Captura compuesto Espectrometría de Masas - Una herramienta de gran alcance para identificar nuevos c-di-GMP efectoras Proteínas
Summary
The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.
Abstract
Se ha logrado un progreso considerable en la última década hacia la identificación y caracterización de las enzimas implicadas en la síntesis (guanilato diguanylate) y degradación (fosfodiesterasas) del segundo mensajero c-di-GMP. Por el contrario, hay poca información disponible acerca de los mecanismos moleculares y componentes celulares a través del cual esta molécula de señalización regula una amplia gama de procesos celulares. La mayoría de las proteínas efectoras conocidas pertenecen a la familia Pilz o se degeneró guanilato diguanylate o fosfodiesterasas que han renunciado a la catálisis y han adoptado la función efectora. Por lo tanto, para definir mejor la red de c-di-GMP celular en una amplia gama de bacterias se requieren métodos experimentales para identificar y validar nuevos efectores para el cual fiable en las predicciones in silico fallar.
Recientemente hemos desarrollado una novela de captura compuesto Espectrometría de Masas (CCMS) tecnología basada como una poderosa herramienta parabioquímicamente identificar y caracterizar proteínas de unión a c-di-GMP. Esta técnica ha sido previamente informado para ser aplicable a una amplia gama de organismos 1. Aquí se da una descripción detallada del protocolo que utilizamos para investigar tales componentes de señalización. Como un ejemplo, usamos Pseudomonas aeruginosa, un patógeno oportunista en la que c-di-GMP juega un papel crítico en el control de la virulencia y la biopelícula. CCMS identificó 74% (38/51) de los componentes conocidos o previstos de la red de c-di-GMP. Este estudio explica el procedimiento CCMS en detalle, y lo establece como una herramienta potente y versátil para identificar nuevos componentes que participan en la señalización de pequeña molécula.
Introduction
c-di-GMP es un segundo mensajero clave usada por la mayoría de las bacterias para controlar varios aspectos de su crecimiento y comportamiento. Por ejemplo, c-di-GMP regula la progresión del ciclo celular, la motilidad y la expresión de exopolisacáridos y adhesinas de superficie 2-4. A través de la coordinación de tales procesos de c-di-GMP promueve la formación de biofilm, un proceso que está asociado con infecciones crónicas de una gama de bacterias patógenas 5. c-di-GMP se sintetiza por enzimas llamadas guanilato diguanylate (PED) que albergan un dominio catalítico GGDEF 4. Algunos PED poseen un sitio de inhibidor que regula hacia abajo la actividad de la adenilato sobre c-di-GMP de unión. La degradación de c-di-GMP está catalizada por dos clases distintas de las fosfodiesterasas (PDE) que alberga ya sea un EAL catalítica o HD-GYP de dominio 6,7.
La mayoría de las proteínas efectoras conocidas que se unen directamente c-di-GMP pertenecen a una de las tres clases de proteínas: catalíticaGGDEF o EAL dominios aliado inactivos y dominios Pilz, pequeños interruptores moleculares que experimentan cambios conformacionales a vinculantes c-di-GMP 8. PED, PDE y Pilz proteínas están bien caracterizados y sus dominios se pueden predecir en silico relativamente segura. Un especial interés se centra ahora en la identificación de nuevos tipos de efectores c-di-GMP. Algunos efectores de c-di-GMP con diferentes motivos de unión se describieron recientemente como el CRP / FNR Bcam1349 familia de proteínas en Burkholderia cenocepacia o la FleQ regulador transcripcional en P. aeruginosa 9,10. Además, riboswitches-GMP-específico c-di han sido recientemente identificados y muestran para controlar la expresión génica de una manera c-di-GMP-11 dependiente. Los motivos c-di-GMP de unión de diferentes efectores son sólo mal conservadas hacer predicciones bioinformáticas de tales proteínas difícil. Para solucionar este problema, hemos desarrollado un método bioquímico, que se basa en el uso de un spe c-di-GMPcaptura compuesto espe- combinada con espectrometría de masas 1,12,13.
Hemos diseñado recientemente una captura compuesto c-di-GMP novela trivalente (CDG-CC, la Figura 1) 1. Este andamio química se compone de: 1) un resto de c-di-GMP utilizado como cebo para capturar c-di-GMP proteínas de unión, 2) un grupo reactivo fotoactivable-UV utiliza para reticular el CDG-CC a las proteínas unidas y 3) una biotina para aislar las proteínas capturadas usando perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. El CDG-CC se puede utilizar para capturar directa y específicamente efectores de c-di-GMP a partir de una mezcla compleja de macromoléculas como lisados celulares. Compuesto de captura basada y han sido previamente informado enfoques químicos proteómica basadas ser aplicable a una amplia gama de organismos, por ejemplo, Caulobacter crescentus, Salmonella enterica serovar typhimurium y P. aeruginosa 1,14.
En este trabajo metodológico,proporcionamos una descripción en profundidad del procedimiento CCMS utilizando extractos de P. aeruginosa como un ejemplo. Este estudio establece CCMS como una herramienta poderosa y versátil para identificar bioquímicamente nuevos componentes que participan en la señalización de pequeña molécula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Especial cuidado se debe tomar en varias etapas del protocolo. La concentración de proteínas es un parámetro crítico con una concentración de 10 mg / ml siendo difícil de alcanzar cuando las células se cultivan bajo condiciones de crecimiento específicas (por ejemplo biofilms o pequeñas variantes de colonias). Por lo tanto, la resuspensión de pellets se debe realizar en un bajo volumen de tampón de lisis. Las concentraciones de proteína se pueden reducir a 8 mg / ml. En comparación con el método p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.
Materials
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
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