Nötrofil yapışmasını ölçülmesi için bir yöntem rapor edilir. Bu yöntem, bir kan damarı karşılaşılan edilene benzer bir dinamik akış ortam oluşturur. Bu izin saflaştırılmış yapışma molekülleri (ligand) veya saf stres ile in vivo ortama benzer bir bağlamda endotel hücre alt-tabaka (HUVEC) ya da, nötrofil adhezyonunun araştırılması.
Endotel hücrelerine nötrofil sağlam yapışma sağlık ve hastalık hem enflamasyonda önemli bir rol oynar. Nötrofil sağlam yapışma süreci β 2 integrin ailesinin üyeleri ve ICAM ailesinin kontra reseptörleri de dahil olmak üzere birçok farklı yapışma moleküllerini içerir. Son zamanlarda, hem de doğal olarak oluşan genetik varyantları 2 integrinler β ICAMlann ve oto-bağışıklık hastalığı ile ilişkili olduğu bildirilmektedir. Bu nedenle, bu yapışma moleküllerinin değişik alelik formları ile bireylerden alınan nötrofil kantitatif yapışkan otoimmün kapasite gelişimi altında yatan mekanizmaları ile ilgili olarak çalışma için önemlidir. Akış bölme sistemlerinde Yapışma çalışmalar in vivo olarak kan damarı ortamda gözlenene benzer akışkan kesme stresi ile bir ortam oluşturabilir. Burada, insan periferal kan nötrofil kantitatif yapışkan özelliklerini incelemek için bir akış odası deney sistemi kullanılarak bir yöntem mevcuts insan göbek damarı endotel hücre (HUVEC) ve saflaştırılmış ligand substratlara. Bu yöntem ile, yapışma reseptörlerinin farklı alelik varyantları ile vericilerden, nötrofil yapışkan kapasitelerinin değerlendirilmesi ve karşılaştırılabilir. Bu yöntem, aynı zamanda birincil hücre tipleri veya hücre hatları yapışmasını değerlendirmek için modifiye edilebilir.
Her iki β 2 integrins ve ICAM ligandlardaki genetik varyantlar şimdi otoimmün hastalık 1,2 gelişimi ile ilişkili olduğu kabul edilmektedir. Bu varyantların olan bireylerden türetilen hücrelerde, bu varyantların işlevsel sonuçları belirlenmesi, bu varyantlar, otoimmün hastalık patojenezine katkıda kadar daha iyi anlaşılması için gereklidir. Bu gibi fonksiyonel çalışmalar, doğal olarak oluşan genetik varyantları sağlık ve hastalık hem de bağışıklık tepkisini şekillendiren hangi mekanizmaların belirlenmesine izin verir. SLE Spesifik bir örnek olarak, şimdi bu ITGAM (CD11b) varyantları bilmek ve ligand, ICAM-1, 1,2 güçlü bir hastalığın gelişimi ile ilişkilendirir. Nötrofiller inflamatuvar yanıtları kritik olduğundan, nötrofil yapışma kantitatif çalışma ITGAM / ICAM genetik varyantlar iltihabı nasıl değiştirdiğini içine mekanistik anlayışlar sağlayabilir.
Neutrophücreleri (EC) endotelial sıkı bir yapışmaya hIL oldukça düzenli bir süreçtir ve enflamatuar yanıtları 3,4 in önemli bir rol oynar. Nötrofil sağlam yapışma EC ilk nötrofil haddeleme ve ele geçirmesi ve sonuçta in vivo göçüne neden olabilir. Bu işlemler, ICAM-1 de dahil olmak üzere yapışma moleküllerinin çok farklı, ICAM-2, P-selektin, E-selektin, endotel hücrelerinde ve nötrofil 5-9 2 integrinler β içerir. Bu nedenle, yapışma moleküllerinin farklı alelik varyantları olan donörlerden nötrofil yapışmasının dikkatli bir miktar, bu genetik varyantları fonksiyonel ve patolojik sonuçlara yol anlaşılması için önemli olacaktır.
Bir akış odasının Deneysel in vivo kullanımı 10-12 kan damarı ortamda gözlenene benzer akışkan kesme stresi ile in vitro bir ortam oluşturabilir. Gerçekten de, bir akım odası deney insan umbili ile birleştiğindecal damarı endotel hücre (HUVEC) bir kan damarının in vivo ortamı taklit edebilir. Bu yöntemi kullanarak, bir endotel hücreye doğru genel hücresel yapıştırıcı özelliklerini incelemek olabilir. Buna ek olarak, akış odacığının son derece kontrollü bir ortam da hücrenin değerlendirilmesi örneğin ICAM-1 spesifik reseptör-ligand etkileşiminin çalışma kolaylaştıracak şekilde saflaştırılmış yapışma ligandlarına bağlanmasını sağlar.
Burada HUVEC ve saflaştırılmış ligand alt-tabakalar için, insan periferik kan nötrofillerinin yapışkan özelliklerini incelemek için bir akış odası yapışma deneyi sistemi kullanan bir yöntem sunuyoruz. Farklı yapışma molekülü alelik varyantlarını eksprese eden vericiden hücreler ile bu yöntemi kullanarak, bize bu genetik varyant insan nötrofil sıkı bir yapışmaya değiştirebilir nasıl tayin edilmesine olanak sağlamaktadır.
Bu protokol, saf, gerilimli şartlar altında, nötrofil yapışmasının ölçümü için dikkatli bir minimal aktifleştirilmiş nötrofillerin ayrılmasını ve izole yönlendirir. Nötrofil yapışma inflamasyonda önemli bir işlemdir. Bu işlemde çok sayıda molekülün genetik varyantları, otoimmün hastalık 1,2 gelişmesi için temel oluşturabilir için gösterilmiştir için, nicel olarak insan nötrofil sağlam yapışmasını değerlendirmek yeteneğine sahip bir test sistemi gereklidir. Bu protokolde tarif edildiği gibi bir yöntem şeffaf stres altında kontrollü bir ortamda in vitro nötrofil firma yapışkan potansiyelinin dikkatli ve kantitatif belirlenmesi için olanak sağlar. Bu nedenle bu yöntem genotyped bireyler arasındaki nicel nötrofil yapışma direkt karşılaştırılması yapışma molekülleri 14 genetik varyasyonun önemini belirlemek için izin verir.
Bu yöntemde çeşitli adımlar achiev önemsenmesi hake yüksek kantitatif ve tekrarlanabilir sonuçlar. HUVEC hazırlanmasında, akış odası içinde kullanmadan önce% 100 hücre izdiham elde etmek için kritiktir. Saflaştırılmış ligand ile kaplanmış yüzeyler kullanmak için, alt tabaka kaplama alanı ligandı denatüre önlemek için kurumasına asla izin verilmemeli. Buna ek olarak, insan nötrofilleri hazırlanması Deneyin başarısı için çok önemlidir. Kan nötrofilleri de izole önemli hususlar yavaşça izole edilmesini ve deney, aktivasyonunu önlemek için en aza indirmek vorteks (kan, oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir buz ve santrifüj adımları saklanmamalıdır örneğin), oda sıcaklığında hücreleri tutmak ve tamamlayarak işleme dahil mümkün olduğu zaman en az miktarda. Ayrıca, bu tahliller 17,18 için hücrelerin hazırlanması için kullanılabilen ek nötrofil izolasyon yöntemleri vardır.
Taze izole edilmiş insan nötrofil kullanarak pratik bir bakış açısı, yapışma tahlilleri kaynaktan katılımcı phlebotomy sonra 3-6 saat içinde yapılması gerekir. Nötrofiller kullanım için son derece hassas olduğu, kan çizmek ve kullanımı arasında uzun süreli kez tahlil sonuçlarını etkileyebilir. Önce, akış odası tahlile nötrofil hücre konsantrasyonunun belirlenmesi dikkatli doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir.
Akış odası Deney sırasında, bu akım hızı tutarlıdır ve deney uzunluğu boyunca herhangi bir türbülans olduğundan emin olmak için dikkatle video kayıt izlemek için önemlidir. Akış hızları değişimler veya türbülans varlığı deney tekrar edilmesi gerekli olacaktır. Deneyden sonra, o nötrofil topaklanma emin olmak için mikroskobik olarak kalan nötrofiller değerlendirmek için de önemlidir. Bu noktada, topaklanma nötrofiller önemli ölçüde deney sırasında nötrofil yoğunluğu değiştirebilir ki aktif hale gelmiş olduğunu işaret eder.
içeriği "> akım odası, bir Q = akış oranı odası içinde homojen yakın dik stres (τ = 6Qμ / (WH 2), μ = dinamik viskozite ve akış odasının W = genişlik ', h = yükseklik yaratır ) haznesi 15 akar. Çalışmalarımızda olarak, / cm 2 1,5 dynes dik bir stres yaratır nötrofil yapışması için 350 ul / dk 'lık bir akış hızı, kullanılan (w = 0.25 cm, h = 0.01 inç su, viskozite 37 ° C'de (0.007 poise)) Kan numuneleri ortamın viskozitesinin bir yaklaşım olarak kullanılmıştır. özel bir akış odası için, bir başka fizyolojik koşulları taklit etmek için saf stres seviyelerinin elde edilmesi için farklı akış hızını değiştirebilir. tipik fizyolojik kesme stresi İnsan kan damarlarında 0.5-5.0 din / cm 13,16 arasında değişmektedir. diğer kan damarlarında stres Kayma ve diğer hayvanlar Tablo 1 113,16,19 20'de listelenmiştir.Bizim yöntem, insan neutrophi yapışmasının çalışmaya odaklanmış olsa dals, bu yöntem, nötrofiller ile sınırlı değildir ve kolay bir şekilde yapışması ya da basit değişikliklerle, başka hücre tipleri haddeleme çalışmalarında uygulanabilir. Ayrıca, bu yöntemde, alt-tabakalar, farklı amaçlar için değiştirilebilir.
Bu protokol, farklı çalışmalarda kolayca adapte olmasına rağmen, bazı sınırlamalar vardır. Burada uygulandığı gibi protokol analizi için, birincil hücre sayıda gerektirir. Bu küçük hayvanlardan birincil hücre analizi engelleyebilir. Buna ek olarak, uygun bir / etken konformasyonda saflaştırılmış yapışma ligandlar hareketsiz hale getirmek için ihtiyaç ligandların aralığı sınırlayabilir. Fc-füzyon proteinlerinin kullanımı büyük ölçüde plaka yüzeyi üzerinde uygun bir ligand konformasyon elde etme şansını arttırır. Bununla birlikte, bizim yöntem yapışma olayların kantitatif analiz izin önemli esnekliğe sahiptir. Bu çalışmalar büyük ölçüde yapışma reseptör-ligand çiftleri anlayış ve genetik varyantlar potansiyel fonksiyonu önemini artıracakBu protein, insan hastalıklarının patojenezinde.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Lupus Araştırma Enstitüsü (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 ve NIH UL1-TR00165 tarafından desteklenmektedir. Biz onun sürekli destek için Dr Robert P. Kimberly teşekkür ederim.
Table of Reagents Materials | |||
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
2X Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
35mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
75cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35mm dishes |
fMLP | Sigma | 47729 | |
Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy ficoll |
HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
ICAM-1 | R&D systems | 720-IC | Fc chimera |
Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light ficoll |
Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-Glutamine and Phenol Red |
Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
P-Selectin | R&D systems | 137-PS | Fc chimera |
Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
TNF-a | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 |