Способ количественного нейтрофилов адгезию сообщается. Этот метод создает динамическую среду потока аналогичной той, что встречается в кровеносном сосуде. Это позволяет исследование нейтрофилов адгезии к или очищенных молекул адгезии (лиганда) или эндотелиальных клеток подложки (HUVEC) в контексте подобной окружающей среды в естественных условиях с чистой стресса.
Нейтрофилов фирма адгезия к эндотелиальных клеток играет важную роль в воспалении в обоих здоровья и болезни. Процесс нейтрофилов фирмы адгезии включает в себя множество различных молекул адгезии, включая членов семейства интегринов β 2 и их контр-рецепторов семейства ICAM. В последнее время природные генетические варианты в обоих β 2 интегрины и ICAMs, как сообщается, связана с аутоиммунным заболеванием. Таким образом, количественный клей емкость нейтрофилов от физических лиц с различными аллельных форм этих молекул адгезии важно изучить в отношении механизмов, лежащих в основе развития аутоиммунных. Адгезии исследования в системах проточной камеры может создать среду с напряжением сдвига жидкости аналогичной той, которая наблюдается в среде кровеносного сосуда в естественных условиях. Здесь мы представляем метод с использованием системы Проточная камера анализа для изучения количественных адгезионные свойства человеческой периферической крови нейтрофиловс до пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC) и очищенных лиганд субстратов. С помощью этого метода нейтрофилов клейкие мощности от доноров с различным аллельных вариантов в рецепторов адгезии могут быть оценены и сравнены. Этот способ также может быть модифицирован с целью оценки адгезии других типов первичных клеток или клеточных линий.
Генетические варианты в обоих β 2 интегринов и в ICAM лигандов в настоящее время признается, связаны с развитием аутоиммунных 1,2 заболевания. Определение функциональных последствий этих вариантов в клетках, полученных от физических лиц с этих вариантов необходимо для нашего понимания того, как эти варианты способствовать патогенезе аутоиммунного заболевания. Такие функциональные исследования позволяют для определения механизмов, посредством которых природные генетические варианты формируют иммунную реакцию как в норме и при патологии. В конкретном примере, СКВ, мы теперь знаем, что варианты в ITGAM (CD11b) и его лиганд, ICAM-1, сильно ассоциируется с развитием болезни 1,2. Потому что нейтрофилы имеют решающее значение в воспалительных реакциях, количественное исследование нейтрофилов адгезии может обеспечить механистические понимание того, как генетические варианты в ITGAM / ICAM изменить воспаление.
NeutropХиль твердую адгезии эндотелиальных клеток (ЭК) является весьма регулируемым процессом и играет существенную роль в воспалительных реакциях 3,4. Фирма адгезия нейтрофилов следует первоначальный нейтрофилов прокатки и захват на ЕС и в конечном итоге может привести к переселению в естественных условиях. Эти процессы включают много различных видов молекул адгезии, включая ICAM-1, ICAM-2, Р-селектин, E-селектин на эндотелиальных клетках и β 2 интегрины на нейтрофилов 5-9. Таким образом, тщательное количественное нейтрофилов адгезии от доноров с различными аллельных вариантов молекул адгезии будет важно понять, функциональные и патологические последствия этих генетических вариантов.
Экспериментальное использование проточной камеры может создать среду, в пробирке с напряжением сдвига жидкости аналогичной той, которая наблюдается в среде кровеносного сосуда в естественных условиях 10-12. Действительно, камера поток анализа в сочетании с человеческой umbiliкал вены эндотелиальных клеток (HUVEC) могут имитировать окружающую среду в естественных условиях кровеносного сосуда. Используя этот метод, можно изучать общие клеточные адгезионные свойства по отношению к эндотелиальных клеток. Кроме того, весьма контролируемой среде проточной камеры также позволяет оценить клетки связывания с очищенными адгезии лигандов, таких как ICAM-1, чтобы облегчить изучение конкретных рецептор-лиганд.
Мы приведем здесь метод, использующий систему Пробирной палаты поток адгезии для изучения адгезионные свойства нейтрофилов периферической крови человека, HUVEC и очищенных лигандов субстратов. Используя этот метод с клетками доноров, выражающих различные варианты аллельных адгезии позволяет оценить, как эти генетические варианты могут изменить человека нейтрофилов твердую адгезию.
Этот протокол направляет разделение и изоляцию минимально активированных нейтрофилов для тщательного количественного нейтрофилов адгезии под отвесными условиях стресса. Нейтрофилов адгезия критический процесс в воспалении. Поскольку генетические варианты в нескольких молекул в этом процессе были продемонстрированы предрасполагают к развитию аутоиммунного заболевания 1,2, анализ система способна количественно оценить нейтрофилов человека твердое сцепление не требуется. Способ, описанный в данном протоколе позволяет тщательного и количественного определения твердой клейкой потенциала нейтрофилов в контролируемой среде в пробирке под чистой стресса. Этот метод позволяет, таким образом прямое сравнение количественного нейтрофилов адгезии между генотипированных лиц, чтобы определить важность генетической изменчивости в адгезионных молекул 14.
Несколько шагов в этом методе заслуживает отдельного рассмотрения в резуэ высоко количественные и воспроизводимые результаты. При подготовке HUVEC, крайне важно для достижения 100% слияния клеток, прежде чем использовать их в проточной камеры. Для использования поверхности, покрытые очищенным лиганда, площадь подложки покрытие никогда не должны высыхать, чтобы избежать денатурации лиганд. Кроме того, подготовка нейтрофилов человека имеет решающее значение для успеха эксперимента. Ключевые вопросы в изоляции нейтрофилы из крови включают мягко обработки за счет минимизации вихревание, чтобы избежать активации, сохраняя клетки при комнатной температуре (то есть кровь не следует хранить на льду и центрифугирования шаги должны быть выполнены при комнатной температуре) и выполняя выделение и эксперимент в наименьшее количество времени, как это возможно. Существуют дополнительные методы изоляции нейтрофилов, которые также могут быть использованы для подготовки клеток для этих анализов 17,18.
С практической точки зрения, адгезии анализов с помощью Свежевыделенные нейтрофилов человека должна быть начата в течение 3-6 ч после участника кровопускания. Как нейтрофилы чрезвычайно чувствительны к внешнему воздействию, продолжительное время между взятия крови и использования может повлиять опробования результатов. Тщательное определение концентрации клеток нейтрофилов до проточную камеру анализа также необходимо достичь точных и воспроизводимых результатов.
В ходе анализа проточной камеры, важно контролировать видеозапись тщательно, чтобы гарантировать, что скорость потока последовательной и нет турбулентность по всей длине эксперимента. Изменения в скоростях потока или наличие турбулентности потребует, что эксперимент повторить. После эксперимента, важно также, чтобы оценить оставшиеся нейтрофилы микроскопически чтобы гарантировать, что нейтрофилы не слипания. Слипания в этот момент будет означать, что нейтрофилы стали активированный которые могли бы существенно изменить плотность нейтрофилов в ходе эксперимента.
Содержание "> Проточная камера создает около однородной чистой стресс внутри камеры (τ = 6Qμ / (WH 2), где Q = расход, μ = динамическая вязкость и Ш = ширина камеры потока, Н = высота камеру 15 потока). В наших исследованиях мы использовали скорость потока 350 мкл / мин для нейтрофилов присоединения, который создает истинное напряжение 1,5 дин / см 2 (W = 0,25 см, Н = 0,01 дюйма, вязкость воды при 37 ° С (0,007 пуаз) был использован в качестве приближения вязкости RMPI носителя). Для конкретного проточной камеры, можно изменять скорость потока для достижения различных уровней чистого стресса, чтобы имитировать различные физиологические условия. Типичное напряжение сдвига физиологический в кровеносных сосудах человека может диапазоны между 0,5-5,0 дин / см 13,16. напряжение сдвига в других кровеносных сосудов и других животных были представлены в таблице 1 113,16,19 20.В то время как наш метод была сосредоточена на изучении адгезии человека neutrophiлс, этот способ не ограничивается нейтрофилов и может быть легко применен к адгезии или прокатки исследований других типов клеток с простых модификаций. Кроме того, подложки в этом методе может быть изменен для различных целей.
Хотя этот протокол легко адаптируется к различным исследованиям, есть некоторые ограничения. Протокол, как реализуется здесь требуется большое количество первичных клеток для анализа. Это может препятствовать анализ первичных клеток из мелких животных. Кроме того, необходимость иммобилизации очищенных адгезионные лиганды в активном / доступны конформации может ограничить диапазон лигандов. Использование Fc-слитых белков значительно повышает шансы на достижение надлежащего лиганда конформацию на поверхности пластины. Тем не менее, наш метод имеет значительную гибкость, чтобы позволить количественный анализ адгезии событий. Эти исследования значительно повысит наше понимание рецептор-лиганд пар адгезии и потенциальную функцию важность генетических вариантовв этих белков, в патогенезе заболеваний человека.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа проводится при финансовой поддержке Lupus исследовательского института (Нью-Йорк, Нью-Йорк), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 и NIH UL1-TR00165. Мы благодарим доктора Роберта П. Кимберли за его постоянную поддержку.
Table of Reagents Materials | |||
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
2X Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
35mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
75cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35mm dishes |
fMLP | Sigma | 47729 | |
Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy ficoll |
HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
ICAM-1 | R&D systems | 720-IC | Fc chimera |
Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light ficoll |
Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-Glutamine and Phenol Red |
Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
P-Selectin | R&D systems | 137-PS | Fc chimera |
Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
TNF-a | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 |