التقاط الطيف الكتلي - أداة قوية لتحديد رواية ج-دي-GMP المستجيب البروتينات
Summary
The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.
Abstract
وقد تم إحراز تقدم كبير خلال العقد الماضي نحو تحديد وتوصيف الأنزيمات المشاركة في التوليف (cyclases diguanylate) وتدهور (phosphodiesterases) من رسول الثاني ج-دي-GMP. في المقابل، لا توجد معلومات المتاحة عن الآليات الجزيئية والمكونات الخلوية من خلالها هذا الجزيء يشير ينظم مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية. معظم البروتينات المستجيب معروفة تنتمي إلى عائلة بيلز أو تحولت cyclases diguanylate أو phosphodiesterases التي تخلت عن الحفز واعتمدت وظيفة المستجيب. وهكذا، إلى تعريف أفضل للشبكة ج-دي-GMP الخلوية في مجموعة واسعة من البكتيريا مطلوبة الطرق التجريبية لتحديد والتحقق من صحة المستجيبات الجديدة التي يمكن الاعتماد عليها في التنبؤات سيليكون وتفشل.
لقد وضعت مؤخرا لقطة مجمع رواية الطيف الكتلي (CCMS) القائمة على التكنولوجيا كأداة قوية لتحديد كيميائيا وتوصيف البروتينات ملزمة ج-دي-GMP. وقد سبق وذكرت هذه التقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع من الكائنات الحية 1. هنا نقدم وصفا مفصلا لالبروتوكول الذي نحن نستخدم لتحقيق هذه المكونات الإشارات. وكمثال على ذلك، ونحن نستخدم الزائفة الزنجارية، وهو ممرض الانتهازية التي ج-دي-GMP يلعب دورا حاسما في الفوعة وبيوفيلم السيطرة. حددت CCMS 74٪ (38/51) من المكونات المعروفة أو المتوقعة للشبكة ج-دي-GMP. توضح هذه الدراسة إجراء CCMS بالتفصيل، ويضع على أنها أداة قوية وتنوعا لتحديد مكونات جديدة تشارك في إشارة جزيء صغير.
Introduction
ج-دي-GMP هو رسول الثاني الرئيسي الذي يستخدمه معظم البكتيريا للسيطرة على مختلف جوانب النمو والسلوك. على سبيل المثال، ج-دي-GMP ينظم تقدم دورة الخلية، الحركة والتعبير عن exopolysaccharides وadhesins سطح 2-4. من خلال تنسيق عمليات من هذا القبيل ج-دي-GMP يعزز تشكيل بيوفيلم، وهي عملية ترتبط العدوى المزمنة من مجموعة واسعة من البكتيريا المسببة للأمراض 5. ج-دي-GMP وsynthetized بواسطة إنزيمات تسمى cyclases diguanylate (DGCS) التي تأوي مجال GGDEF الحفاز 4. بعض DGCS تمتلك موقع المثبطة التي تنظم أسفل النشاط محلقة على ج-دي-GMP ملزمة. يتم تحفيز تدهور ج-دي-GMP من قبل اثنين من فصول متميزة من phosphodiesterases (المعادلات التفاضلية الجزئية) بإيواء إما EAL الحفاز أو HD-GYP نطاق 6،7.
الغالبية العظمى من البروتينات المستجيب المعروفة التي تربط ج-دي-GMP مباشرة تنتمي إلى واحدة من الفئات الثلاث فقط من البروتينات: الحفازGGDEF أو EAL المجالات الخاملة حليف والمجالات بيلز، ومفاتيح الجزيئية الصغيرة التي تخضع لتغييرات بتكوين على ج-دي-GMP ملزمة 8. وتتميز كذلك DGCS، المعادلات التفاضلية الجزئية وبيلز البروتينات ويمكن التنبؤ المجالات الخاصة بهم في سيليكون بسلام نسبيا. وتركز اهتمام خاص الآن على تحديد فئات جديدة من المستجيبات ج-دي-GMP. وقد وصفت بعض المؤثرات ج-دي-GMP بزخارف ملزمة مختلفة مثل هذا مؤخرا في CRP / FNR Bcam1349 الأسرة البروتين في بوركهولدريا cenocepacia أو FleQ منظم النسخي في P. الزنجارية 9،10. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحديد مؤخرا riboswitches ج-دي-GMP محددة، وأظهرت للسيطرة على التعبير الجيني بطريقة ج-دي-GMP-تعتمد 11. زخارف ج-دي-GMP ملزمة من المؤثرات المختلفة يتم حفظها بشكل سيئ فقط جعل التنبؤات بيوينفورمتيك هذه البروتينات صعوبة. لمعالجة هذه المسألة، قمنا بتطوير طريقة الكيمياء الحيوية، والتي تقوم على استخدام جمعية مهندسي البترول ج-دي-GMPمجمع التقاط محدَّدة جنبا إلى جنب مع مطياف الكتلة 1،12،13.
لقد المهندسة مؤخرا ثلاثي التكافؤ رواية مجمع ج-دي-GMP القبض على (صندوق الإيداع والتدبير-CC، الشكل 1) 1. وتتألف هذه سقالة الكيميائي لل: 1) شاردة ج-دي-GMP تستخدم كطعم للقبض ج-دي-GMP البروتينات ملزمة، 2) مجموعة رد الفعل للأشعة فوق البنفسجية photoactivatable تستخدم لعبور الارتباط صندوق الإيداع والتدبير-CC للبروتينات ملزمة و 3) البيوتين لعزل البروتينات استولت باستخدام الخرز streptavidin المغلفة المغناطيسية. صندوق الإيداع والتدبير-CC يمكن استخدامها لالتقاط المستجيبات ج-دي-GMP مباشرة وتحديدا من خليط معقد من الجزيئات كما لست] الخلية. القبض على مجمع أساس وسبق وذكرت النهج الكيميائية البروتيوميات القائم على أن تنطبق على مجموعة واسعة من الكائنات الحية، على سبيل المثال العنيقاء crescentus، السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية وP. الزنجارية 1،14.
في هذه الورقة المنهجية،نحن نقدم لفي وصف عمق الإجراء CCMS باستخدام مقتطفات من P. الزنجارية كمثال على ذلك. وتحدد هذه الدراسة CCMS كأداة قوية وتنوعا لتحديد كيميائيا مكونات جديدة تشارك في إشارة جزيء صغير.
Protocol
Representative Results
Discussion
وينبغي إيلاء عناية خاصة في عدة خطوات للبروتوكول. تركيز البروتين هو معلمة حرجة مع تركيز 10 ملغ / مل يجري يصعب الوصول إليها عندما تزرع الخلايا تحت ظروف النمو محددة (مثل الأغشية الحيوية أو المتغيرات مستعمرة صغيرة). وبالتالي، ينبغي إجراء إعادة تعليق بيليه في حجم منخفض…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.
Materials
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
References
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).
- Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You’ve come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
- Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
- Furukawa, S., Kuchma, S., O’Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
- Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
- Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
- Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
- Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
- Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
- Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
- Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
- Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
- Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
- Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
- Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
- Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
- DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
- Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
- Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).
