Summary
血管新生は、正常組織工学におけるアプローチの鍵となります。したがって、信頼性の高い技術は、組織構築物における血管網の発達を評価するために必要とされる。ここでは、可視化し、 生体内で血管新生を定量化するためのシンプルで費用対効果の高い方法を提示する。
Abstract
不十分な血管新生は、組織工学構築物の臨床的成功を制限する主な要因の一つであると考えられている。血管新生を改善することを目指す新たな戦略を評価するために、信頼できる方法は、可視バイオ人工足場への新しい血管の内殖を行い、結果を定量する必要がある。過去数年にわたり、私たちのグループは、透視によって血管の直接可視化を可能にし、デジタルセグメンテーションを通じて定量化する可能性を提供する、完全な皮膚欠損モデルを導入しています。このモデルでは、人は外科的にマウスの背中に完全な皮膚欠損を作成し、テスト材料に置き換えます。目的の分子または細胞は、それらの潜在的効果を研究するために、そのような材料に組み込むことができる。自分の選択した観測時間の後、材料は、評価のために外植される。両側性の創傷は、目の内部の比較を行う可能性を提供するでの学習に必要な動物の数を減少させるだけでなく、個人間で成果物を最小限に抑えます。他のアプローチと比較して、私たちの方法は、簡単で信頼性が高く、費用対効果の分析を提供しています。私たちは、別の生体材料、バイオ活性化のアプローチの血管新生をテストする際に、高解像度のスクリーニングを行うためのルーチンツールとしてこのモデルを実装している。
Introduction
ここ数十年では、組織工学は、体自身の細胞1を組織欠損に代わる新たな治療オプションを開いた。組織再生の生理学的プロセスをサポートするために、足場を創傷床からの細胞が成長し、欠陥2,3を復元することができるシナリオを提供し、生分解性構造として設計されている。
不十分な血管新生は、バイオ人工足場4の臨床的ブレークスルーをバック保持している主な障害であると考えられている。細胞の内方成長で、栄養と酸素が増加し、材料の血管新生の需要が不可欠となる。不十分な血管新生または遅延は、したがって、組織工学製品5の中心壊死につながることができます。また、血管が免疫コンピテント細胞を提供し、再生領域における代謝残留物を除去する。高い感染率と低い再生は唯一である足場6,7の血管新生を増加させることによって回避することを目的としている組織工学において観察不十分な血液灌流の結果の一部。
生体材料自体と足場の微細構造の重要な役割に血管新生のフォーカスを改善することを目指していくつかの戦略。 8,9を復元することにより(再)、 再生に修理から治癒過程をシフトに最も近い生理学的特性を有する組織を生成する際に新たなアプローチを開発するための集中的な研究努力がある。その再生能力に関しては研究し、評価した生体材料は、コラーゲン、フィブリン、キトサンおよびアルギン酸10,11が含まれていた。これらの生体材料は、組織の脱細胞化、自己集合、ラピッドプロトタイピングやエレクトロ12のような異なる戦略を用いて新たな足場を構築するための骨格として使用され、組み合わせることができる。 ENHするためにボディの自身の再生能力をANCE、足場は、生物活性化することができます。組換え血管新生増殖の組み込みは、足場の血管新生を改善することが示されている14のような因子のために13または遺伝子をコードするベクター因子。幹細胞の使用は、広く間葉ストローマ細胞および内皮前駆細胞が、最も注目を集めている15,16血管新生を改善するための有望な戦略であることが示されている。他のアプローチは、移植前17にプレハブ血管網が含まれている構造物を構築しようとします。足場の設計とその生物活性化に集中的な取り組みにもかかわらず、戦略は、臨床的に有意なレベルでの血管新生を改善していないと、大規模な火傷での皮膚代替物を除いて、臨床ルーチンへの生体工学材料の翻訳はためらいがちに18を行われている。
理由の一つなぜ血管新生人工組織構造物を依然として未解決の問題であり、in vivoでのアプローチにおける新技術の成功を評価することが困難である。 インビトロ実験は、足場の血管新生の可能性の重要な洞察を提供し、適切な動物モデルは、このような材料の生体適合性などの重要なパラメータを研究するために必要とされる、治療の安全性および有効性と、特に重要な、組織の血管新生ができるが構築する。したがって、in vivoでの血管ネットワークを視覚化し、定量するための信頼性の高いツールが不可欠である。
本研究では、外植足場内部の血管網の可視化および定量化を可能にする、シンプルで信頼性の高い方法を提示する。この方法は、組織の透視やデジタルセグメンテーションに基づいています。この方法は非侵襲的であるため、ターゲット材料のさらなる分子および組織学的分析を可能にする。
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Protocol
足場の調製
- 12ミリメートル生検パンチを使用して、足場のサンプルを生成します。
- 足場内に生物活性分子または細胞を導入するために、穏やかに滅菌ガーゼでそれらを絞ることによって足場をドレイン。次いで、目的の生物活性分子または細胞を含む溶液の160μLを加えることによって足場を再水和する。そのようなMTTアッセイなどの代謝アッセイを通して細胞と生物活性化の成功をダブルチェックしてください。
- 必要に応じて、ステップ1.2で説明したように、再び再水和を介して、フィブリン - トロンビン溶液またはヒドロゲル中に、例えば、それらを提供することにより、足場の内部でテストすべき化合物または細胞を固定。
注記:化合物または細胞が機械的に材料に付着していない場合、このステップでは、便利であることができる。一つは、また、化合物の放出動態を制御することができます.. - カット時によって、全ての実験および対照群ではそれぞれの足場の下に置かれるチタン化メッシュを、準備しますgのうち円形の小片、直径約14ミリメートル。
注:チタン化メッシュが創傷床から再生された組織を区切るために必要な物理的境界として機能します。
2。動物
- 提示されたモデルの実装に先立ち、対応する動物保護法を参照し、地元当局からの許可を得る。本研究では、すべての実験は、現在のドイツの動物福祉の行為に応じて、マウスを用いて行ったし、オーバーバイエルン(RegierungフォンOberbayern)特別区政府によって承認されました。
- 動物や歪みを慎重に選択します。モデルはマウスで確立されたが、それは、ラット、ウサギまたはブタのような他の一般的な動物に変換することができる。
- あなたは毛皮動物で作業している場合には、足場の移植前の動物の背中を剃る。
注:この作品は20グラムと25グラム、しかし異なる年齢とbの間の体重の生後6〜8週のマウスを使用していますODY重みを使用することもできる。
3麻酔
- 無菌条件下で動作を行う。動物の正常な体温を維持するために、加温マットを使用する。
- 以前は吸入麻酔動物は0.05〜0.1ミリグラム/ kg体重、皮下8時間毎の用量でBuprenorphinを受ける。
- 吸入麻酔(イソフルラン)の下で動物を置きまたは同等の標準的な手順を適用します。優しく動物のつま先を絞ることによって、または皮膚ピンチのいずれかを介して麻酔を確認してください。
- exsiccosisを防止するために、0.5ミリリットルの動作の開始時に生理的食塩水を皮下注射する。
スキンの4切除
- 腹臥位で動物を置き、先端の細いパーマネントペン( 図1A)、マウスの背中の正中線をマーク。
- 切除範囲を定義します。 ふぃぎゅに示す領域内の欠陥を置きます1Cを再び。欠陥があまりにも尾側に配置された場合、動物はドレッシングや足場を除去する傾向であることに注意してください。
- の10mm生検パンチ( 図1B)を使用してバイラテラル欠陥の周りを作成する。パンチを慎重に皮膚に押し付けされるべきであり、皮膚を通って完全に切断するのに使用してはなりませんが、切除領域( 図1C&1E)を描写する。
- 静かにピンセットでマークされた肌を持ち上げ、微細手術用ハサミ( 図1F)を使用してマークされた円に沿って切開する。出血の場合には、慎重に、滅菌ガーゼで圧迫する。切除のステップバイステップの説明は、 図1に示されている。
注:欠陥が肌の弾力性に起因する欠陥の拡大を補償するために、足場を生成するための1より小さくパンチを使用して作成されます。
5。足場移植
- ティタのためのスペースを作るためにデバイスをメッシュ2-4ミリ( 図2A)のための創傷境界で、皮膚とその下の組織の分離を拡張します。
- 創傷床の上に直接欠損部にメッシュをチタン化し、傷のエッジ( 図2AおよびB)の下に置きます。
- メッシュの上に直接足場を置きます。
- 足場( 図2C)にわたって少しの縁を残して、4〜6つの結び目を、隣接する巻回エッジに足場を縫合する。
注:生分解性縫合糸の使用は避けてください。 - 創傷領域( 図2D)の監視を可能にしながら足場を保護するために、欠陥の上にドレッシング透明傷口を縫合。
6。術後ケア
- ドレッシングや足場の相互操作を回避するために、ケージごとに1つのマウスを保管してください。
- 運動活動、体重、苦痛の徴候、許容範囲を観察することによって、日常的に動物の一般的な状態を評価するドレッシングと自動傷に。また、出血、感染症の局所および全身兆候およびドレッシングの位置のための創傷領域を監視します。
- 動物の苦痛を最小限にするために、0.05〜0.1ミリグラム/ kg体重または同等の鎮痛薬の用量で毎日Buprenorphinを注入する。
- マウスは創傷被覆材を除去または損害賠償場合は、麻酔下でそれを交換するか、再接続します。
足場の7。安楽死や植
- 希望の時点で、ペントバルビタール(150mgの/ kg)を過剰投与により動物を生け贄に捧げる。
- 足場および可能性( 図3A)、バック、マウスの皮膚の多くを含むべきである油性マジック、と皮膚切除のサイトをマークします。
- ハサミやメスでマークされた線に沿って皮膚を切開。下にある組織から鈍準備(FIを通じて、足場およびチタン化メッシュを含む全体の肌を、デタッチグレ3B)。
- ペトリ皿に伸ばし移植組織を置きます( 図3CおよびD)
血管網の8。可視化と定量化
- 徹照:
- 白色光(100ワット、標準の電球)の強力なソースの上にシャーレを搭載することにより、透視デバイスをセットアップします。
- デジタル画像を得るために、イルミネーターの上にデジタルカメラを固定します。
- 逆さまに透視デバイス上のペトリ皿上のサンプルを置きます。
- マクロモードでの完全な足場の写真を撮るだけでなく、正常な皮膚の等しいサイズの領域。さらにデジタル解析用のTIFF形式で画像を保存してください。
- さらに生化学的または組織学的分析のために組織を保存します。
- デジタルセグメンテーションおよび定量:
- FRを求めることができるVesSeg-Toolソフトウェアを、ダウンロードしてインストールします:における電荷のee http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 。
- VesSeg-Toolソフトウェアで画像を開きます。
- デジタル解析(画像→選択)のための足場で覆われた画像の領域を選択します。
- オプション「ヒステリシスしきい値」(計算血管強化→トップハット変換→画像→血管強調フィルタ→ヒステリシス閾値処理)を使用して血管のコントラストを増やします。
- 血管マップ(画像→血管強調フィルタ→ヒステリシス閾値化→しきい値の境界線)のセグメント化を進めます。でも、リモートで血管様であるすべてのピクセルなので、第一の閾値(「船舶保険」)を選択して、容器とラベルされます。第二の閾値(「背景カバレッジを」)を選択したので、特に血管様であるピクセルのみが容器としてラベル付けされます。
- 非捕捉血管を追加するために、通常はそのような毛や縫合糸など細長い、血管様構造体である一般的な偽陽性構造を排除するために手動で自動分割案を確認してください。
- 血管の長さと血管(バイナリ画像統計→画像→画像の統計量)でカバー全体の面積を計算します。
注:血管の長さを計算するために、結果として得られる血管マップ内の血管が1画素20の幅でラインに間引く。
- 天然組織に100%の値を割り当てる、足場と同じパラメータの下でネイティブ皮膚領域を分析し、その値に足場を関連付ける。白画素の割合が、正常組織では60%と足場30%である場合、例えば、それは足場の50%の血管新生を表す。注:白い船カバレッジが足場の周りの正方形の面積に割り当てられている。白画素カバレッジconsiの数を調整円の面積は、正方形(4×R 2)よりも有意に小さい(πさ×R 2)であることをダリング。
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Representative Results
信頼性のある国間の完全な皮膚欠陥、皮膚は、研究中の生体材料( 図2)で置き換えることができるマウス( 図1)で作成することができる。ここでは、大きな合併症は、感染や異物反応の巨視的兆候もないが、手術手順の間または後に観察されない。マウスはそれを削除する際にまれに、足場は失われます。創傷収縮は、( 図3)が観察されなかった。組織透視は、天然の組織と移植された足場( 図4)の両方を含め全組織サンプルにおいて、幅が最大で30μmの血管構造の明確な可視化を可能にした。デジタルセグメンテーションの後、船は簡単に移植後希望の時間に定量することができた。例えば、2週間、移植後、62.28±8.6%の血管新生レベルが観察された(平均値の平均値±標準誤差であり、n = 8)21。全体として、約25分 動物あたり(2足場)を移植のために必要とされる、組織の収穫と描いて一つのサンプルのデジタル解析のために10分間、5分。最後の点として、この方法は、さらなる分析のために外植された組織の品質に影響を与えない。例えば、タンパク質およびRNA抽出を容易に標準的な方法により試料から得ることができる。
図1フル皮膚欠陥マウスの背中の正中線は、先端の細いペンでマークされ、生検パンチは、欠陥が(A、B、C及びD)が作成された領域をマークするために使用される。領域が定義されると、完全な皮膚製剤(EおよびF)のクローズアップで見られるように、標準的な外科用ハサミで除去する。 F欠陥のノミナル結果が(D)に示す(G)に拡大される。スケールバーは、A-B-C-Dが1cmとEFGさ5mmを表しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
足場の図2の移植に先立ち足場の植え込みに、メッシュは直接創傷床に創傷エッジ(AとB)の下での欠陥に配置されます。次の足場は、メッシュ上に置き、創傷の縁(C)に縫合されている。最後に、透明な創傷被覆材を配置し、皮膚(D)に縫合される。スケールバーは(A、B、およびC)、ANが5mmを表すD(D)が1cm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3組織外植。組織分析のために動物の背中からの完全な皮膚を外科的に(AとB)を除去し、ペトリ皿(C)に伸ばした。透視のために皮膚は上下反転され、デジタル写真は、(D)を取られる。足場の横の皮膚の除去は、血管新生のデータの正規化のために必要である。スケールバーは1cmに表しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4透照、デジタルセグメンテーションおよび定量。皮膚組織を摘出し、透視(上の写真)は、ネイティブスキン(B)及び足場の裏(A)と、詳細区域の完全な皮膚により可視化した内の血管網(C )が示されている。矢印は、(B)および(C)における拡大領域を示している。下の写真はそれぞれ、直上の画像のためのデジタルセグメント化プロセスの結果を示している。スケールバーは、5mmを表しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
生体材料内の血管新生の過程を研究するための新しい信頼性の高い方法の開発が求められて組織工学構築物中の血液灌流を改善するのに成功したアプローチを確立する必要がある。 ex vivoで可視の足場血管新生を製造するための一般的な方法は、高解像度のツールを提供する顕微鏡の使用を含む。ほとんどの場合、しかし、この方法は、小さな組織領域の分析に制限され、高価で時間がかかる傾向がある。また、多くの場合、血液灌流血管が非機能的なもの22と区別できない精巧な標識および染色の方法を含んでいる。血管の機能性を評価するために使用されている方法は、コンピュータ断層撮影、磁気共鳴イメージング及び陽電子電子トモグラフィである。これらの方法は、非常に高価な装置および低分解能23の欠点を有する。血管新生を可視化するための別の一般的に使用される戦略である組織24の化学的腐食に続いて血管キャストを使用すること。この方法は、血管網の代表的な三次元構造を得ることを可能にするが、結果は、人工灌流および組織のレベルに応じてそのようなタンパク質またはRNA分析などのさらなる生化学的研究のために使用することができない変わる。ニワトリ絨毛尿膜(CAM)モデル25およびげっ歯類26,27における皮下脂肪チャンバーモデルは、血管形成、毛細管灌流および血流を分析するために有効な方法であることが示されている。最近では、皮下脂肪チャンバーモデルは、多孔性ポリウレタン足場28におけるMSCベースの血管新生戦略を評価する組織工学用途のために使用されてきた。 in vivoイメージングのためのこれらの本発明の方法の重要な利点と、ここで説明した方法のための魅力的な標的を表す。
ここに提示されたモデルは、メソッドmの欠点を克服するために開発された上記entioned。皮膚のユニークな固有の特性を利用して、完全な欠陥が作成され、生体材料の血管新生を評価するために使用される。皮膚は容易に可視化し、組織の操作を可能にする外部の臓器です。研究に必要な動物の数を減少させながら、その大きな表面積と均一な構造で、複数の欠陥が、内部の比較を可能にする作成することができる。により、動物の前後方向の対称性のために、二国間の欠陥がしかし、提案されている。両側を互いに比較すると全身作用の影響を考慮すべきである。最後に、皮膚は透照のための選択の最適な臓器を表すかなり透明な組織である。ここで説明する方法は、多くの異なる天然の組織およびいくつかの生体材料に適しているが、このプロトコルは、もともとFDA承認されている二層コラーゲンベースの足場を使用することが確立され、臨床的に使用されたデrmal修理。この方法を実施するための重要な前提条件は、足場は部分的に透明でなければならないことである。選択された足場材料に応じて、プロトコルの一部適応が必要になる場合があります。以前は、私たちのグループは、足場へのヒト間葉系細胞のアプリケーションは、その血管新生29を強化する方法を示すためにモデルを使用しています。
標準的なデジタルカメラと光源は、フリーソフトウェアを介して定量化することができる血管網の可視化のためには十分である。 VesSeg-ツールでの画像の半自動セグメンテーションは、2つのステップで構成されています。最初のステップでは、血管網から撮影された画像は、造影血管マップをもたらすである。その後、セグメンテーションアルゴリズムは、血管領域を選択し、最終的に、セグメント化提案が画像( 図4)30として提示される。第2の処理ステップでは、血管が列strを接続していることを利用して(血管の画素が空間的に一緒にハングことを意味する)ucturesは、二分割は、最初の唯一の真の容器画素およびすべての真の血管ピクセルから選択するために使用される。したがって、「1」の最終ラベルは第2の画像内の高信頼容器ピクセルに隣人の連鎖を介して接続されている最初のイメージからのみ低信頼容器画素に授与されます。
化学的な添加剤は必要ないので、この方法はまた、費用対効果である。デジタル解析は、容器の大きさ、血管内の距離、分岐点の数、血管化エリア及び血管網の総延長決定で良好な再現性を示している。私たちは、以前に血管網が良い無線血管造影研究〜31より透照により可視化できることを示した。チタンメッシュの存在は、二重の機能を有している。一方で、それは、マウスカ月の使用の一般的な欠点である創傷収縮を防止するDELS;一方で、それが足場と創傷床との間の物理的な境界線を提供しています。ほとんどの足場は、生分解性であるため、最後に挙げた機能は、物理的に足場の収穫の際に足場と創傷床との間に境界線をdelimitateすることが重要です。この方法の主な欠点の中で足場を外植する必要があり、したがって、単一の時点に分析の抑制;したがって、血管新生の動的観察は、現在の設定では不可能です。もう一つの問題は、この方法は、透視を可能にする半透明な生体材料に制限されることである。操作手順は、特別な外科的なスキルを必要としていなくても最終的に、約6の学習曲線 - 12手術動物は、適切にメソッドを習得する考慮されなければならない。
私たちは、rは、血管構造の高解像度の可視化および定量化を可能にする時間とコスト効果的なアプローチを導入する別の生体材料または異なる足場生物活性化戦略において血管新生を比較するための理想的な方法をepresenting。この方法は、確立することが容易であり、特別な装置を必要としません。このモデルの重要な特徴は、血管の可視化の後、組織はさらに、組織学的または分子分析などの研究に使用され得ることである。
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Disclosures
関心文の対立:
すべての著者:なし
財務開示:
著者らはいずれも、この原稿に記載されている製品、デバイス、または薬物のいずれかでの経済的利害関係を持っていません。
Acknowledgments
インテグラ皮膚再生テンプレートは、親切にインテグラライフサイエンス社によって提供された。作業を支援する資金源には:(。の人数15090007)この作品は、部分的にCIRM-BMBF早期トランスレーショナルII賞、ゲノム調節のためFONDAPセンターJTEとの両方によって賄われた。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 | Ethicon, Norderstedt, Germany | 698G | Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture |
Biopsy punches (10 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1050 | |
Biopsy punches (12 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1250 | |
Digital camera | Ricoh, Hannover, Germany | Cx1 | |
Gazin Mullkompresse | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany | 13622 | Sterile gauze (10 cm x 10 cm) |
Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10') | Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA | 88101 | |
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia | Baxter, Unterschleissheim, Germany | 100196040 | |
Pentobarbital, 16 g / 100 ml | Fa. Merial, Hallbergmoos | ||
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu | Charles River, Sulzfeld, Germany | Strain code 088 | Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g |
Buprenorphine (0.3 mg/ml) | Essex Pharma GmbH, Munich, Germany | ||
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight | PFM Medical AG, Köln, Germany | 6000029 | |
Tissucol Duo S Immuno 2 ml | Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany | B1332020110614 | Fibrin-thrombin solution |
Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm) | KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK | M6275009/10 |
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