捕獲化合物質量分析 - 小説のc-ジ-GMPエフェクタータンパク質を同定するための強力なツール
Summary
The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.
Abstract
かなりの進歩は、第二メッセンジャーc-ジ-GMPの合成（ジグアニルシクラーゼ）及び分解（ホスホジエステラーゼ）に関与する酵素の同定および特徴に向けた最後の十年の間に行われている。これとは対照的に、ほとんど情報がこのシグナル伝達分子は、細胞プロセスの多様な範囲を規制を通じて分子機構と細胞成分に関する利用可能です。知らエフェクタータンパク質のほとんどは、ピルツファミリーに属するか、触媒作用をあきらめているとエフェクター機能を採用しているジグアニルシクラーゼ又はホスホジエステラーゼを縮退している。したがって、より良い細菌実験方法の広範囲の細胞c-ジGMPネットワークを定義することは失敗するインシリコ予測における信頼性のあるもののための新規のエフェクターを識別し、検証する必要がある。
我々は最近の強力なツールとしての新規捕獲化合物質量分析法（CCMS）に基づく技術を開発しました生化学的にc-ジ-GMP結合タンパク質を同定し、特徴づける。この技術は、以前に生物1の広い範囲に適用可能であることが報告されている。ここでは、我々はそのようなシグナル伝達成分を調べるために利用するプロトコルの詳細な説明を与える。例として、 緑膿菌 、c-ジ-GMPが病原性とバイオフィルム制御に重要な役割を果たしている日和見病原体を使用しています。 CCMSは、c-ジ-GMPネットワークの既知または予測コンポーネントの74パーセント（51分の38）を同定した。この研究は、詳細にCCMS手順を説明し、小分子のシグナル伝達に関与する新規成分を同定するための強力で汎用性の高いツールとしてそれを確立します。
Introduction
c-ジGMPは、その成長と行動の様々な側面を制御するために、ほとんどの細菌によって使用される重要なセカンドメッセンジャーである。例えば、c-ジGMPは、細胞周期進行、運動性およびエキソポリサッカライド及び表面アドヘシン2-4の発現を調節する。このようなプロセスのc-ジ-GMPの協調を通じて、バイオフィルム形成、病原菌5の範囲の慢性感染症に関連付けられているプロセスを促進する。 c-ジ-GMPは、触媒GGDEFドメイン4を保有するジグアニルシクラーゼ（DGCs）と呼ばれる酵素によって合成されている。いくつかのDGCsはダウンc-ジ-GMP結合の際シクラーゼ活性を調節阻害部位を有する。 c-ジ-GMPの劣化は、触媒EALまたはHD-GYPドメイン6,7のいずれかを保有するホスホジエステラーゼの二つの異なるクラス（偏微分方程式）によって触媒される。
直接c-ジGMPに結合する既知のエフェクタータンパク質の大部分は、タンパク質の唯一の3つのクラスに属する：触媒を同盟国、非アクティブGGDEFまたはEALドメインとピルツドメイン、c-ジ-GMPが8と結合すると立体構造変化を受ける小さな分子スイッチ。 DGCs、偏微分方程式とピルツタンパク質が十分に特徴付けされ、そのドメインは比較的安全にin silicoで予測することができる。特に関心は現在c-ジ-GMPエフェクターの新しいクラスの識別に焦点を当てている。別の結合モチーフを有するいくつかのc-ジ-GMPのエフェクターは、 バークホルデリアcenocepacia中のCRP / FNRタンパク質ファミリーBcam1349またはPにおける転写調節因子FleQとして最近、記載された緑膿菌 9,10。また、c-ジGMP特異的リボスイッチは、最近同定され、c-ジGMP依存性の様式11に遺伝子発現を制御することが示された。異なるエフェクターのc-ジ-GMPが結合モチーフはわずかしか保存されたようなタンパク質の生物情報学の予測を困難にしている。この問題に対処するために、我々は、c-ジGMPのSPEの使用に基づく生化学的方法を開発cific捕獲化合物は、質量分析法1,12,13と組み合わせる。
我々は最近、（CDG-CC、 図1）は、新規三価のc-ジ-GMPの捕獲化合物を設計しています1。 、c-ジ-GMP結合タンパク質を捕捉するために餌として使用1）c-ジGMP部分結合したタンパク質にCDG-CCをリンク交差するために使用する2）紫外線光活性化反応基と：この化学足場はで構成されている3）ビオチンは、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを用いて捕捉されたタンパク質を単離する。 CDG-CCは、直接かつ特異的に細胞溶解物のような高分子の複雑な混合物からc-ジGMPエフェクターを捕捉するために使用することができる。捕獲化合物系、化学プロテオミクスに基づくアプローチは、以前は、広範囲の生物に適用可能であることが報告されており、 例えばカウロバクターcrescentus、サルモネラ·エンテリカ血清型ネズミチフス菌およびP.緑膿菌 1,14。
この方法論の論文では、我々は、P。の抽出物を使用してCCMS手順の深さの説明で提供例として緑膿菌 。この研究は、生化学的に、小分子のシグナル伝達に関与する新規成分を同定するための強力で汎用性の高いツールとしてCCMSを確立します。
Protocol
Representative Results
Discussion
特別な注意は、プロトコルのいくつかのステップで撮影する必要があります。タンパク質濃度は10 mgの濃度の重要なパラメータである/ mlの細胞が特定の増殖条件（ 例えば、バイオフィルムまたは小型コロニー変種）で増殖させたときに到達することが困難である。従って、ペレットの再懸濁を溶解緩衝液の少量で行われるべきである。タンパク質濃度は8mg / mlまで減少させることがで?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.
Materials
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
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