Abstract
Значительный прогресс был достигнут в течение последнего десятилетия к идентификации и характеризации ферментов, участвующих в синтезе (diguanylate циклаз) и деградации (фосфодиэстеразы) второго посланника C-ди-GMP. В отличие от этого, имеется мало информации о молекулярных механизмах и клеточных компонентов, через которые эта сигнализация молекула регулирует широкий спектр клеточных процессов. Большинство известных эффекторных белков относятся к семейству PILZ или выродились diguanylate циклаз или фосфодиэстеразы, которые дали на катализа и приняли эффекторной функции. Таким образом, чтобы лучше определить сотовую сеть с-ди-GMP в широком диапазоне бактерий экспериментальные методы, необходимые для идентификации и проверки новых эффекторы, для которых надежность в предсказания силиконового из строя.
Недавно мы разработали новый Захват соединения масс-спектрометрия (CCMS) на основе технологии как мощный инструмент длябиохимически выявить и охарактеризовать C-ди-GMP связывающих белков. Этот метод был ранее сообщалось, применимы к широкому кругу организмов 1. Здесь мы дадим подробное описание протокола, который мы используем, чтобы исследовать такие компоненты сигнализации. В качестве примера, мы используем синегнойная палочка, патогенных микроорганизмов, в которых с-ди-GMP играет важную роль в вирулентности и биопленки контроля. CCMS определены 74% (38/51) из известных или прогнозируемых компонентов сети C-ди-GMP. Это исследование объясняет процедуру СКК в деталях, и устанавливает его в качестве мощного и универсального инструмента для выявления новых компонентов, участвующих в передаче сигналов малой молекулы.
Introduction
C-ди-GMP является ключевым вторичным мессенджером, которая используется большинством бактерий, чтобы управлять различными аспектами их рост и поведение. Например, C-ди-GMP регулирует прогрессию клеточного цикла, подвижность и экспрессию экзополисахаридов и поверхностных адгезинов 2-4. На основе координации этих процессов с ди-GMP способствует формированию биопленки, процесс, который связан с хроническими инфекциями диапазоне патогенных бактерий 5. C-ди-GMP является синтезированным с помощью ферментов, называемых diguanylate циклаз (РСК), которые укрывают каталитический домен GGDEF 4. Некоторые РСК обладают ингибирующим сайт, который вниз регулирует циклазным деятельность на C-ди-GMP обязательными. Деградация с-ди-GMP катализируется двумя различными классами фосфодиэстеразы (PDE), несущих либо каталитического EAL или HD-мошенник домен 6,7.
Большинство из известных эффекторных белков, которые непосредственно связывают с-ди-GMP принадлежат к одной из всего лишь трех классов белков: каталитическиесоюзник неактивные GGDEF или EAL домены и PILZ доменов, небольшие молекулярные переключатели, которые подвергаются конформационные изменения при связывании с-ди-GMP 8. РСК, уравнений в частных производных и PILZ белки хорошо охарактеризованы, и их доменов может быть предсказана в кремнии сравнительно безопасно. Особый интерес в настоящее время сосредоточена на выявлении новых классов C-ди-GMP эффекторов. Некоторые эффекторы C-ди-GMP с различными связывающими мотивами были описаны недавно такие как CRP / ФНР семейства белков Bcam1349 в Burkholderia cenocepacia или регулятор транскрипции FleQ в P. палочки 9,10. Кроме того, C-ди-GMP конкретных riboswitches недавно были определены и показаны для контроля экспрессии генов в C-ди-ГМФ-зависимой манере 11. C-ди-GMP связывающие мотивы различных эффекторов только плохо сохраняется решений биоинформатики предсказания таких белков сложно. Чтобы решить эту проблему, мы разработали биохимический метод, основанный на использовании с-ди-GMP SPEспецифичны Захват соединения в сочетании с масс-спектрометрии 1,12,13.
Мы недавно инженерии роман трехвалентного C-ди-GMP Захват соединения (CDG-CC, рисунок 1) 1. Это химическое леса состоит из: 1) часть молекулы C-ди-GMP, используемого в качестве приманки, чтобы захватить с-ди-GMP-связывающие белки, 2) УФ-фотоактивируемый реактивная группа используется для сшивки CDG-CC до границ белков и 3) биотин, чтобы изолировать захваченные белки с использованием покрытых стрептавидином магнитные гранулы. CDG-CC может быть использован непосредственно, а в частности, захват с-ди-эффекторы GMP из сложной смеси макромолекул, как клеточных лизатов. Захват соединения на основе и химические подходы, основанные протеомики, ранее уже сообщалось, применима к широкому кругу организмов, например, Caulobacter crescentus, Сальмонелла энтерика серовар Typhimurium и П. палочки 1,14.
В этой методологической работе,мы предоставляем глубокое описание процедуры CCMS с использованием экстрактов P. палочки в качестве примера. Это исследование устанавливает СКК как мощный и универсальный инструмент для биохимически определить новые компоненты, участвующие в передаче сигналов малой молекулы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lysate Подготовка
- Растут Р. палочка клеток в LB к желаемой ОД.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для руководства: используйте ≈ 100 мл Культура / образец для фазовых культур стационарных и ≈ 500 мл КУЛЬТУРА / образец для логарифмической фазе культур (OD 600 нм = 0,5). - Гранул путем центрифугирования в течение 20 мин при 5000 х г.
- Ресуспендируйте 0,5-1 г гранул в 1 мл буфера для лизиса (6,7 мМ MES, 6,7 мМ Hepes, 200 мМ NaCl, 6,7 мМ Каца, ДДТ 1 мМ, рН 7,5) и добавить ингибитор протеазы (полный мини, ЭДТА-бесплатно), а также как DNAseI.
- Лизировать клетки по 3 проходов через французский ячейки давления, в 20000 фунтов на квадратный дюйм (список материалов).
- Ультра-центрифуги Клеточный лизат при 100000 х г в течение 1 ч при 4 ° С.
- Сохранить супернатант (перейдите к шагу 2).
- Вымойте гранул с 1 мл 1x буфера для лизиса с помощью пипетки вверх и вниз.
- Ультрацентрифуга при 100000 х г в течение 1 ч при 4 ° С.
- Вспышка замораживания осадка вжидкий азот и хранить при температуре -20 ° С до использования для захвата мембранных белков (см шаг 3).
2. Удаление свободного С-ди-GMP и другими нуклеотидами (растворимой фракции только)
- Вымойте колонку PD10 обессоливания (см список материалов) с 10 мл холодного буфера для лизиса.
- Налейте супернатант (≈ 1 мл) на PD10, чтобы удалить нуклеотидов.
- Элюируют 4 мл холодного буфера для лизиса (500 мкл) шагов.
- Выберите наиболее концентрированном фракций, как определено Бредфорда, и объединить их.
3. Пелле Ресуспендирование и Солюбилизация (мембранной фракции только)
- Ресуспендируют осадок в 500 до 1000 мкл буфера захвата 1x (без моющего средства) (таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: гранулы трудно ресуспендирования. Рекомендуется первого пипетки вверх и вниз с помощью пипетки грубо ресуспендируют осадок, затем использовать шприц 27 G хорошо гомогенизации раствора. - Добавить 1% (вес / объем) н-додецил-β-D-maltopyranoside (DDM).
- Инкубируйте при 4 ° С в течение по меньшей мере 2 ч (или O / N) на вращающемся колесе.
- Ультрацентрифуга при 100000 х г в течение 1 ч при 4 ° С.
- Урожай супернатант.
Измерение концентрации 4. Белок
- Измерение концентрации белка Бредфорда (по BCA анализом для мембранной фракции).
- Набор общую концентрацию белка 10 мг / мл.
5. Захват
- Смешайте 300 мкг белка с 1 мМ ВВП, GTP, АТР, СТР, и 20 мкл буфера захвата 5x (100 мМ HEPES, 250 мМ ц, 50 мМ MgAc, 5% глицерина, рН 7,5) (таблица 1). Отрегулируйте объем реакционной 100 мкл Н 2 О.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем включает объем CDG-CC и С-ди-GMP в случае управления конкуренции (см шаг 5,3 и таблицу 2).
Примечание: Все эксперименты проводились в 200 и# 181; л 12-труб ПЦР полосы (Thermo Scientific).
ПРИМЕЧАНИЕ: для мембранной фракции, убедитесь, чтобы всегда держать концентрацию DDM выше критической концентрации мицеллообразования (0,01% вес / объем), пока на стадии белок солюбилизации в 8 М мочевины (этап 7.1). - Инкубируйте при 4 ° С в течение 30 мин на вращающемся колесе.
- Добавить 10 мкм CDG-CC (конечная концентрация).
ПРИМЕЧАНИЕ: включают в себя управление без CDG-CC (называемый также "контроль бортом"), и дополненных 1 мМ с-ди-GMP ("управления соревнованиями") (см 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: концентрация CDG-CC может быть в диапазоне от 1 до 10 мкм. - Инкубируйте при 4 ° С в течение по меньшей мере 2 ч (O / N для мембранной фракции) на вращающемся колесе, в темноте.
- После короткого спина, сшивки путем активации реактивной фрагменту CDG-CC с УФ-светом в течение 4 мин, с использованием CaproBox (см Перечень компонентов, λ = 310 нм, освещенность ≥10 мВт / см², расстояние от источника = 2 см), ПРИМЕЧАНИЕ: снимите крышку полос до сшивания.
- Добавить 25 мкл 5х буфера для стирки (5 М NaCl, 250 мМ Трис, рН 7,5) и 50 мкл и ресуспендировали стрептавидином магнитные гранулы, осторожно гомогенизируют.
- Инкубируйте при 4 ° С в течение 1 часа на вращающемся колесе.
6. Стиральные шаги
Примечание: (Магнит: см список материалов). Начните с захвата магнитных шариков в крышке полосы ПЦР, с магнитом. Затем заменить прокладку ПЦР на новую, содержащую следующую промывочного раствора. Удалить магнит и ресуспендируйте бусы, и инкубировать 2 мин. Спин вниз и заменить крышку свежим крышкой.
- Стиральные стадии (растворимая фракция только)
- Вымойте 6 раз в 200 мкл 1x промывочного буфера.
- Вымойте раз в 200 мкл для ВЭЖХ H 2 O.
- Промыть 6 раз в 200 мкл 80% ацетонитрила.
- Вымойте 2 раза в 200 мкл для ВЭЖХ H 2 O.
- Стиральные стадии (Membraпе доля только)
- Вымойте 5 раз в 200 мкл 1x промывочного буфера + 0,1% ДДС.
- Вымойте 2 раза в 200 мкл 1x промывочного буфера + 0,05% ДДС.
- Вымойте раз в 200 мкл 1x промывочного буфера + 0,025% ДДС.
- Вымойте раз в 200 мкл 1x промывочного буфера + 0,0125% ДДС.
- Промыть 3 раза в 200 мкл 100 мМ ABC (бикарбонат аммония, NH 4 CO 3) + 2 М мочевину.
7. М. Подготовка образцов
- Ресуспендируют бусины (прямо в крышке) в 20 мкл 100 мМ ABC (100 мм ABC + 8 М мочевину для мембранной фракции) и передать в 1,5 мл пробирки.
- Только мембранной фракции: инкубировать при 60 ° С в течение 5 мин, встряхивании при 500 оборотах в минуту.
- Добавить 0,5 мкл 200 мМ TCEP (трис (2-карбоксиэтил) фосфина) и инкубируют при 60 ° С в течение 1 часа, встряхивая при 500 оборотах в минуту. Охладить до 25 ° С.
- Добавить 0,5 мкл свежеприготовленного 400 мМ иодацетамида и инкубировать при 25 ° С в течение 30 мин, встряхиваят 500 оборотов в минуту и в темноте.
- Добавить 0,5 мкл 0,5 М N-ацетил-цистеин и инкубировать при 25 ° С в течение 10 мин, встряхивании при 500 оборотах в минуту.
- Только мембранной фракции: добавить 1 мкл Lys-C и инкубируют при 37 ° C, O / N.
- Добавить 2 мкг трипсина и инкубируют O / N при 37 ° С, встряхивая при 500 оборотах в минуту (обертки в парафильмом, чтобы предотвратить высыхание).
Примечание: образцы можно хранить при -20 ° С на этой стадии.
Только мембранную фракцию: ПРИМЕЧАНИЕ добавить 100 мМ ABC регулировать концентрацию мочевины <2 м перед добавлением трипсина. - Кратко спином вниз трубы и собирать шарики с магнитом.
- Передача супернатант в новую пробирку 1,5 мл (Повторите этот шаг, если шарики остаются).
- Добавить 5 мкл 5% TFA (трифторуксусной кислоты) + 1 мкл 2 М HCl (15 мкл 5% TFA + 5 мкл 2 М HCl для мембранной фракции).
- Состояние C18 MicroSpin колонки (гнездо Group, MA, USA) с 150 мкл ацетонитрила (спиновые 20 сек при 2400 оборотах в минуту).
- Оборlibrate столбцы C18 2 раза 150 мкл 0,1% TFA (спина 20 сек, 2400 оборотов в минуту).
- Загрузите образец и спин 2 мин, 2000 оборотов в минуту.
- Обновить проточного на колонку и повторите шаг спиннинг (2 мин, 2000 оборотов в минуту).
- Промыть 3 раза с 150 мкл 0,1% TFA, 5% ацетонитрила (20 сек, 2400 оборотов в минуту).
- Возьмем в новую пробирку и элюируют дважды 150 мкл 0,1% TFA, 50% ацетонитрила (2 мин, 2000 оборотов в минуту).
- Высушите пептиды в скорости-VAC.
- Ресуспендируют в 40 мкл 98% H 2 O, 2% ацетонитрил, 0,15% муравьиной кислоты.
- Ультразвук 20 сек (импульсный цикл 0,5, амплитуда 100%, см список материалов) и спином вниз 5 сек, 12 000 оборотов в минуту (настольный центрифуги). Vortex 10 сек, и спин вниз 5 сек, 12 000 оборотов в минуту. Трансфер в ВЭЖХ флакон для анализа LC-MS / MS.
- Замораживание при -20 ° С.
Примечание: образцы можно хранить при -20 ° С на этой стадии.
8. ЖХ-МС / МС анализ
- Запуск нано-LC (нано-LC системы) equippред с колонки ВЭЖХ с обращенной фазой (75 мкм х 37 см), заполненную смолой С18 (Magic С18 AQ 3 мкм) с использованием линейного градиента от 95% растворителя А (0,15% муравьиной кислоты, 2% -ным ацетонитрилом) и 5% растворителя В ( 98% ацетонитрил, 0,15% муравьиной кислоты) до 35% растворителя В течение 60 мин при скорости потока 0,2 мкл / мин.
- Анализ пептидов с помощью ЖХ-МС / МС (двойное нажатие LTQ-Orbitrap Velos масс-спектрометр, подключенный к источнику ионов электрораспылением).
ПРИМЕЧАНИЕ: Режим сбора данных была настроена на получение одного высокого разрешения MS сканирования в FT части масс-спектрометра с разрешением 60000 FWHM последующим MS / MS сканирования в линейном ионной ловушки из 20 наиболее интенсивных ионов. Для повышения эффективности попыток MS / MS, взимается государственная скрининг модус был включен, чтобы исключить отменяется и вместо отдельно взимает ионы. Сговор индуцированной диссоциации срабатывает, когда предшественник превысил 100 ионов на счету. Продолжительность динамического исключения был установлен на 30 сек. Время накопления ионов была установлена на 300 мс (МС) и 50мсек (МС / МС).
9. Поиск в базе данных
- Скачать P. палочки NCBI-базы данных через домашнюю страницу NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
- Преобразование MS сырой спектры в талисман общих файлов (MGF), используя инструмент преобразования MassMatrix ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
- Искать в этом MGF файл, используя талисман версии 2.3 против P. палочки NCBI-база данных, содержащая в прямом и обратном-приманки записи белка.
- Выполните в силикомарганца трипсина пищеварения после лизина и аргинина (если не сопровождается пролина) Мириться два пропущенных расколы в полной мере триптических пептидов.
- Установите параметры поиска по базе данных, чтобы окисленных метионины (15,99491 DA) как переменную изменениями и carboxyamidomethylation (57,021464 Да) остатков цистеина как фиксированная модификации. Для MASCOT поиск насчисле сканирование с высоким разрешением, положить массу терпимости предшественника 15 страниц в минуту и установите массовой терпимости фрагмент 0,6 Da. Наконец, установите белок FDR до 1%.
- Импорт талисман поиски P. палочки CCMS опыты в строительные леса (Proteomesoftware, версия 3), установите параметры для получения белка FDR близко к 1%, и извлечь полной спектральной пунктам.
- По мнению представителя Результаты представлены в этой статье, мы использовали в паре Испытание Т сравнить эксперимент с контролем конкуренции и рассматривается только хиты со значением р ниже 0,1 и спектральной отношение счета над 2 (опыт спектральные отсчеты / управления соревнованиями спектральных на счету).
- Данные могут быть экспортированы в любой редактор электронных таблиц для дальнейшего анализа.
10. Этикетка без Количественное
- Импорт необработанных файлов в Progenesis LC-MS программного обеспечения (Нелинейная динамика, версия 4.0).
- Выполните выравнивание LC-MS и функцию обнаружения по умолчанию в АдминNGS.
- Экспорт данных в формате MGF от Progenesis LC-MS.
- Поиск спектров MS / MS, используя талисман против NCBI P. база данных палочка, содержащий вперед и назад, приманки записи белка.
- Импорт результатов поиска по базе данных в Progenesis ЖХ-МС и карта пептидов идентификации с особенностями MS1.
- Для оценки данных (расчета уровней значимости, складные изменения коэффициентов) был использован сценарий ProteinSQAnalysis из SafeQuant (порог: значение Q ниже 0,1, спектральный коэффициент счетчика выше 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для идентификации новых C-ди-GMP эффекторов П. палочки мы систематически используется СКК для анализа растворимых и мембранных фракциях P. палочки штамма PAO1 из лог-фазе культуры (OD 600 = 0,5). Здесь мы подвести итоги и обсудить репрезентативные результаты этого рыбалку. Были использованы четыре независимых биологические реплики. Для каждого эксперимента были использованы два различных концентраций CDG-CC (5 мкм и 10 мкм). Исследовать на специфичность, эксперименты проводились в присутствии или в отсутствие 1 мМ С-ди-GMP как конкурент и, наконец, с контролем бортового (т.е. без CDG-CC) (таблица 1).
Когда по методу, описанному выше подробно (рис 2), мы составили список захваченных белков в формате эшафот. Вероятные загрязнения были удалены. Это включало рибосомных белков, стрептавидин, трипсин, сывороточный альбумин, кератин и другие белки человека. БелокИдентификация ложных открытие (FDR) был установлен до 1% с помощью программного обеспечения Леса, и данные экспортируются, чтобы преуспеть. Инвентарный номер обеспечивается строительные леса могут быть преобразованы в числа локуса с использованием функции ВПР в Excel связана с списке P. палочка локус номера. На этом этапе, список совпадений содержит 768 белки для растворимой фракции и 433 белки для мембранной фракции. Тем не менее, большинство белков не существенно обогащена в эксперименте захвата. Таким образом, белки, которые, вероятно, захваченные неспецифически (положительный контроль борта или только в присутствии C-ди-GMP конкурента) были удалены. Мы рассчитали спектральную соотношение счета между экспериментом захвата и контроля в области конкуренции и рассматриваются только белки с коэффициентом больше двух. Кроме того, мы использовали парного критерия Стьюдента на спектральных отсчетов, чтобы обеспечить значимости меру между экспериментом захвата и контроля в области конкуренции, и установить разрешительный порог 0,1. НаконецМы рассматривали только надежные хиты по крайней мере четыре пептидов, идентифицированных в четырех экспериментов для концентрациях соединения 2 захвата, принятых в целом. Эти критерии должны быть скорректированы в соответствии с потребностями и с помощью проверяется и предсказал C-ди-GMP-связывающие белки в качестве стандарта для установки порога. После сортировки, список была снижена до 76 ударов за растворимой фракции, и 133 белков для мембранной фракции. Это включало 13 растворимых и 21 мембранных белков из P. палочки, которые известны или предсказаны для связывания с-ди-GMP (таблица 2). Другие растворимые и 63 112 мембранные белки являются новые предполагаемые C-ди-ГМФ-связывающие белки, которые не содержат одно из известных C-ди-GMP связывающих доменов. Эти хиты должны теперь быть подтверждено тестированием их специфического связывания С-ди-GMP.
В предыдущем экране мы ловили GlyA2 (PA2444), GlyA3 (PA4602) и Gsp69 (PA1127) 1. Эти три белки, были клонированы, избыточно экспрессируется, и очищают отКишечная палочка и может быть подтверждено, чтобы связать с-ди-GMP в УФ-кросс экспериментов связующих с использованием 33 P помечены гр-ди-GMP 15. К D S были определены на 1,0, 2,0 и 6,9 мкМ, соответственно, указывая, что на самом деле новые эффекторы могут быть идентифицированы с помощью СКК.
В дополнение к этому типичного примера, мы использовали СКК с экстрактами клеток, полученных из различных условий роста и различных внутриклеточных концентраций C-ди-GMP (N = 24). В целом, мы захватили 74% (38/51) из известных или прогнозируемых P. сигнальные компоненты палочки PAO1 C-ди-GMP (24/32 растворимые белки, 14/19 мембранные белки). Учитывая, что, по меньшей мере девять из этих генов были показаны, чтобы быть расшифрованы при определенных условиях (окислительный стресс, кворума, биопленки), 16 и некоторые из них не могут связываться с-ди-GMP вообще, это степень покрытия может быть близок к насыщению. Это, вместе с наблюдением, что большинство из этих компонентов маспрежде чем захвачены с высокой специфичностью (таблица 2) сильно утверждает, что этот метод является эффективным и мощным.
Рисунок 1: Химическая структура C-ди-GMP Захват соединения.
Рисунок 2:. CCMS резюме рабочий После механической лизиса свободные нуклеотиды удаляют с использованием колонки исключения PD10. Белки из растворимых или мембранных фракций инкубировали с CDG-CC, и смесь подвергается воздействию УФ-излучения для сшивания захваченных белков. Шаги суровой мытья осуществляется с соединениями, связанных с стрептавидина магнитные шарики. На бисера триптическое переваривание обеспечивает пептиды,которые затем отделяются от бус и протонированный к их массовому идентификации спектрометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.
Рисунок 3: Volcanoplots из P. палочка белки значительно обогатили СКК. После анализа ЖХ-МС / МС и этикеткой свободной количественного, белки были отсортированы, как описано в тексте. Отношение Log2 интенсивности обнаруженного пептида между захвата и конкурентных экспериментов были рассчитаны и построены по сравнению с значениями, полученными из анализа значимости (модификации Т-статистики, эмпирический метод Байеса 17). Белки в пределах пороговых значение для р-значения <соотношениях 0,05 и интенсивности> 1.5-сгиба indicatред в сером поле. 4 повторяет за растворимой фракции (А) и в мембранной фракции (В) проводили в присутствии 10 мкМ С-ди-GMP-CC, и конкуренция эксперимента с 1 мМ с-ди-GMP. В кружках точки соответствуют известным C-ди-GMP-связывающих белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.
| Capture: | Буфер | Химическая | Источник | Концентрация | |||||
| Лизису бактерий буфера 10x | MES | Сигма | 67 мм | ||||||
| рН 7,5 | HEPES | Сигма | 67 мм | ||||||
| NaCl | МнеRCK | 2 М | |||||||
| На ацетат | Merck | 67 мм | |||||||
| DTT | Fluka | 10 мм | |||||||
| DNAseI | Roche | 20 ед / мл | |||||||
| Полное ингибитора протеазы коктейль | Roche | 1 Tab / 10 мл | |||||||
| Захват буфера 5х | HEPES | Сигма | 100 мМ | ||||||
| КАс | Сигма | 250 мм | |||||||
| MgAc (безводный) | Сигма | 50 мм | |||||||
| Глицерин | Сигма | 50% (об / об) | |||||||
| ВВП, ГТФ, АТФ, CTP | сигма | 1 мм каждый | Промывочный буфер 5x | Трис-HCl | Merck | 1 М | |||
| (Для растворимой фракции) | ЭДТА | Сигма | 0,5 М | ||||||
| рН 7,5 | NaCl | Сигма | 5 M | ||||||
| н-октил-β-D-глюкопиранозид | Anagrade (Affymetrix) | 42,5 мкМ | |||||||
| Промывочный буфер 5x | Трис-HCl | Merck | 1 М | ||||||
| (Для мембранной фракции) | ЭДТА | Сигма | 0,5 М | ||||||
| рН 7,5 | NaCl | Сигма | 5 M | ||||||
| Другие химикаты: | Бикарбонат аммония (ABC) | Fluka | |||||||
| Мочевина | AppliChem | ||||||||
| MS пробоподготовка: | Буфер | Химическая | Источник | Концентрация | |||||
| C18 Буфер | TFA | Проколоть | 0,1% (об / об) | ||||||
| H 2 O класс ВЭЖХ | 99,9% (V / V) | ||||||||
| C18 буфера B | TFA | Проколоть | 0,1% (об / об) | ||||||
| Ацетонитрил | Biosolve | 49,9% (V / V) | |||||||
| H 2 O класс ВЭЖХ | 50% (об / об) | ||||||||
| C18 БуферC | TFA | Проколоть | 0,1% (об / об) | ||||||
| Ацетонитрил | Biosolve | 5% (об / об) | |||||||
| H 2 O класс ВЭЖХ | 94,9% (V / V) | ||||||||
| LC буфера | Муравьиная кислота | Сигма | 0,15% (об / об) | ||||||
| Ацетонитрил | Biosolve | 2% | |||||||
| H 2 O класс ВЭЖХ | 97.85% | ||||||||
| Другие химикаты: | трис (2-карбоксиэтил) фосфин (ТСЕР) | Сигма | |||||||
| йодацетамида (IAA) | Сигма | ||||||||
| N-ацетил-цистеин | Сигма | ||||||||
| Эндопротеиназой Lys-C | Вако | ||||||||
| Трипсин | Promega |
Таблица 1: Буферы состава Резюме буферов состава, химических веществ и поставщиков.. C-ди-ГМФ-захвата соединение, C-ди-ГМФ (для контроля конкуренции), покрытых стрептавидином магнитные гранулы, буфер захвата и промывочный буфер включены в caproKit.
| Контроль бисера | Захват эксперимент | Контроль Конкурс | |
| Экстракт белка (10 мг / мл) | 30 мкл | 30 мкл | 30 мкл |
| C-ди-ГМФ (10 мМ) | 0 мкл | 0 мкл | 10 мкл |
| Нуклеотиды (10 мМ каждого нуклеотида) | 10 мкл | 10 мкл | 10 мкл |
| Захват буфера 5x | 20 мкл | 20 мкл | 20 мкл |
| H 2 O | 42 мкл | 32 мкл | 22 мкл |
| 30 мин инкубации | |||
| C-ди-GMP ~ CC (акций 100 мкМ) | 0 мкл | 5-10 мкл | 5-10 мкл |
| Заключительные концентрации: | Контроль бисера | Захват эксперимент | Контроль Конкурс |
| C-ди-ГМФ ~ CC (мкМ) | 0 мкМ | 5-10 мкМ | 5-10 мкМ |
| Конкурент C-ди-ГМФ (мкМ) | 0 мкМ | 0 мкМ | 1000 мкМ |
Таблица 2:. Захват реакционную смесь Сущность реакционной смеси для контроля бортового (т.е. без захвата соединения), эксперимент захвата (с С-ди-GMP-CC), и контроль конкуренции, который содержит большой избыток C- ди-GMP. Конечная концентрация C-ди-ГМФ-CC может быть отрегулирована, и обычно устанавливается от 5 до 10 мкм.
| Название белка | Locus ID | Архитектура домена | Захват эксперимент / конкуренция эксперимент 1 | ||||||||||||||||||
| ) растворимой фракции | CDG-CC = 5 мкм | CDG-CC = 10 мкм | |||||||||||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF * | 14/0 | 14/0 | 13/0 | 11/0 | 14/0 | 12/0 | 14/0 | 14/0 | |||||||||||
| WSPR | PA3702 | REC-GGEEF * | 9/0 | 9/0 | 10/0 | 9/0 | 11/0 | 10/0 | 11/0 | 11/0 | |||||||||||
| - | PA2567 | GAF-SPTRF-EAL | 8/0 | 4/0 | 9/0 | 0/0 | 7/0 | 3/0 | 8/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | PILZ | 11/0 | 12/0 | 13/0 | 12/0 | 12/0 | 10/0 | 11/0 | 12/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 5/0 </ TD> | 3/0 | 6/0 | 5/0 | 8/0 | 5/0 | 6/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA5295 | GDDEF-EAL | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 1/0 | 6/0 | 6/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| FimX | PA4959 | PAS-GDSIF-EVL | 23/1 | 21/0 | 21/0 | 11/0 | 24/3 | 23/2 | 22/0 | 20/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | PILZ | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 0/0 | 3/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | PILZ | 3/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | PILZ | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | ||||||||||||
| - | PA4324 | PILZ | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3177 | GGEEF | 2/0 | 1/0 | 3/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4396 | REC-DEQHF | 0/0 | 1/0 | 4/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 5/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0169 | GGEEF * | 3/0 | 2/0 | 6/0 | 7/0 | 7/1 | 6/2 | 9/1 | 7/1 | |||||||||||
| - | PA2799 | PILZ | 1/0 | 0/0 | 2/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA5017 | PAS-GAF-PAS-ASNEF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 3/2 | 0/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA5487 | GGEEF * | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| б) мембранной фракции | CDG-CC = 5 мкм | CDG-CC = 10 мкм | |||||||||||||||||||
| - | PA2072 | CHASE4-TM-PAS-GGDEF-EAL | 13/1 | 25/0 | 27/0 | 19/0 | 36/0 | 36/0 | 31/0 | 23/0 | |||||||||||
| - | PA0861 | TM-PAS-GGDEF-ELL | 6/1 | 14/0 | 13/0 | 10/0 | 17/0 | 18/0 | 13/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | PILZ | 6/0 | 10/0 | 9/0 | 7/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 5/0 | |||||||||||
| - | PA3343 | 5TM-GGDEF | 3/0 | 7/0 | 7/0 | 4/0 | 12/0 | 10/0 | 7/0 | 7/0 | |||||||||||
| - | PA1181 | MASE1-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-ELL | 3/0 | 6/0 | 9/0 | 3/0 | 12/0 | 12/0 | 5/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA0847 | TM-CHASE4-Хамп-PAS-GGDEF | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 1/0 | 15/0 | 13/0 | 8/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA0575 | PBPb-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL | 1/0 | 7/0 | 6/0 | 3/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 2/0 | |||||||||||
| yfiN | PA1120 | 2TM-Хамп-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 3/0 | 5/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 1/0 | 4/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 5/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4929 | 7TMR: DISMED2-7TMR: DISMED2-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | |||||||||||
| Мора | PA4601 | TM-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL | 3/0 | 7/0 | 7/3 | 5/0 | 9/0 | 10/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| - | PA1851 | 5TM-GGDEF | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA2870 | TM-GGDEF | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3311 | TM-MHYT-MHYT-MHYT-AGDEF-EAL | 1/1 | 5/0 | 7/1 | 4/0 | 8/0 | 8/0 | 5/1 | 3/0 | |||||||||||
| Bifa | PA4367 | TM-GGDQF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 2/1 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | PILZ | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 3/0 | 3/0 | 2/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4332 | 5TM-GGEEF | 1/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | PILZ | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | PILZ | 4/0 | 8/0 | 7/0 | 7/0 | 5/2 | 11/2 | 7/2 | 8/3 | |||||||||||
| - | PA1433 | Хамп-RGGEF-КВЛ | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF | 0/0 | 0/0 | 1/1 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | * = GGDEF домена, содержащий I сайт | ||||||||||
| 1 число спектральных отсчетов, определенных пептидов | |||||||||||||||||||||
Таблица 3: П. палочки известно с-ди-ГМФ компоненты, специально захваченных сигналов. идентифицированных белков были впервые сортируются, как описано в тексте. Белки отождествляется с их именем и локуса число, и мы укажем их архитектура предсказал с базой данных онлайн инструмент NCBI консервативный домен (п = 4, CDG-CC = 5 мкм или 10 мкм) для того, чтобы показать специфику захвата и воспроизводимость метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Особое внимание должно быть принято на несколько шагов протокола. Концентрацию белка является критическим параметром при концентрации 10 мг / мл быть трудно достичь, когда клетки выращивают в определенных условиях роста (например биопленки или небольшие колонии вариантов). Таким образом, осадок ресуспендирования должны быть выполнены в небольшом объеме буфера для лизиса. Концентрации белка может быть уменьшена до 8 мг / мл. По сравнению с методом, опубликованном Nesper и др. 1, мы добавили различные нуклеотиды в реакции захвата минимизации неспецифической захват нуклеотидных связывающих белков. Хотя добавление нуклеотидов улучшить специфичность, оно может в то же время предотвратить захват белков, которые связываются различные нуклеотиды в том же месте. Например эффектор FleQ, который недавно был показан для связывания АТФ и C-ди-ГМФ 18 выловили в частности, в отсутствии АТФ в нашем предыдущем эксперименте 1, но не больше в Dата представлены здесь в присутствии избытка АТФ.
CDG-CC, должны быть тщательно защищены от света. Хотя рассеянный свет содержит лишь небольшую часть УФ, рекомендуется держать Захват соединения акции, завернутый в алюминиевую фольгу, а также сочетание захвата до активации УФ-облучения. Стиральные шаги, которые следуют может быть очень жестким, чтобы увеличить специфичность, как захваченного белки ковалентно связан с CDG-CC. Что касается анализа LC-MS / MS эксперименты должны проводиться в чистом кератина свободной среде. Кроме того, ВЭЖХ совместимые буферы должны быть использованы, особенно после стадии промывки. Список кандидатов, как правило, содержит от 300 до 800 белков (для четырех повторностях), с низкой вариации между повторами (см таблицу 2 в качестве примера).
Некоторые параметры, такие как белка и концентрации CDG-CC может должны быть оптимизированы в зависимости от организмов черезnalyzed. С низким обильные белки или белки, выраженные только при определенных условиях можно легко пропустить, следует позаботиться об условиях культуры, занятых. Эта проблема может быть преодолена путем сравнения списка совпадений с глобальной белка ATLAS, собранных в тех же условиях культивирования. И, наконец, оптимизация моющего средства может быть сложным, так как он должен быть оптимизирован в отношении его способности к солюбилизации мембранных белков, а также должен быть совместим МС.
Нужно иметь в виду, что молекула C-ди-ГМФ ЦК химически модифицирован, как это связано с помощью группы 2'OH одного рибозы к остальной части строительных лесов. Эта модификация может изменить свою способность к связыванию с некоторыми эффекторов тем самым обеспечивая ложные негативы. В этом контексте следует отметить, что мы никогда не захватили белки, которые укрывают домен EAL, но не имеют домен GGDEF в Р. палочки, хотя EAL белки были захвачены у других видов, как Caulobacter crescentus. Это может быть связано с плохим доступом или с низким сродством CDG-CC с сайтом связывания, или к деградации CDG-CC BY EAL белков. В отличие от этого, многие нуклеотидные-связывающие белки были захвачены с относительно низкой специфичности и, в значительной степени, вероятно ложных срабатываний. Кроме того проверка специфического связывания С-ди-GMP, используя такие методы, как DRaCALA 20, УФ-сшивки 15, дифференциальной сканирующей флуориметрия (DSF) 21, Microscale термофореза (MST) 22, изотермический калориметрия (ITC) 23 - 24 ... является Таким образом, необходимо.
Также возможно, что часть с-ди-GMP фрагмента захвата соединения разлагаются фосфодиэстераз из клеточного лизата. Это одна из причин, почему эта процедура должна быть проведена при температуре 4 ° С, тем самым ограничивая активность фосфодиэстеразы перед сшиванием.
Процедуры, применяемыеRe могут быть адаптированы к многих видов бактерий, и была успешно использована для 3-х различных видов бактерий с очень незначительными изменениями 1. Захват технологии на основе соединение может уменьшить число ложных срабатываний с помощью тщательной промывки (например, 1 М соли, высокой концентрации моющего средства, 2 М мочевины, в случае мембранных белков, 80% ацетонитрил), по сравнению с другими методами, которые не опираются на ковалентное связывание. Учитывая, что проверка кандидатов может быть утомительным и трудоемким процессом, это главное преимущество альтернативных методов, таких как химические протеомики подходы, основанные на 14.
Это иллюстрируется способ видео устанавливает СКК как мощный и универсальный инструмент для определения и описания новых компонентов, участвующих в передаче сигналов малой молекулы. В дальнейшем, аналогичные Захват соединения, несущие другие группы селективности может быть использован для захвата белки, участвующие в передаче сигналов малой молекулы, например, в новых C-ди-AMP эффекторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
References
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Hengge, R.
- Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You've come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
- Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
- Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
- Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
- Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
- Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
- Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
- Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
- Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
- Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
- Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
- Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
- Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
- Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
- Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
- DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
- Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
- Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).
