न्युट्रोफिल आसंजन quantitating की विधि बताई गई है. यह विधि एक रक्त वाहिका में आई है कि इसी तरह एक गतिशील प्रवाह वातावरण बनाता है. यह अनुमति देता है शुद्ध आसंजन अणु (ligand) या सरासर तनाव के साथ vivo में पर्यावरण के लिए इसी तरह के एक प्रसंग में endothelial सेल सब्सट्रेट (HUVEC) में भी न्युट्रोफिल आसंजन की जांच.
Endothelial कोशिकाओं को न्युट्रोफिल फर्म आसंजन स्वास्थ्य और बीमारी दोनों में सूजन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. न्युट्रोफिल फर्म आसंजन की प्रक्रिया β 2 integrin परिवार के सदस्यों और ICAM परिवार के अपने जवाबी रिसेप्टर्स सहित कई विभिन्न आसंजन अणुओं शामिल है. हाल ही में, दोनों में स्वाभाविक रूप से होने वाली आनुवंशिक वेरिएंट 2 integrins β और आईसीएएमएस autoimmune रोग के साथ जुड़े होने की सूचना है. इस प्रकार, इन आसंजन अणुओं की बदलती allelic रूपों के साथ व्यक्तियों से neutrophils की मात्रात्मक चिपकने क्षमता autoimmunity के विकास अंतर्निहित तंत्र के संबंध में अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रवाह चैम्बर सिस्टम में आसंजन पढ़ाई vivo में रक्त वाहिका वातावरण में मनाया समान द्रव कतरनी तनाव के साथ एक वातावरण बना सकते हैं. यहाँ, हम मानव परिधीय रक्त न्युट्रोफिल की मात्रात्मक चिपकने वाला गुणों का अध्ययन करने के लिए एक प्रवाह चैम्बर परख प्रणाली का उपयोग कर एक विधि प्रस्तुतमानव नाल की शिरा endothelial सेल (HUVEC) को और शुद्ध ligand substrates के लिए. इस विधि के साथ, आसंजन रिसेप्टर्स में अलग allelic वेरिएंट के साथ दाताओं से न्युट्रोफिल चिपकने वाला क्षमताओं का आकलन किया और तुलना की जा सकती. यह विधि भी अन्य प्राथमिक प्रकार की कोशिकाओं या सेल लाइनों के आसंजन का आकलन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
दोनों β 2 integrins में और ICAM ligands में आनुवंशिक वेरिएंट अब autoimmune रोग 1,2 के विकास के साथ जुड़े होने के लिए पहचाने जाते हैं. इन वेरिएंट के साथ व्यक्तियों से ली गई कोशिकाओं में इन वेरिएंट के कार्यात्मक परिणाम के निर्धारण इन वेरिएंट autoimmune रोग रोगजनन में योगदान के बारे में हमारी समझ के लिए आवश्यक है. इस तरह कार्यात्मक अध्ययन स्वाभाविक रूप से होने वाली आनुवंशिक वेरिएंट स्वास्थ्य और बीमारी दोनों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को आकार तंत्र है जिसके द्वारा के निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं. SLE की विशिष्ट उदाहरण में, हम अब उस ITGAM (CD11b) में वेरिएंट पता है और इसके ligand, ICAM-1, दृढ़ता रोग 1,2 के विकास के साथ सहयोगी. Neutrophils भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण होते हैं, क्योंकि न्युट्रोफिल आसंजन की मात्रात्मक अध्ययन ITGAM / ICAM में आनुवंशिक वेरिएंट सूजन को बदलने में कैसे यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है.
Neutropकोशिकाओं (ईसी) endothelial को फर्म आसंजन एचआइएल एक उच्च विनियमित प्रक्रिया है और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 3,4 में एक आवश्यक भूमिका निभाता है. न्युट्रोफिल की फर्म आसंजन चुनाव आयोग पर प्रारंभिक न्युट्रोफिल रोलिंग और कब्जा के बाद और अंततः vivo में स्थानांतरगमन में परिणाम कर सकते हैं. इन प्रक्रियाओं ICAM-1 सहित आसंजन अणुओं के कई अलग अलग प्रकार, ICAM-2, पी selectin, ई selectin endothelial कोशिकाओं पर और न्युट्रोफिल 5-9 पर 2 integrins β शामिल है. इस प्रकार, आसंजन अणुओं की विभिन्न allelic वेरिएंट के साथ दाताओं से न्युट्रोफिल आसंजन की सावधान मात्रा का ठहराव इन आनुवंशिक वेरिएंट के कार्यात्मक और रोग परिणामों को समझने के लिए महत्वपूर्ण होगा.
एक प्रवाह चैम्बर की प्रयोगात्मक उपयोग विवो 10-12 में रक्त वाहिका वातावरण में मनाया समान द्रव कतरनी तनाव के साथ इन विट्रो वातावरण बना सकते हैं. दरअसल, एक प्रवाह चैम्बर परख मानव umbili के साथ मिलकरसीएएल शिरा endothelial सेल (HUVEC) एक रक्त वाहिका के vivo पर्यावरण नकल कर सकते हैं. इस विधि का प्रयोग, एक endothelial सेल की ओर समग्र सेलुलर चिपकने वाला गुणों का अध्ययन कर सकते हैं. इसके अलावा, प्रवाह चैम्बर की अत्यधिक नियंत्रित वातावरण भी सेल का आकलन इस तरह ICAM-1 विशिष्ट रिसेप्टर ligand बातचीत के अध्ययन की सुविधा के रूप में शुद्ध आसंजन ligands के लिए बाध्य करने की अनुमति देता है.
हम यहाँ HUVEC को और शुद्ध ligand substrates के लिए मानव परिधीय रक्त neutrophils की चिपकने वाला गुणों का अध्ययन करने के लिए एक प्रवाह चैम्बर आसंजन परख प्रणाली का उपयोग एक तरीका मौजूद है. विभिन्न आसंजन अणु allelic वेरिएंट व्यक्त दाताओं से कोशिकाओं के साथ इस पद्धति का उपयोग करके हमें इन आनुवंशिक वेरिएंट मानव न्युट्रोफिल फर्म आसंजन बदल सकते हैं आकलन कैसे कर सकते हैं.
इस प्रोटोकॉल सरासर तनाव परिस्थितियों में न्युट्रोफिल आसंजन की सावधान मात्रा का ठहराव के लिए न्यूनतम सक्रिय neutrophils की जुदाई और अलगाव गाइड. न्युट्रोफिल आसंजन सूजन में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है. इस प्रक्रिया में कई अणुओं में आनुवंशिक वेरिएंट autoimmune रोग 1,2 के विकास की संभावना अधिक होती है का प्रदर्शन किया गया है, क्योंकि मात्रात्मक मानव न्युट्रोफिल फर्म आसंजन आकलन करने में सक्षम एक परख प्रणाली की आवश्यकता है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि सरासर तनाव के तहत एक नियंत्रित में इन विट्रो वातावरण में neutrophils की फर्म चिपकने की क्षमता का सावधान और मात्रात्मक निर्धारण के लिए अनुमति देता है. इस विधि इस प्रकार genotyped व्यक्तियों के बीच मात्रात्मक न्युट्रोफिल आसंजन की प्रत्यक्ष तुलना आसंजन अणुओं 14 में आनुवंशिक परिवर्तन के महत्व को निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है.
इस विधि में कई कदम उठाए achiev को सावधानी से विचार करने की योग्यताई अत्यधिक मात्रात्मक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने का परिणाम है. HUVEC तैयार करने में, यह प्रवाह चैम्बर में उन्हें प्रयोग करने से पहले 100% सेल संगम पाने के लिए महत्वपूर्ण है. शुद्ध ligand के साथ लेपित सतहों का उपयोग कर के लिए, सब्सट्रेट कोटिंग क्षेत्र ligand denaturing से बचने के लिए बाहर सूखे की अनुमति दी जा कभी नहीं करना चाहिए. इसके अलावा, मानव neutrophils की तैयारी प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. खून से neutrophils अलग में महत्वपूर्ण मुद्दों धीरे अलगाव और प्रयोग, सक्रियण से बचने के लिए vortexing कम से कम (खून कमरे के तापमान पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए बर्फ और centrifugation कदम पर संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए अर्थात्) कमरे के तापमान पर कोशिकाओं रखने और पूरा करके निपटने शामिल संभव के रूप में समय की कम से कम राशि में. भी इन assays 17,18 के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि अतिरिक्त न्युट्रोफिल अलगाव तरीके हैं.
हौसले से अलग मानव neutrophils का उपयोग कर एक व्यावहारिक दृष्टिकोण, आसंजन assays से प्रतिभागी फ़स्त खोलना के बाद 3-6 घंटे के भीतर शुरू किया जाना चाहिए. Neutrophils से निपटने के लिए अत्यंत संवेदनशील होते हैं, रक्त ड्रा और उपयोग के बीच लंबे समय तक बार परख परिणामों को प्रभावित कर सकता है. पूर्व प्रवाह चैम्बर परख करने न्युट्रोफिल सेल एकाग्रता की सावधानी से दृढ़ संकल्प सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए भी आवश्यक है.
प्रवाह चैम्बर परख के दौरान, यह प्रवाह की गति के अनुरूप है और प्रयोग की लंबाई भर में कोई अशांति नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी से वीडियो रिकॉर्डिंग की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है. प्रवाह की गति में परिवर्तन या अशांति की उपस्थिति प्रयोग को दोहराया जा कि जरूरत होगी. प्रयोग करने के बाद, यह neutrophils clumping नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए microscopically शेष neutrophils का आकलन करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. इस बिंदु पर clumping neutrophils काफी प्रयोग के दौरान न्युट्रोफिल घनत्व को बदल सकता है, जो सक्रिय हो गए हैं कि संकेत होगा.
सामग्री "> प्रवाह चैम्बर एक क्यू = प्रवाह की दर जहां कक्ष के भीतर निकट सजातीय सरासर तनाव (τ = 6Qμ / (क) 2,, μ = गतिशील चिपचिपापन, और प्रवाह कक्ष के डब्ल्यू = चौड़ाई, ज = ऊंचाई बनाता है ) कक्ष 15 प्रवाह. हमारे अध्ययन में, हम / 2 सेमी 1.5 dynes का सरासर तनाव पैदा करता है जो न्युट्रोफिल आसंजन के लिए 350 μl / मिनट की एक प्रवाह दर का उपयोग किया था (w = 0.25 सेमी, ज = अंदर 0.01, पानी का चिपचिपापन 37 डिग्री सेल्सियस (0.007 शिष्टता)) RMPI मीडिया की चिपचिपाहट का एक सन्निकटन के रूप में इस्तेमाल किया गया था. एक विशिष्ट प्रवाह कक्ष के लिए, एक अलग शारीरिक स्थितियों की नकल करने की सरासर तनाव के विभिन्न स्तरों को प्राप्त करने के लिए प्रवाह दर को बदल सकते हैं. विशिष्ट शारीरिक कतरनी तनाव मानव रक्त वाहिकाओं में 0.5-5.0 dynes / सेमी 13,16 के बीच पर्वतमाला. अन्य रक्त वाहिकाओं में तनाव कतरनी कर सकते हैं और अन्य जानवरों तालिका 1 113,16,19 20 में सूचीबद्ध किया गया.हमारे विधि मानव neutrophi के आसंजन के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया हैरास, इस विधि neutrophils तक सीमित नहीं है और आसानी से आसंजन या सरल संशोधनों के साथ अन्य प्रकार की कोशिकाओं के रोलिंग के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, इस पद्धति में substrates के विभिन्न प्रयोजनों के लिए बदला जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल विभिन्न अध्ययनों के लिए आसानी से अनुकूलनीय है, कुछ सीमाएं हैं. यहां कार्यान्वित के रूप में प्रोटोकॉल के विश्लेषण के लिए प्राथमिक कोशिकाओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता है. इस छोटे जानवरों से प्राथमिक कोशिकाओं का विश्लेषण छीन सकता है. इसके अतिरिक्त, एक उपलब्ध / सक्रिय रचना में शुद्ध आसंजन ligands स्थिर करने की जरूरत ligands की रेंज सीमित कर सकता है. एफसी संलयन प्रोटीन का उपयोग बहुत थाली सतह पर उचित ligand रचना को प्राप्त करने की संभावना को बढ़ाता है. बहरहाल, हमारे विधि आसंजन की घटनाओं का मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण लचीलापन है. ये अध्ययन काफी हमारे आसंजन रिसेप्टर ligand जोड़े की समझ, और आनुवंशिक वेरिएंट के संभावित समारोह महत्व में वृद्धि होगीइन प्रोटीनों में, मानव रोगों के रोगजनन में.
The authors have nothing to disclose.
यह काम एक प्रकार का वृक्ष अनुसंधान संस्थान (न्यूयॉर्क, एनवाई), एनआईएच P01-AR49084, एनआईएच R21-DA026956 और एनआईएच UL1-TR00165 द्वारा प्रायोजित है. हम अपने निरंतर समर्थन के लिए डॉ. रॉबर्ट पी. किम्बर्ली धन्यवाद.
Table of Reagents Materials | |||
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
2X Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
35mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
75cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35mm dishes |
fMLP | Sigma | 47729 | |
Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy ficoll |
HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
ICAM-1 | R&D systems | 720-IC | Fc chimera |
Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light ficoll |
Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-Glutamine and Phenol Red |
Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
P-Selectin | R&D systems | 137-PS | Fc chimera |
Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
TNF-a | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 |