유비쿼터스 두 번째 메신저 c-di-GMP는 많은 박테리아의 성장과 행동을 제어합니다. 당사는 거의 모든 박테리아 종에서 c-di-GMP 결합 단백질을 생화학적으로 식별하고 특성화하기 위해 새로운 Capture Compound Mass Spectrometry 기반 기술을 개발했습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
상당한 진전은 제 메신저 C 디 GMP의 합성 (diguanylate cyclases) 열화 (포스 포)에 관여하는 효소의 확인 및 특성화를 향해 지난 10 년 동안 만들어졌다. 대조적으로, 약간의 정보가이 시그널링 분자가 세포 과정의 다양한 범위를 조절하는 분자 메커니즘을 통해 세포 성분과 관련하여 가능하다. 알려진 이펙터 단백질의 대부분은 필츠 (Pilz) 가족에 속한다 또는 촉매를 포기하고 이펙터 기능을 채택했다 diguanylate cyclases 또는 포스 포 디에스 퇴화된다. 따라서, 더 나은 실험 방법은 실리코 예측의 신뢰성이 실패하는 신규 이펙터를 식별하고 검증하는 데 필요한 박테리아 광범위 셀룰러 C 디 GMP 네트워크를 정의한다.
우리는 최근에 강력한 도구로 새로운 캡처 복합 질량 분석 (CCMS) 기반 기술을 개발했다생화학 적 식별 및 C 디 GMP 결합 단백질을 특성화. 이 기법은 이전에 하나의 유기체에 적용 가능한 다양한 것으로보고되었다. 여기서 우리는 이러한 신호 성분을 프로빙 이용하는 프로토콜의 자세한 설명을 제공한다. 예로서, 우리는 녹농균, C 디 GMP는 병독성 및 생물막 제어에 중요한 역할을하는 기회 적 병원균 사용. CCMS는 C 디 GMP 네트워크의 공지되거나 예측 된 성분의 74 % (51분의 38)를 식별. 본 연구는 상세히 CCMS 절차를 설명하고, 소분자 시그널링에 관련된 신규 한 구성 요소를 식별하기위한 강력하고 다양한 도구로 정한다.
서론
C 디 GMP 그들의 성장 및 행동의 다양한 측면을 제어하기 위해 사용되는 대부분의 세균에 의해 두번째 키 메신저. 예를 들어, C-디 GMP는 세포주기 진행, 운동성 및 엑소 폴리 사카 라이드 및 표면 adhesins 2-4의 발현을 조절한다. 이러한 프로세스의 조정을 통해 C 디 GMP는 biofilm 형성, 병원성 박테리아 5의 범위의 만성 감염과 관련된 프로세스를 촉진합니다. C 디 GMP는 촉매 GGDEF 도메인 4 항구 diguanylate cyclases (DGCs)라는 효소에 의해 synthetized된다. 일부 DGCs 다운 C-GMP 디 바인딩시 클라 제 활성을 조절하는 사이트 억제을 갖는다. C 디 GMP의 분해는 촉매 EAL 또는 HD-GYP 중 도메인 6,7 숨겨 포스 포의 두 가지 클래스 (PDE는)에 의해 촉매된다.
직접 C 디 GMP 결합 공지 효과기 단백질의 대부분은 단백질의 세 개의 클래스 중 하나에 속한다 : 촉매를동맹 비활성 GGDEF 또는 EAL 도메인과 필츠 (Pilz) 도메인, C 디 GMP 8 바인딩에 따라 구조 변화를 받아야 작은 분자 스위치. DGCs, PDE는 필츠 단백질은 잘 특징과 도메인은 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 해물 준비
- P. 성장 원하는 OD에 LB에 루기 노사 세포.
참고 : 지침 : 로그 상 문화에 대한 고정 위상 문화에 대한 ≈ 100 ml의 문화 / 샘플 ≈ 500㎖의이 배양 / 샘플 (외경 600 ㎚ = 0.5)를 사용합니다. - 5,000 x g에서 20 분 동안 원심 분리하여 펠렛.
- 재현 탁 0.5 ~ 1 ml의 용해 버퍼에 펠렛의 g (6.7 MM의 MES, 6.7 mM의 HEPES, 200 mM의 NaCl을, 6.7 mM의 한국 공항 공사, DDT 1 ㎜, pH를 7.5)와 단백질 분해 효소 억제제 (완전 미니, EDTA 무료)를 추가 할뿐만 아니라 DNaseI있다.
- 를 Lyse 20,000 psi에서 프랑스의 압력 셀을 통해 3 통로에 의해 세포 (자료 목록 참조).
- 초 원심 분리기 4 ° C에서 1 시간 동안 100,000 x g에서 세포 용 해물.
- 뜨는을 저장 (2 단계로 이동합니다).
- 피펫 팅 아래에 의해 용해 버퍼 1 배 1 mL를 펠렛을 씻으십시오.
- 초 원심 분리기 4 ℃에서 1 시간 동안 100,000 x
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
P.에 새로운 C 디 GMP 이펙터를 확인하려면 aeruginosa에 우리는 체계적으로 P.의 가용성과 막 분수를 분석하는 CCMS를 사용 로그 상 문화 루기 노자 균주 PAO1 (OD = 0.5 (600)). 여기에서 우리는 요약하고이 낚시 원정대의 대표적인 결과에 대해 설명합니다. 네 개의 독립적 인 생물 복제를 사용 하였다. 각 실험을위한 두 가지 CDG-CC 농도 (5 μM 및 10 μM)을 사용 하였다. 특이성 프로브, 실험 (표 1) (즉, CDG-CC)없이 비드 제어 최종적 1mM의 경쟁자로서 C 디와 GMP의 존재 또는 부재하에 수행 하였다.
(도 2) 위에 상세히 설명하면 다음과 같은 방법을 우리는 비계 형식으로 캡처 단백질의 목록을 생성했다. 가능성 오염 물질을 제거 하였다. 이 리보솜 단백질, 스트.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
특별한주의가 프로토콜의 여러 단계에서주의해야한다. 단백질 농도가 10 ㎎의 농도를 갖는 중요한 파라미터이다 / ml의 세포가 특정한 성장 조건 (예를 들면 작은 콜로니 생물막 또는 변이체) 하에서 성장 될 때 도달하기 힘들어. 따라서, 펠릿 부유 용균 완충액 저용량에서 수행되어야한다. 단백질 농도는 8 ㎎ / ㎖로 감소 될 수있다. Nesper 외. (1)에 의해 게시 된 방법과 비교하여, 우리는 뉴클레오티드 결합 단백질의 비특이적 포획을 최소화하기 위해 캡처 반응물에 다양한 뉴클레오타이드를 첨가. 뉴클레오티드 첨가 특이성을 개선하지만, 동시에 동일한 사이트의 서로 다른 뉴클레오티드 결합 단백질의 포착을 방지 할 수있다. 예를 들어 최근에 도시 된 효과기 FleQ는 ATP와 결합하는 C 디 GMP D 18 이상으로 한 우리의 이전의 실험에서 ATP의 부재하에 구체적 고기 잡이 아닌시켰다ATA ATP의 과잉 존재하에 여기에 제시된.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
녹농균에 대한 CCMS 조건을 최적화한 Alberto Reinders에게 감사드립니다. 우리는 또한 녹농균(P. aeruginosa) 단백질의 주석에 대해 Pablo Manfredi에게 감사를 표합니다. 이 작업은 스위스 국립과학재단(SNF)의 Sinergia 보조금 CRSII3_127433의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV 램프, 냉각 96-플레이트 냉각 블록에 연결, 광활성화를 위한 |
| caproMag | caprotec bioanalytics | CCMS 스타터 키트에 포함되어 있습니다. | 를 피펫팅하지 않고 자성 입자를 쉽게 취급할 수 있습니다 |
| . 요청 시 caproKit caprotec bioanalytics키트에는 c-di-GMP-capture 화합물, c-di-GMP(경쟁 제어용), streptavidin 코팅된 자성 비드, capture buffer, 그리고 세척 buffers가 포함되어 있습니다. | |||
| 일회용 PD-10 탈염 컬럼 | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-튜브 PCR 스트립 | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v 초음파 발생기 VialTweeter | Hielscher 초음파 기술 | UIS250v 및 VialTweeter | |
| 소형 프랑스어 압력 셀 | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
참고문헌
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Na....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
