The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.
Der er gjort betydelige fremskridt i løbet af det sidste årti mod identifikation og karakterisering af enzymer involveret i syntesen (diguanylate cyclaser) og nedbrydning (fosfodiesteraser) af den anden messenger c-di-GMP. I modsætning hertil få oplysninger om de molekylære mekanismer og cellulære komponenter, hvorigennem dette signalmolekyle regulerer en bred vifte af cellulære processer. De fleste af de kendte effektor proteiner tilhører Pilz familie eller er degenereret diguanylate cyclaser eller phosphodiesteraser, der har givet op på katalyse og har vedtaget effektorfunktion. Således bedre at definere den cellulære c-di-GMP net i en bred vifte af bakterier eksperimentelle metoder er nødvendige for at identificere og validere nye effektorer for hvilke pålidelige i silico forudsigelser mislykkes.
Vi har for nylig udviklet en ny Capture Compound massespektrometri (CCMS) baseret teknologi som et effektivt redskab til atbiokemisk identificere og karakterisere c-di-GMP-bindende proteiner. Denne teknik er tidligere blevet rapporteret at være gældende for en lang række organismer 1. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af den protokol, vi udnytter at sonden sådanne signalering komponenter. Som et eksempel, bruger vi Pseudomonas aeruginosa, et opportunistisk patogen, hvor c-di-GMP spiller en kritisk rolle i virulens og biofilm kontrol. CCMS identificeret 74% (38/51) af de kendte eller forventede komponenter i C-di-GMP-netværk. Denne undersøgelse forklarer CCMS procedure i detaljer, og etablerer det som et stærkt og alsidigt redskab til at identificere nye komponenter involveret i lille molekyle signalering.
c-di-GMP er en vigtig anden budbringer, der anvendes af de fleste bakterier til at styre forskellige aspekter af deres vækst og adfærd. For eksempel c-di-GMP regulerer cellecyklusprogression, motilitet og ekspressionen af exopolysaccharider og overflade adhæsiner 2-4. Ved koordinering af sådanne processer C-di-GMP fremmer biofilm dannelse, en proces, der er forbundet med kroniske infektioner af en række sygdomsfremkaldende bakterier 5. c-di-GMP syntetiseres af enzymer kaldet diguanylate cyclaser (DGCs), der huser en katalytisk GGDEF domæne 4. Nogle DGCs besidder en hæmmende websted, ned regulerer cyclase aktivitet ved c-di-GMP binding. Nedbrydningen af c-di-GMP katalyseres af to særskilte klasser af phosphodiesteraser (PDE'er), der huser enten en katalytisk EAL eller HD-GUF domæne 6,7.
Størstedelen af de kendte effektor proteiner, der direkte binder c-di-GMP tilhører en af kun tre klasser af proteiner: katalytiskallieret inaktive GGDEF eller EAL domæner og Pilz-domæner, små molekylære kontakter, der gennemgår konformationsændringer upon c-di-GMP binding 8. DGCs, PDE'er og Pilz proteiner er godt karakteriseret, og deres domæner kan forudsiges i silico relativt sikkert. En særlig interesse er nu fokuseret på identifikation af nye klasser af c-di-GMP effektorer. Nogle C-di-GMP effektorer med forskellige bindende motiver blev beskrevet for nylig, såsom CRP / FNR protein familie Bcam1349 i Burkholderia cenocepacia eller den transkriptionelle regulator FleQ i P. aeruginosa 9,10. Desuden blev C-di-GMP-specifikke riboswitches nylig identificeret og vist at styre genekspression i en C-di-GMP-afhængig måde 11. C-di-GMP bindende motiver af forskellige effektorer kun dårligt bevaret gør bioinformatiske forudsigelser af sådanne proteiner vanskelig. For at løse dette problem har vi udviklet en biokemisk metode, som er baseret på anvendelsen af en C-di-GMP spefikke Capture Compound kombineret med massespektrometri 1,12,13.
Vi har for nylig udviklet en ny trivalent C-di-GMP Capture Forbindelse (CDG-CC, figur 1) 1. Denne kemiske stillads er sammensat af: 1) en C-di-GMP del anvendes som madding til at fange C-di-GMP-bindende proteiner, 2) en UV-fotoaktiverbart reaktiv gruppe anvendes til at tværbinde CDG-CC til de bundne proteiner og 3) et biotin til at isolere de indfangede proteiner under anvendelse af streptavidin-coatede magnetiske perler. CDG-CC kan anvendes til direkte og specifikt fange c-di-GMP effektorer fra kompleks blanding af makromolekyler som cellelysater. Capture Compound baseret og kemiske proteomics tilgange er tidligere blevet rapporteret at være gældende for en lang række organismer, f.eks Caulobacter crescentus, Salmonella enterica serovar typhimurium og P. aeruginosa 1,14.
I denne metodologiske dokument,vi giver en dybtgående beskrivelse af CCMS procedure ved hjælp ekstrakter af P. aeruginosa som et eksempel. Denne undersøgelse fastslår CCMS som et stærkt og alsidigt værktøj til biokemisk identificere nye komponenter involveret i lille molekyle signalering.
Særlig forsigtighed bør tages på flere trin i protokollen. Proteinkoncentrationen er en kritisk parameter med en koncentration på 10 mg / ml er vanskeligt at nå, når cellerne dyrkes under særlige vækstbetingelser (f.eks biofilm eller små kolonier varianter). Således bør pellet resuspension udføres i et lille volumen lysisbuffer. Proteinkoncentrationer kan reduceres til 8 mg / ml. Sammenlignet med metoden offentliggjort af Nesper et al. 1, har vi tilføjet forskellige nukleotider …
The authors have nothing to disclose.
We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.
caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |