Захват соединения масс-спектрометрия - мощный инструмент для идентификации новых гр-ди-GMP эффекторных белков
Summary
The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.
Abstract
Значительный прогресс был достигнут в течение последнего десятилетия к идентификации и характеризации ферментов, участвующих в синтезе (diguanylate циклаз) и деградации (фосфодиэстеразы) второго посланника C-ди-GMP. В отличие от этого, имеется мало информации о молекулярных механизмах и клеточных компонентов, через которые эта сигнализация молекула регулирует широкий спектр клеточных процессов. Большинство известных эффекторных белков относятся к семейству PILZ или выродились diguanylate циклаз или фосфодиэстеразы, которые дали на катализа и приняли эффекторной функции. Таким образом, чтобы лучше определить сотовую сеть с-ди-GMP в широком диапазоне бактерий экспериментальные методы, необходимые для идентификации и проверки новых эффекторы, для которых надежность в предсказания силиконового из строя.
Недавно мы разработали новый Захват соединения масс-спектрометрия (CCMS) на основе технологии как мощный инструмент длябиохимически выявить и охарактеризовать C-ди-GMP связывающих белков. Этот метод был ранее сообщалось, применимы к широкому кругу организмов 1. Здесь мы дадим подробное описание протокола, который мы используем, чтобы исследовать такие компоненты сигнализации. В качестве примера, мы используем синегнойная палочка, патогенных микроорганизмов, в которых с-ди-GMP играет важную роль в вирулентности и биопленки контроля. CCMS определены 74% (38/51) из известных или прогнозируемых компонентов сети C-ди-GMP. Это исследование объясняет процедуру СКК в деталях, и устанавливает его в качестве мощного и универсального инструмента для выявления новых компонентов, участвующих в передаче сигналов малой молекулы.
Introduction
C-ди-GMP является ключевым вторичным мессенджером, которая используется большинством бактерий, чтобы управлять различными аспектами их рост и поведение. Например, C-ди-GMP регулирует прогрессию клеточного цикла, подвижность и экспрессию экзополисахаридов и поверхностных адгезинов 2-4. На основе координации этих процессов с ди-GMP способствует формированию биопленки, процесс, который связан с хроническими инфекциями диапазоне патогенных бактерий 5. C-ди-GMP является синтезированным с помощью ферментов, называемых diguanylate циклаз (РСК), которые укрывают каталитический домен GGDEF 4. Некоторые РСК обладают ингибирующим сайт, который вниз регулирует циклазным деятельность на C-ди-GMP обязательными. Деградация с-ди-GMP катализируется двумя различными классами фосфодиэстеразы (PDE), несущих либо каталитического EAL или HD-мошенник домен 6,7.
Большинство из известных эффекторных белков, которые непосредственно связывают с-ди-GMP принадлежат к одной из всего лишь трех классов белков: каталитическиесоюзник неактивные GGDEF или EAL домены и PILZ доменов, небольшие молекулярные переключатели, которые подвергаются конформационные изменения при связывании с-ди-GMP 8. РСК, уравнений в частных производных и PILZ белки хорошо охарактеризованы, и их доменов может быть предсказана в кремнии сравнительно безопасно. Особый интерес в настоящее время сосредоточена на выявлении новых классов C-ди-GMP эффекторов. Некоторые эффекторы C-ди-GMP с различными связывающими мотивами были описаны недавно такие как CRP / ФНР семейства белков Bcam1349 в Burkholderia cenocepacia или регулятор транскрипции FleQ в P. палочки 9,10. Кроме того, C-ди-GMP конкретных riboswitches недавно были определены и показаны для контроля экспрессии генов в C-ди-ГМФ-зависимой манере 11. C-ди-GMP связывающие мотивы различных эффекторов только плохо сохраняется решений биоинформатики предсказания таких белков сложно. Чтобы решить эту проблему, мы разработали биохимический метод, основанный на использовании с-ди-GMP SPEспецифичны Захват соединения в сочетании с масс-спектрометрии 1,12,13.
Мы недавно инженерии роман трехвалентного C-ди-GMP Захват соединения (CDG-CC, рисунок 1) 1. Это химическое леса состоит из: 1) часть молекулы C-ди-GMP, используемого в качестве приманки, чтобы захватить с-ди-GMP-связывающие белки, 2) УФ-фотоактивируемый реактивная группа используется для сшивки CDG-CC до границ белков и 3) биотин, чтобы изолировать захваченные белки с использованием покрытых стрептавидином магнитные гранулы. CDG-CC может быть использован непосредственно, а в частности, захват с-ди-эффекторы GMP из сложной смеси макромолекул, как клеточных лизатов. Захват соединения на основе и химические подходы, основанные протеомики, ранее уже сообщалось, применима к широкому кругу организмов, например, Caulobacter crescentus, Сальмонелла энтерика серовар Typhimurium и П. палочки 1,14.
В этой методологической работе,мы предоставляем глубокое описание процедуры CCMS с использованием экстрактов P. палочки в качестве примера. Это исследование устанавливает СКК как мощный и универсальный инструмент для биохимически определить новые компоненты, участвующие в передаче сигналов малой молекулы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Особое внимание должно быть принято на несколько шагов протокола. Концентрацию белка является критическим параметром при концентрации 10 мг / мл быть трудно достичь, когда клетки выращивают в определенных условиях роста (например биопленки или небольшие колонии вариантов). Таким ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.
Materials
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
References
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).
- Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You’ve come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
- Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
- Furukawa, S., Kuchma, S., O’Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
- Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
- Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
- Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
- Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
- Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
- Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
- Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
- Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
- Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
- Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
- Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
- Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
- DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
- Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
- Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).
