを再懸濁した（ 表1を参照のこと）。
注：ペレットが再懸濁することは困難である。大体うまく解決策を均質化する注射器27のGを使用するように、その後、ペレットを再懸濁するために、ITをピペットで第一ピペットアップにとダウンをお勧めします。 - 1％を加える（w / v）のn-ドデシルβ-D-マルトピラノシド（DDM）。
- 回転ホイール上に少なくとも2時間（またはO / N）、4℃でインキュベートする。
- 4℃で1時間100,000×gで超遠心機。
- 上清を収穫。
4.タンパク質濃度測定
- （膜画用のBCAアッセイによる）ブラッドフォードアッセイによりタンパク質濃度を測定します。
- 10 mg / mlの総タンパク質濃度を設定する。
5.キャプチャ
- GDP、GTP、ATP、CTPの1 mMの、そして5倍キャプチャバッファ（100mMのHEPES、250 mMのKAC、50 mMのMgAc、5％グリセロール、pH7.5）を（ 表1）の20μlのタンパク質300μgのを混ぜる。 H 2 Oで100μlに反応容量を調整
注：総ボリュームは（ステップ5.3および表2を参照）競合制御の場合のCDG-CC及びc-ジ-GMPのボリュームが含まれています。
注：全ての実験は、200で行った＃181; L 12-チューブPCRストリップ（サーモサイエンティフィック）。
注：膜画分のために、常に8 M尿素（ステップ7.1）中のタンパク質可溶化工程まで、臨界ミセル濃度（w / vの0.01％）を上回るDDM濃度を維持することを確認してください。 - 回転ホイール上で30分間、4℃でインキュベートする。
- 10μMのCDG-CC（最終濃度）を追加します。
NOTE：（ 表2参照）（「ビーズ制御」という）CDG-CCない対照、および1mM c-ジGMP（「競合制御」）を補充した制御を含む。
注：CDG-CCの濃度は1〜10μMに調整することができる。 - 暗闇の中で、回転ホイール上に少なくとも2時間（O / Nのための膜画分）、4℃でインキュベートする。
- 短いスピンした後、架橋CDG-CCの反応性部分の活性化により4分間のUV光で、CaproBoxを使用して（λ= 310 nmの放射照度≥10ミリワット/ cm 2で、光源からの距離、物質一覧を見る= 2センチ）。注：ストリップ架橋前の蓋を外す。
- 優しく均質化、25μlの5倍の洗浄緩衝液（5MのNaCl、250 mMトリス、pH7.5）を、よく再懸濁ストレプトアビジン磁気ビーズ50μlのを追加。
- 回転ホイール上で1時間4℃でインキュベートする。
6.洗浄ステップ
注：（マグネット：材料リストを参照してください）。磁石を用いたPCRストリップ蓋の磁気ビーズの捕獲、始めます。その後、次の洗浄溶液を含む新しい1によりPCRストリップを交換してください。磁石を外し、ビーズを再懸濁し、2分間インキュベートする。スピンダウンし、新鮮な蓋によって蓋を交換してください。
- 洗浄工程（のみ可溶性画分）
- 200μlの1×洗浄バッファーで6回洗浄する。
- 200μlのHPLCグレードH 2 Oで一度洗浄する
- 洗浄液200μlの80％アセトニトリル中の6回。
- 200μlのHPLCグレードH 2 Oで2回洗浄
- 洗浄ステップ（membraNE画分のみ）
- + 0.1％DDM200μlの1×洗浄緩衝液で5回洗浄する。
- 200μlの1×洗浄緩衝液+ 0.05％DDMに2回洗浄する。
- + 0.025％DDM200μlの1×洗浄緩衝液で一回洗浄する。
- 200μlの1×洗浄緩衝液+ 0.0125パーセントのDDMに一度洗ってください。
- 200μlの100mMのABCで3回洗浄し（炭酸水素アンモニウム、NH 4 CO 3）+ 2 M尿素。
7. MSサンプル調製
- 20μlの100mMのABC（膜分画用の100 mMのABC + 8 M尿素）で（直接蓋）ビーズを再懸濁し、1.5mlチューブに移す。
- 膜画分は、500 rpmで振盪し、5分間60℃でインキュベートする。
- 0.5μlの200 mMのTCEP（トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン）を添加し、500 rpmで振盪、1時間60℃でインキュベートする。 25℃に冷却する。
- 揺れ、ヨードアセトアミド新たに調製された400mmの0.5μl添加し、30分間25℃でインキュベート500回転数トン、暗所で。
- 0.5μlの0.5 M のN -アセチルシステインを追加し、500 rpmで振盪、10分間25℃でインキュベートする。
- 膜画のみ：1μLのLys-Cを追加し、37℃、O / Nでインキュベートする。
- 2μgのトリプシンを追加し、500回転（乾燥を防ぐためにパラフィルムでラップ）で振とうし、37℃でO / Nインキュベートする。
注：サンプルは、この段階で-20℃で保存することができる。
注：メンブレン分のみ：トリプシンの添加の前に<2 Mに尿素濃度を調整するために100 mMのABCを追加します。 - 簡単に言えば、チューブをスピンダウンし、磁石でビーズを収集します。
- 新しい1.5 mlチューブに上清を移し（ビーズが残っている場合は、この手順を繰り返します）。
- 5μlの5％TFA（トリフルオロ酢酸）+ 1μlの2 M塩酸（膜分画のための15μlの5％TFA + 5μlの2 M HCl）を追加します。
- 条件C18をMicroSpinカラム150μlのアセトニトリル（ネストグループ、MA、USA）（2400 rpmで20秒スピン）。
- エクイ150μlの0.1％TFA（スピン20秒、2400 RPM）でC18カラムを2回librate。
- サンプルをロードし、2分、2000rpmでスピン。
- カラムにフロースルーをリロードし、紡糸工程（2分、2000 rpm）を繰り返します。
- 150μlの0.1％TFA、5％アセトニトリル（20秒、2400回転）で3回洗浄する。
- 新しいチューブに取り、150μlの0.1％TFA、50％アセトニトリル（2分間、2000 rpmで）で2回溶出する。
- スピードバック中のペプチドを乾燥させる。
- 40μlの98％H 2 O、2％アセトニトリル、0.15％ギ酸に再懸濁。
- 超音波処理20秒（パルス周期0.5、振幅100パーセント、物質一覧を参照）、5秒、回転数12,000rpm（ベンチトップ遠心機）をスピンダウン。ボルテックス10秒、及び5秒、12,000rpmでスピンダウン。 LC-MS / MS分析のためにHPLCバイアルに移す。
- -20℃で凍結する。
注：サンプルは、この段階で-20℃で保存することができる。
8. LC-MS / MS分析
- ナノLCを実行します（ナノLCシステム）equippRP-HPLCカラム（75ミクロンインチx 37 cm）のC18樹脂を充填したと編（マジックC18 AQ3μm）を、95％溶媒A（0.15％ギ酸、2％のアセトニトリル）、5％の溶媒Bの直線勾配を使用して（ 0.2μlの/分の流速で60分間かけて35％溶媒B 98％アセトニトリル、0.15％ギ酸）。
- LC-MS / MS（エレクトロスプレーイオン源に接続されたデュアル圧力LTQ-オービトラップVelos質量分析計）を用いてペプチドを分析する。
注：データ収集モードは、MSが20の最も強いイオンを線形イオントラップにMS / MSスキャン、続い6万FWHMの分解能で質量分析計のFT部分をスキャンつの高解像度が得られるように設定した。 MS / MSの試みの効率を高めるために、荷電状態スクリーニング様式が割り当てられていない除外することが可能と単独イオンを充電した。前駆体は100イオン数を超えると共謀誘起解離がトリガされました。動的排除時間を30秒とした。イオン蓄積時間は300ミリ秒（MS）と50に設定したミリ秒（MS / MS）。
9.データベース検索
- P.をダウンロード緑膿菌 NCBI-データベースNCBIのホームページを経由して（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ）。
- MassMatrix変換ツール（使用してマスコットジェネリックファイルにMS生のスペクトル（MGF）に変換http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.pyを ）。
- P.に対してMASCOTバージョン2.3を使用してこのMGFファイルを検索フォワード含む緑膿菌 NCBIデータベースと逆デコイタンパク質のエントリ。
- （プロリンが続く限り）2が完全にトリプシンペプチドで切断を逃し耐えリジンとアルギニンの後シリコトリプシン消化で実行します。
- 固定修飾などのシステイン残基の変数の修正及びカルボキシアミドメチル（57.021464ダ）として酸化されたメチオニン（15.99491 DA）を可能にするために、データベースの検索パラメータを設定します。 MASCOTは私たちを検索するための高解像度スキャンをる、15 ppmまで前駆質量許容値を設定し、0.6 DAにフラグメント質量許容値を設定。最後に、1％タンパク質FDRを設定します。
- P.のマスコット検索をインポート足場（Proteomesoftware、バージョン3）に緑膿菌 CCMS実験は、1％のタンパク質FDR近くを取得し、合計スペクトルカウントを抽出するためのパラメータを設定する。
- 本稿の代表的な結果のために、我々は競合制御と実験を比較するために対応のあるt検定を使用し、0.1以下のp値のみと考え安打、及び2以上のスペクトルカウント比（スペクトルカウント/競合制御スペクトルを試すカウント）。
- データは、さらなる分析のために任意の表計算ソフトにエクスポートすることができる。
10.ラベルフリー定量
- Progenesis LC-MSソフトウェア（非線形力学、バージョン4.0）にRAWファイルをインポートします。
- デフォルトセッティにおけるLC-MSアライメントおよび特徴検出を行うNGS。
- Progenesis LC-MSからMGF形式でデータをエクスポートします。
- NCBI P.に対してMASCOTを使用して、MS / MSスペクトルを検索するフォワード含む緑膿菌データベースと逆デコイタンパク質のエントリ。
- Progenesis LC-MSへのデータベースの検索結果をインポートし、MS1機能へのペプチドの識別をマップします。
- （0.1以下のq値 、2上記のスペクトルカウント比閾値）データ評価（有意レベルの計算、倍変化を比）がSafeQuantのProteinSQAnalysisスクリプトが使用された。
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Representative Results
P.における新規c-ジ-GMPのエフェクターを同定するために、 緑膿菌我々は体系的にPの可溶性および膜画分を分析するためにCCMSを使用対数期培養（OD 600 = 0.5）から緑膿菌菌株 PAO1。ここでは、この釣りの遠征の代表的な結果を要約し、議論する。四つの独立した生物学的なレプリカが使用された。各実験のために二つの異なるCDG-CC濃度（5μMおよび10μM）を用いた。特異性を探索するために、実験は、競合他社と、最後に、ビーズコントロール（ すなわち CDG-CC無し）（ 表1）のように1 mMのc-ジGMPの存在下または非存在下で行った。
（ 図2）上で詳細に記載された方法に従うとき、我々は、足場形式で捕捉されたタンパク質のリストを生成した。そうな汚染物質を除去した。これは、リボソームタンパク質、ストレプトアビジン、トリプシン、血清アルブミン、ケラチンおよび他のヒトタンパク質を含んでいた。タンパク質識別偽発見率（FDR）は、足場ソフトウェアを使用して1％に設定し、データをExcelにエクスポートした。足場が提供する受託番号は、PのリストにリンクされたExcelでVLOOKUP関数を使用して、遺伝子座番号に変換することができる緑膿菌座番号。この段階では、ヒットリストは、可溶性画分768タンパク質と膜画分433タンパク質を含む。しかし、ほとんどのタンパク質が著しく捕獲実験において富化されていない。このように、おそらく非特異的に（ビーズコントロール内の正または唯一のc-ジ-GMPのライバルの存在下で）捕獲されたタンパク質を除去した。我々は2つのより大きな比の捕獲実験及び競合制御とだけ考えられたタンパク質との間のスペクトルカウント比を算出した。さらに、我々は、捕獲実験及び競合制御との間の重要性指標を提供し、0.1の許容しきい値を設定するために、スペクトルカウントに対応のあるt検定を用いた。最後に我々は完全に取ら2捕獲化合物濃度について4回の実験で同定された少なくとも4つのペプチドだけ強固なヒットと考えた。これらの基準は、ニーズに応じて、検証し、しきい値を設定するための標準として結合タンパク質のc-ジ-GMP予測を使用して調整する必要があります。ソートした後、リストは、可溶性画分について76ヒット、および膜の画分についての133のタンパク質に減少した。これは、可溶性13とPから21の膜タンパク質が含まれて既知またはc-ジGMP（ 表2）を結合すると予測されている緑膿菌 。他の63の可溶性及び112の膜タンパク質は、既知のc-ジ-GMP結合ドメインの1が含まれていない新たな推定上のc-ジ-GMP結合タンパク質である。これらのヒットは、お客様の特定のc-ジ-GMPに結合することをテストすることにより検証される今持っている。
前の画面では、GlyA2（PA2444）、GlyA3（PA4602）とGsp69（PA1127）1を釣った。これら3つのタンパク質は、クローニングされた過剰発現から精製し大腸菌および33 Pを用いて、UV架橋実験においてc-ジGMPに結合することが検証されなかったがc-ジGMP 15とラベル。 K d は s は実際の新規エフェクターはCCMSを使用することによって同定することができることを示す、それぞれ1.0、2.0および6.9μMで決定した。
この代表的な例に加えて、我々は、異なる成長条件から、および様々な細胞内c-ジGMP濃度た（n = 24）を用いて回収した細胞の抽出物とCCMSを使用した。全体的に我々は、既知の74パーセント（51分の38）を捕獲またはPを予測緑膿菌 PAO1 c-ジ-GMPシグナル伝達成分（24/32可溶性タンパク質、14/19膜タンパク質）。これらの遺伝子のうち少なくとも9が特定の条件（酸化ストレス、クオラムセンシング、バイオフィルム）16下で転写されることが示されたことを考えると、いくつかは、まったくのc-ジ-GMPを結合しないことが、報道のこの度は、飽和状態に近いかもしれません。この一緒にWこれらのコンポーネントのほとんどの観察とERE高い特異性（ 表2）で撮影した強く、この技術は効果的かつ強力であると主張している。
図1：c-ジ-GMPの捕獲化合物の化学構造。
図2：CCMSワークフローの概要機械的な溶解後遊離ヌクレオチドは、PD10排除カラムを使用して除去される。可溶性または膜画分からのタンパク質は、CDG-CCとインキュベートし、混合物を架橋する捕捉されたタンパク質をUV照射に曝露される。過酷な洗浄のステップは、コーティングされた磁気ビーズ、ストレプトアビジンと結合した化合物を用いて行われている。ビーズ上でのトリプシン消化ペプチドを提供する、その後ビーズから分離し、その質量分析識別のためのプロトン化されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：PのVolcanoplots 緑膿菌タンパク質はかなりCCMSによって豊かに 。本文中に記載されるようにLC-MS / MS分析およびラベルフリー定量化に続いて、タンパク質を分類した。捕獲と競合実験間の検出されたペプチドのlog2強度比を計算し、有意性分析（改変t統計量、経験的ベイズ法17）に由来する値に対してプロットした。 p値<0.05との強度比> 1.5倍の有意の閾値内のタンパク質はindicatあるグレーのボックスに編。図4は、可溶性画分（A）および膜画分（B）10μMのc-ジGMP-CCの存在下で行い、及び1mM c-ジGMPとの競合実験のために複製する。丸で囲んだドットが知られてc-ジ-GMP結合タンパク質に相当する。 図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| キャプチャ： | バッファ | 化学物質 | ソース | 濃度 | |||||
| 細菌の溶解バッファー10倍 | MES | シグマ | 67 mMの | ||||||
| pHは7.5 | HEPES | シグマ | 67 mMの | ||||||
| NaClを | 私にRCK | 2 M | |||||||
| 酢酸Na | メルク | 67 mMの | |||||||
| DTT | フルカ | 10 mMの | |||||||
| DNアーゼI | ロッシュ | 20 U / mlの | |||||||
| 完全プロテアーゼ阻害剤カクテル | ロッシュ | 1タブ/ 10ミリリットル | |||||||
| バッファ5倍をキャプチャ | HEPES | シグマ | 100 mMの | ||||||
| KAC | シグマ | 250 mMの | |||||||
| MgAc（無水） | シグマ | 50 mMの | |||||||
| グリセロール | シグマ | 50％（V / V） | |||||||
| GDP、GTP、ATP、CTP | シグマ | 1 mMの各 | 洗浄バッファー5倍 | トリス-HCl | メルク | 1 M | |||
| （可溶性画用） | EDTA | シグマ | 0.5 M | ||||||
| pHは7.5 | NaClを | シグマ | 5 M | ||||||
| n-オクチルβ-D-グルコピラノシド | Anagrade（Affymetrix社） | 42.5μM | |||||||
| 洗浄バッファー5倍 | トリス-HCl | メルク | 1 M | ||||||
| （膜画分の場合） | EDTA | シグマ | 0.5 M | ||||||
| pHは7.5 | NaClを | シグマ | 5 M | ||||||
| 他の化学物質： | 重炭酸アンモニウム（ABC） | フルカ | |||||||
| 尿素 | Applichem | ||||||||
| MSのサンプル調製： | バッファ | 化学物質 | ソース | 濃度 | |||||
| C18緩衝液A | TFA | ピアース | 0.1％（V / V） | ||||||
| H 2 O HPLCグレード | 99.9％（V / V） | ||||||||
| C18緩衝液B | TFA | ピアース | 0.1％（V / V） | ||||||
| アセトニトリル | Biosolve | 49.9％（V / V） | |||||||
| H 2 O HPLCグレード | 50％（V / V） | ||||||||
| C18バッファ℃ | TFA | ピアース | 0.1％（V / V） | ||||||
| アセトニトリル | Biosolve | 5％（V / V） | |||||||
| H 2 O HPLCグレード | 94.9％（V / V） | ||||||||
| LC緩衝液A | ギ酸 | シグマ | 0.15％（V / V） | ||||||
| アセトニトリル | Biosolve | 2％ | |||||||
| H 2 O HPLCグレード | 97.85パーセント | ||||||||
| 他の化学物質： | トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP） | シグマ | |||||||
| ヨードアセトアミド（IAA） | シグマ | ||||||||
| N -アセチルシステイン | シグマ | ||||||||
| エンドプロテイナーゼのLys-C | 和光 | ||||||||
| トリプシン | プロメガ |
表1：バッファ構成バッファ組成、化学物質とサプライヤーのまとめ。。 c-ジGMP-捕獲化合物（競合制御用）、c-ジGMPは、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ、キャプチャバッファ、洗浄バッファはcaproKitに含まれている。
| ビーズコントロール | キャプチャ実験 | 競合制御 | |
| タンパク質抽出物 （10 mg / ml）で | 30μL | 30μL | 30μL |
| c-ジ-GMP（10 mM）を | 0μL | 0μL | 10μL |
| ヌクレオチド （各ヌクレオチドの10 mM）を | 10μL | 10μL | 10μL |
| キャプチャバッファ5倍 | 20μL | 20μL | 20μL |
| H 2 O | 42μL | 32μL | 22μL |
| 30分間のインキュベーション | |||
| c-ジ-GMP〜CC（株100μM） | 0μL | 5-10μL | 5-10μL |
| 最終濃度： | ビーズコントロール | キャプチャ実験 | 競合制御 |
| c-ジ-GMP〜CC（μM） | 0μM | 5-10μM | 5-10μM |
| 競争相手のc-ジ-GMP（μM） | 0μM | 0μM | 千μM |
表2：反応混合物をキャプチャビーズ制御のための反応混合物の概要（ すなわち捕獲化合物を含まない）、（c-ジGMP-CCによる）捕捉実験、およびCの大過剰が含ま競合制御。ジ - GMP。 c-ジGMP-CCの最終濃度を調整することができ、そして典型的には5から10μMの間に設定される。
| タンパク質名 | 座位ID | ドメイン構造 | 捕獲実験/競争実験1 | ||||||||||||||||||
| A）可溶性画 | CDG-CC = 5μM | =10μMのCDG-CC | |||||||||||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF * | 14/0 | 14/0 | 13/0 | 11/0 | 14/0 | 12/0 | 14/0 | 14/0 | |||||||||||
| WSPR | PA3702 | REC-GGEEF * | 9/0 | 9/0 | 10/0 | 9/0 | 11/0 | 10/0 | 11/0 | 11/0 | |||||||||||
| - | PA2567 | GAF-SPTRF-EAL | 8/0 | 4/0 | 9/0 | 0/0 | 7/0 | 3/0 | 8/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | ピルツ | 11/0 | 12/0 | 13/0 | 12/0 | 12/0 | 10/0 | 11/0 | 12/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 5/0 </ TD> | 3/0 | 6/0 | 5/0 | 8/0 | 5/0 | 6/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA5295 | GDDEF-EAL | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 1/0 | 6/0 | 6/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| FimX | PA4959 | PAS-GDSIF-EVL | 23/1 | 21/0 | 21/0 | 11/0 | 24/3 | 23/2 | 22/0 | 20/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | ピルツ | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 0/0 | 3/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | ピルツ | 3/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | ピルツ | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | ||||||||||||
| - | PA4324 | ピルツ | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3177 | GGEEF | 2/0 | 1/0 | 3/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4396 | REC-DEQHF | 0/0 | 1/0 | 4/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 5/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0169 | GGEEF * | 3/0 | 2/0 | 6/0 | 7/0 | 7/1 | 6/2 | 9/1 | 7/1 | |||||||||||
| - | PA2799 | ピルツ | 1/0 | 0/0 | 2/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA5017 | PAS-GAF-PAS-ASNEF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 3/2 | 0/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA5487 | GGEEF * | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| b）の膜画分 | CDG-CC = 5μM | =10μMのCDG-CC | |||||||||||||||||||
| - | PA2072 | CHASE4-TM-PAS-GGDEF - EAL | 13/1 | 25/0 | 27/0 | 19/0 | 36/0 | 36/0 | 31/0 | 23/0 | |||||||||||
| - | PA0861 | TM-PAS-GGDEF-ELL | 6/1 | 14/0 | 13/0 | 10/0 | 17/0 | 18/0 | 13/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | ピルツ | 6/0 | 10/0 | 9/0 | 7/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 5/0 | |||||||||||
| - | PA3343 | 5TM-GGDEF | 3/0 | 7/0 | 7/0 | 4/0 | 12/0 | 10/0 | 7/0 | 7/0 | |||||||||||
| - | PA1181 | MASE1-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-ELL | 3/0 | 6/0 | 9/0 | 3/0 | 12/0 | 12/0 | 5/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA0847 | TM-CHASE4-HAMP-PAS-GGDEF | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 1/0 | 15/0 | 13/0 | 8/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA0575 | PBPb-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF - EAL | 1/0 | 7/0 | 6/0 | 3/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 2/0 | |||||||||||
| yfiN | PA1120 | 2TM-HAMP-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 3/0 | 5/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 1/0 | 4/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 5/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4929 | 7TMR：DISMED2-7TMR：DISMED2-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | |||||||||||
| モーラ | PA4601 | TM-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF - EAL | 3/0 | 7/0 | 7/3 | 5/0 | 9/0 | 10/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| - | PA1851 | 5TM-GGDEF | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA2870 | TM-GGDEF | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3311 | TM-MHYT-MHYT-MHYT-AGDEF-EAL | 1/1 | 5/0 | 7/1 | 4/0 | 8/0 | 8/0 | 5/1 | 3/0 | |||||||||||
| bifA | PA4367 | TM-GGDQF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 2/1 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | ピルツ | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 3/0 | 3/0 | 2/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4332 | 5TM-GGEEF | 1/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | ピルツ | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | ピルツ | 4/0 | 8/0 | 7/0 | 7/0 | 5/2 | 11/2 | 7/2 | 8/3 | |||||||||||
| - | PA1433 | HAMP-RGGEF-KVL | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF | 0/0 | 0/0 | 1/1 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | * = GGDEFドメインはI部位を含む | ||||||||||
| 同定されたペプチドのスペクトルカウントの1の数 | |||||||||||||||||||||
表3：P.緑膿菌は、具体的に捕獲さc-ジ-GMPシグナル伝達成分を知られています。テキストで説明したように同定されたタンパク質が最初に選別した。タンパク質は、それらの名称および軌跡番号にして同定され、我々は彼らのアーキテクチャは、キャプチャ特異性と再現性を示すために、NCBIの保存ドメインデータベースオンラインツール（N = 4、CDG-CC = 5または10μM）を用いて予測を示しているメソッドの。
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Discussion
特別な注意は、プロトコルのいくつかのステップで撮影する必要があります。タンパク質濃度は10 mgの濃度の重要なパラメータである/ mlの細胞が特定の増殖条件（ 例えば、バイオフィルムまたは小型コロニー変種）で増殖させたときに到達することが困難である。従って、ペレットの再懸濁を溶解緩衝液の少量で行われるべきである。タンパク質濃度は8mg / mlまで減少させることができる。 Nesper らによって公表された方法と比較して1は、ヌクレオチド結合タンパク質の非特異的な取り込みを最小限にするために捕獲反応に様々なヌクレオチドを加えた。ヌクレオチドの付加は、特異性を改善しているが、同時に同じ部位で異なるヌクレオチドに結合するタンパク質の取り込みを防止することができる。例えば、最近、ATPおよびc-ジ-GMP 18を結合することが示されたエフェクターFleQはではなく、もはやDで、私たちの前の実験1におけるATPの非存在下では、具体的釣ったアタATPの過剰の存在下で、ここに提示した。
CDG-CCは慎重に光から保護されるべきである。周囲光はUVのごく一部が含まれているが、これはUV照射によって活性化する前に、アルミホイルで包まれた捕獲化合物ストック、ならびに捕捉ミックスを維持することが推奨される。捕捉されたタンパク質は、共有結合CDG-CCに結合されるように従って洗浄工程は、特異性を増加させることは非常に厳しいことができる。 LC-MS / MS分析に関しては、実験は、クリーンなケラチンのない環境で行うべきである。また、HPLC適合性の緩衝液は、特に洗浄工程の後、使用されるべきである。候補リストは、典型的には、複製物（例えば、表2を参照）との間に低バリエーション（四重用）300〜800のタンパク質を含む。
タンパク質とCDG-CC濃度のようないくつかのパラメータはA生物に応じて最適化する必要がある場合がありますnalyzed。唯一の特定の条件下で発現低豊富なタンパク質またはタンパク質は見逃しやすいことができますので、注意が採用培養条件については注意が必要です。この問題は、同じ培養条件のために収集グローバルタンパク質ATLASでヒットリストを比較することによって克服することができる。それは、膜タンパク質を可溶化する能力に関して最適化される必要があり、また、互換性MSである必要がある最後に、界面活性剤の最適化は、困難な場合があります。
一つは、それは足場の残りの部分に1リボースの2'OH基を介して結合されているように、CCのc-ジ-GMP分子は、化学的に、変更されていることを心に留めておく必要がある。この修飾は、それによって偽陰性を提供するいくつかのエフェクターに結合する能力を変化させることができる。この文脈において、我々は、EALドメインを保有するが、P.でGGDEFドメインを欠くタンパク質を捕捉したことがないことは注目に値する緑膿菌 、EALタンパク質はカウルのように、他の種で捕獲されたが、obacter crescentus。これは貧しいアクセスまたは結合部位に、またはEALタンパク質によるCDG-CCの劣化にCDG-CCの低親和性によるものである可能性があります。対照的に、多くのヌクレオチド結合タンパク質は、かなりの程度、おそらく擬陽性であり、比較的低い特異性で捕捉した。このようDRaCALA 20、UV架橋15、示差走査蛍光光度（DSF）21、マイクロスケールの熱泳動（MST）22、等温熱量測定（ITC）23のような技術使用c-ジGMPへの特異的結合のさらなる検証- 24 ...で あるしたがって、必要に応じて。
これは、捕獲化合物のc-ジGMP部分の画分が細胞溶解物からのホスホジエステラーゼによって分解されることも可能である。従って、これは、架橋前にホスホジエステラーゼ活性を制限する、手順は4℃で実施しなければならない理由の一つである。
。手順再多くの細菌種に適合させることができ、正常に非常にわずかな修正1と3種の異なる細菌種のために使用されてきた。化合物ベースの技術は、共有結合に依存しない他の技術と比較して、（ 例えば、1 Mの塩、高洗剤濃度、膜タンパク質の場合には2 M尿素、80％アセトニトリル）の完全な洗浄を使用して、偽陽性を低減することができる取り込む。候補の検証は面倒で時間のかかるプロセスであり得ることを考えると、これは14に接近による化学プロテオミクスのような代替的な方法の主要な利点である。
この図示ビデオ方式は、小分子のシグナル伝達に関与する新規コンポーネントを特定し、特徴づけるための強力で汎用性の高いツールとしてCCMSを確立します。将来的には、他の選択グループを保有する類似の捕捉化合物は、新規のc-ジAMPエフェクターのような低分子シグナル伝達に関与するタンパク質を捕捉するために使用することができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
References
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