En metod för kvantifiering av neutrofil adhesion rapporteras. Denna metod skapar ett dynamiskt flöde miljö som liknar den som påträffas i ett blodkärl. Det möjliggör undersökningen av neutrofil adhesion till antingen renat adhesionsmolekyler (ligand) eller endotelcell substrat (HUVEC) i ett sammanhang som liknar miljön in vivo med ren stress.
Neutrofil fast adhesion till endotelceller spelar en avgörande roll i inflammation i både hälsa och sjukdom. Processen för neutrofila fast adhesion innebär många olika adhesionsmolekyler, däribland medlemmar av β 2 grinfamiljen och deras mot-receptorer av ICAM familjen. Nyligen, naturligt förekommande genetiska varianter i både β 2-integriner och ICAM har rapporterats i samband med autoimmuna sjukdomar. Således är det viktigt att studera i förhållande till mekanismerna bakom utvecklingen av autoimmunitet den kvantitativa vidhäftningsförmåga av neutrofiler från individer med olika alleliska former av dessa adhesionsmolekyler. Vidhäftnings studier i flödeskammarsystem kan skapa en miljö med vätska skjuvspänningen liknande den som observerades i blodkärlet miljön in vivo. Här presenterar vi en metod som använder en flödeskammare analyssystem för att studera de kvantitativa vidhäftningsförmåga av humant perifert blod neutrofilas för människors navelsträng ven endotelceller (HUVEC) och renade ligand substrat. Med denna metod kan de neutrofila självhäftande kapacitet från donatorer med olika allelvarianter i adhesionsreceptorer bedömas och jämföras. Denna metod kan också modifieras för att utvärdera vidhäftningen av andra typer primär cell eller cell-linjer.
Genetiska varianter i både β 2-integriner och i ICAM-ligander redovisas nu att förknippas med utvecklingen av autoimmuna sjukdomar 1,2. Fastställandet av de funktionella konsekvenserna av dessa varianter i celler från individer med dessa varianter är nödvändig för vår förståelse av hur dessa varianter bidrar till autoimmun sjukdom patogenes. Sådana funktionella studier tillåter bestämning av de mekanismer som naturligt förekommande genetiska varianter forma immunsvar i både hälsa och sjukdom. I det specifika exemplet på SLE, vi vet nu att varianter i ITGAM (CD11b) och dess ligand, ICAM-1, starkt förknippar med utveckling av sjukdom 1,2. Eftersom neutrofiler är kritiska i inflammatoriska svar, kan den kvantitativa studien av neutrofiladhesion ger mekanistiska insikter i hur genetiska varianter i ITGAM / ICAM förändrar inflammation.
NeutropHil fast adhesion till endotelceller (EC) är en starkt reglerad process och spelar en viktig roll i inflammatoriska svar 3,4. Företaget vidhäftning av neutrofila följer initiala neutrofila rullande och fånga på EG och i slutändan kan leda till att transmigration in vivo. Dessa processer involverar många olika typer av adhesionsmolekyler, inklusive lCAM-1, ICAM-2, P-selektin, E-selektin på endotelceller och β 2-integriner på neutrofil 5-9. Således kommer noggrann kvantifiering av neutrofiladhesion från donatorer med olika alleliska varianter av adhesionsmolekyler vara viktigt att förstå de funktionella och patologiska konsekvenserna av dessa genetiska varianter.
Experimentell användning av en flödeskammare kan skapa en in vitro-miljö med fluidum skjuvspänning liknande den som observerats i blodkärlet miljö in vivo 10-12. När man i en flödeskammare analys kopplad med humant umbilical vein endothelial cell (HUVEC) kan härma miljön av ett blodkärl in vivo. Med denna metod kan man studera de totala cellulära vidhäftningsförmåga mot endotelceller. Dessutom medger den starkt kontrollerad miljö i flödeskammaren också bedömning av cellbindning till renade vidhäftningsligander, såsom ICAM-1 för att underlätta studier av specifika receptor-ligand-interaktioner.
Vi presenterar här en metod som utnyttjar en flödeskammare vidhäftningsanalyssystem för att studera de vidhäftande egenskaperna hos humana perifera blod neutrofiler till HUVEC och renade ligand substrat. Med den här metoden med celler från givare som uttrycker olika adhesionsmolekyl allelvarianter tillåter oss att bedöma hur dessa genetiska varianter kan förändra människans neutrofil fast adhesion.
Detta protokoll styr separation och isolering av minimalt aktiverade neutrofiler för noggrann kvantifiering av neutrofiladhesion i ren stress villkor. Neutrofiladhesion är en kritisk process i inflammation. Eftersom genetiska varianter i flera molekyler i denna process har visat sig predisponera för utvecklingen av autoimmuna sjukdomar 1,2, är ett analyssystem som kan kvantitativt bedöma human neutrofil fast vidhäftning krävs. Den metod som beskrivs i detta protokoll möjliggör noggrann och kvantitativ bestämning av fast vidhäftande potential neutrofiler i en kontrollerad miljö in vitro under ren stress. Denna metod gör därmed direkt jämförelse av kvantitativa neutrofiladhesion mellan genotypade individer för att avgöra betydelsen av genetisk variation i adhesionsmolekyler 14.
Flera steg i denna metod förtjänar noggrant övervägande för att achieve mycket kvantitativa och reproducerbara resultat. I HUVEC förberedelser, är det viktigt att uppnå 100% cellsammanflödet innan du använder dem i flödet kammaren. För att använda ytor belagda med renad ligand, bör substratet behandlade ytan aldrig tillåtas att torka ut för att undvika denaturering av liganden. Dessutom är framställningen av humana neutrofiler kritisk för framgången för experimentet. Viktiga frågor i isolera neutrofiler från blodet inkluderar försiktigt hantering genom att minimera vortex för att undvika aktivering, hålla cellerna vid rumstemperatur (dvs. blodet inte bör förvaras på is och centrifugeringssteg bör utföras vid rumstemperatur) och fylla i isolering och experimentet i den minsta mängden tid som möjligt. Det finns ytterligare neutrofilt isoleringsmetoder som också kan användas för att framställa celler för dessa analyser 17,18.
Ur ett praktiskt perspektiv, vidhäftningsanalyser med användning av nyligen isolerade humana neutrofiler bör initieras inom 3-6 timmar efter deltagare flebotomi. Eftersom neutrofiler är extremt känsliga för hantering, kunde längre tider mellan bloddragningen och användning påverkar analysresultaten. Noggrann bestämning av neutrofil cellkoncentration innan flödet kammare analysen är också nödvändig för att erhålla korrekta och reproducerbara resultat.
Under flödeskammaren analys är det viktigt att övervaka videoinspelning noga för att säkerställa att flödeshastigheten är jämn och det finns ingen turbulens genom hela längden av experimentet. Förändringar i flödeshastigheter eller förekomsten av turbulens skulle kräva att experimentet upprepas. Efter experimentet, är det också viktigt att utvärdera de återstående neutrofiler mikroskopiskt för att säkerställa att neutrofilerna inte klibbar. Hopklumpning på denna punkt skulle tyda på att neutrofilerna har blivit aktiverade som väsentligt skulle kunna förändra neutrofila tätheten under experimentet.
innehåll "> Flödeskammaren skapar en nära homogent ren stressen i kammaren (τ = 6Qμ / (wh 2), där Q = flöde, μ = dynamisk viskositet, och w = bredden av flödet kammaren, h = höjd flödeskammaren 15). I våra studier har vi använt en flödeshastighet av 350 | il / min för neutrofil adhesion, vilket skapar en ren stressen av 1,5 dyn / cm 2 (w = 0,25 cm, H = 0,01 tum, viskositeten hos vatten vid 37 ° C (0,007 pois) användes som en approximation av viskositeten hos RMPI media). För en specifik flödeskammare, kan en förändring av flödeshastigheten för att uppnå olika nivåer av ren spänning för att efterlikna olika fysiologiska betingelser. Typiska fysiologisk skjuvspänning i mänskliga blodkärl kan varierar mellan 0,5 till 5,0 dyn / cm 13,16. Skjuvspänning i andra blodkärl och andra djur i tabell 1 113,16,19 20.Även om vår metod har fokuserat på studier av vidhäftningen av humana neutrophils är denna metod inte begränsad till neutrofiler och kan lätt appliceras på vidhäftning eller rullande studier av andra celltyper med enkla modifikationer. Dessutom kan substraten i denna metod ändras för olika ändamål.
Även om detta protokoll är lätt att anpassa till olika studier, finns det vissa begränsningar. Protokollet som genomförts här kräver många primära celler för analys. Detta kan hindra analys av primära celler från smådjur. Dessutom kan behovet av att immobilisera renade vidhäftningsliganderna i en aktiv / tillgängliga konforma begränsa intervallet för ligander. Användningen av Fc-fusionsproteiner ökar i hög grad möjligheterna att uppnå ordentlig ligand konforma på plåtytan. Icke desto mindre har vår metod betydande flexibilitet för att möjliggöra kvantitativ analys av vidhäftningshändelser. Dessa studier kommer att betydligt öka vår förståelse av vidhäftnings receptor-ligand-par, och den potentiella funktionen vikten av genetiska varianteri dessa proteiner, i patogenesen av sjukdomar hos människor.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet sponsras av Lupus Research Institute (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 och NIH UL1-TR00165. Vi tackar Dr Robert P. Kimberly för hans fortsatta stöd.
Table of Reagents Materials | |||
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
2X Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
35mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
75cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35mm dishes |
fMLP | Sigma | 47729 | |
Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy ficoll |
HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
ICAM-1 | R&D systems | 720-IC | Fc chimera |
Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light ficoll |
Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-Glutamine and Phenol Red |
Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
P-Selectin | R&D systems | 137-PS | Fc chimera |
Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
TNF-a | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 |