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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten Published: August 28, 2014 doi: 10.3791/51428
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 1, 1,4
1Department of Plastic Surgery and Hand Surgery, University Hospital rechts der Isar, Technische Universität München, 2Institute for Signal Processing, University of Lübeck, 3Department of Plastic Surgery and Hand Surgery, University Hospital Zürich, 4FONDAP Center for Genome Regulation, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile

Summary

Vaskularisierung ist der Schlüssel zur erfolgreichen Ansätze in der Gewebezüchtung. Daher werden sichere Technologien erforderlich, um die Entwicklung von Gefäßnetze im Gewebekonstrukte bewerten. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und kostengünstige Methode zur Visualisierung und Quantifizierung Vaskularisierung in vivo.

Abstract

Unzureichende Vaskularisierung wird als einer der wichtigsten Faktoren, die den klinischen Erfolg der Tissue-Engineering-Konstrukten sein. Um neue Strategien, die auf die Verbesserung der Gefäß Ziel zu bewerten, werden zuverlässige Methoden erforderlich, um die in-Wachstum von neuen Blutgefäßen in Bio-künstliche Gerüste sichtbar zu machen und zu quantifizieren, die Ergebnisse. In den letzten paar Jahren hat unsere Gruppe eine vollständige Hautdefekt Modell, das die direkte Darstellung von Blutgefäßen ermöglicht durch Durchleuchtung und bietet die Möglichkeit der Quantifizierung durch digitale Segmentierung eingeführt. In diesem Modell chirurgisch schafft eine volle Hautdefekte in den Rücken von Mäusen und ersetzt sie mit dem geprüften Werkstoff. Moleküle oder Zellen von Interesse können in solche Materialien einverleibt werden, um die möglichen Auswirkungen zu untersuchen. Nach einer Beobachtungszeit von der eigenen Wahl werden die Materialien für die Bewertung explantiert. Bilaterale Wunden bieten die Möglichkeit, interne Vergleiche thbei minimieren Artefakte zwischen den Individuen als auch der Verringerung der Anzahl der Tiere, für die Studie benötigt. Im Vergleich zu anderen Ansätzen, bietet unsere Methode eine einfache, zuverlässige und kostengünstige Analyse. Wir haben dieses Modell als Routinewerkzeug in hoher Auflösung Screening beim Testen von verschiedenen Gefäß Biomaterialien und Bio-Aktivierung durchführen Ansätze implementiert.

Introduction

In den letzten Jahrzehnten hat sich das Tissue Engineering eine neue therapeutische Option, um Gewebedefekten mit körpereigenen Zellen ersetzen 1 eröffnet. Um die physiologischen Prozess der Geweberegeneration zu unterstützen, werden als biologisch abbaubare Gerüst-Struktur, die ein Szenario, in dem Zellen aus dem Wundbett wachsen und Wiederherstellen der Defekt 2,3 kann bietet gestalten.

Unzureichende Vaskularisierung gilt als das Haupthindernis, das die klinischen Durchbruch der bioartifizielle Gerüste 4 zurückhält sein. Mit dem Einwachsen von Zellen, wird die Nachfrage nach Nährstoffen und Sauerstoff zu und Gefäß des Materials wesentlich. Unzureichende oder verzögert Gefäß kann daher zu zentralen Nekrose der Tissue-Engineering-Produkte 5 führen. Darüber hinaus bieten die Blutgefäße immunkompetenten Zellen und Entfernen der Stoffwechselreste in dem Regenerationsbereich. Hohe Infektionsraten und geringe Regenerations sind nureinige der Folgen unzureichender Durchblutung im Tissue Engineering beobachtet, die ausgerichtet sind, um durch die Erhöhung der Vaskularisierung der Gerüste 6,7 abgewendet werden.

Mehrere Strategien, die auf die Verbesserung der Vaskularisierung Fokus auf die Schlüsselrolle von dem Biomaterial selbst und der Mikrostruktur des Gerüst zielen. Es gibt intensive Forschungsbemühungen, um neue Ansätze bei der Verlagerung des Heilungsprozesses von der Reparatur, um die Regeneration und damit (wieder), die ein Gewebe mit den engsten physiologischen Objekte, die dem zu entwickeln, die wiederhergestellt werden 8,9. Biomaterialien, die ihre Regenerationspotential untersucht und bewertet wurden hinsichtlich enthalten Kollagen, Fibrin, Chitosan und Alginat 10,11. Diese Biomaterialien verwendet und kombiniert als Backbone für den Bau neuer Gerüste mit unterschiedlichen Strategien, wie Gewebe Dezellularisierung, Selbstorganisation, Rapid Prototyping und das Elektro 12 werden. Um ENHrung der körpereigenen Regenerationsfähigkeit, kann Gerüste bioaktiviert werden. Der Einbau von rekombinanten angiogene Wachstumsfaktoren 13 oder Gen-Vektoren kodieren für solche Faktoren 14 hat gezeigt, dass die Vaskularisierung des Gerüsts zu verbessern. Die Verwendung von Stammzellen wurde weithin gezeigt worden, um eine vielversprechende Strategie, um Gefäß, bei denen mesenchymale Stromazellen und endothelialen Vorläuferzellen haben die meiste Aufmerksamkeit 15,16 gewonnen zu verbessern. Andere Ansätze versuchen, Konstrukte, die vorgefertigte Gefäßnetze vor der Transplantation 17 enthalten zu bauen. Trotz intensiver Bemühungen in Gerüst-Design und ihre Bio-Aktivierung hat keine Strategie Vaskularisierung an einer klinisch signifikanten Niveau verbessert und, mit Ausnahme von Hautersatz in massiven Brandverletzungen, ist die Übersetzung von biotechnisch hergestellten Materialien in der klinischen Routine nur zögerlich statt 18 .

Einer der Gründe, warum die Vaskularisierungder künstlichen Gewebekonstrukten ist immer noch ein ungelöstes Problem ist die Schwierigkeit, den Erfolg der neuen Technologien in der in-vivo-Ansätze zu bewerten. Obwohl in vitro-Experimenten können wichtige Erkenntnisse der Gefäß Potenzial von Gerüsten bieten, werden geeignete Tiermodelle erforderlich, um wichtige Parameter untersuchen, wie die Biokompatibilität des Materials, die Sicherheit und Wirksamkeit der Behandlung und, besonders wichtig, die Vaskularisierung des Gewebes zu konstruieren. Daher zuverlässige Werkzeuge zur Visualisierung und Quantifizierung von Blutgefäßnetze in vivo sind unerlässlich.

In dieser Studie zeigen wir ein einfaches und zuverlässiges Verfahren, das die Visualisierung und Quantifizierung des Gefäßnetzes in explantierten Gerüsten ermöglicht. Diese Methode basiert auf Gewebe und digitale Durchleuchtung Segmentierung. Da dieses Verfahren nicht-invasiv ist, kann er weitere molekulare und histologische Analysen des Targetmaterials.

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Protocol

1. Herstellung der Gerüste

  1. Erzeugen Proben der Gerüste durch die Verwendung von 12 mm-Biopsie Schläge.
  2. Bioaktive Moleküle oder Zellen einzuführen in das Gerüst, abtropfen lassen die Gerüste durch sanft drückte sie mit einer sterilen Gaze. Dann rehydrieren die Gerüste durch Zugabe von 160 ul einer Lösung, die biologisch aktiven Moleküle oder Zellen von Interesse enthält. Überprüfen Sie den Erfolg der Bioaktivierung mit Zellen durch Stoffwechseltests, wie MTT-Assays.
  3. Falls erforderlich, korrigieren die Verbindungen oder Zellen innerhalb des Gerüsts getestet werden durch die Bereitstellung von ihnen, zum Beispiel in einem Fibrin-Thrombin-Lösung oder einem Hydrogel, wieder durch Rehydratation, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
    Hinweis: Dieser Schritt kann hilfreich sein, wenn Verbindungen oder Zellen nicht mechanisch mit dem Material zu befestigen. Man kann auch kontrollieren die Freisetzung Dynamik der Verbindungen ..
  4. Bereiten Sie die titanisierten Maschen, die unter jedem Gerüst in jedem Experiment und der Kontrollgruppe gestellt werden, durch cutting aus rund geformte Stücke, etwa 14 mm im Durchmesser.
    HINWEIS: Die titanisierten mesh arbeitet als eine physikalische Grenze erforderlich ist, um das regenerierte Gewebe vom Wundbett zu begrenzen.

2. Tiere

  1. Vor der Umsetzung des vorgestellten Modells finden Sie in den entsprechenden Tierschutzgesetze und die Erlaubnis von den örtlichen Behörden. In dieser Arbeit wurden alle Experimente mit Mäusen durchgeführt, nach der aktuellen deutschen Tierschutzgesetz und von der Regierung von Oberbayern (Regierung von Oberbayern) zugelassen.
  2. Sorgfältig auswählen, das Tier und Dehnung. Obwohl das Modell bei Mäusen festgestellt, kann es zu den üblichen Tieren, wie Ratten, Kaninchen und Schweinen übersetzt werden.
  3. Falls Sie sich mit Pelztiere arbeiten, rasieren die Rücken der Tiere vor der Implantation der Gerüste.
    HINWEIS: Diese Arbeit setzt Mäuse von 6 bis 8 Wochen mit einem Körpergewicht zwischen 20 g und 25 g, jedoch unterschiedlichen Alters und body Gewichten können ebenfalls verwendet werden.

3. Anästhesie

  1. Führen Sie die Operation unter sterilen Bedingungen. Um die normale Körpertemperatur des Tieres zu erhalten, verwenden Sie eine Wärmematte.
  2. Vor der Anästhesie inhalativ erhalten die Tiere Buprenorphin in einer Dosis von 0,05-0,1 mg / kg Körpergewicht subkutan alle 8 Stunden.
  3. Legen Sie das Tier unter inhalativen Anästhesie (Isofluran) oder gleichwertig gelten Standardverfahren. Anästhesie bestätigen entweder durch leichtes Zusammendrücken des Tieres Zehen oder durch eine Haut Prise.
  4. Um zu verhindern Exsikkose injizieren 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung subkutan in den Beginn des Betriebs.

4. Exzision der Haut

  1. Legen Sie das Tier in Bauchlage und markieren Sie die Mittellinie des Maus ist wieder mit einer feinen Spitze permanenten Stift (Abbildung 1A).
  2. Definieren Sie die Exzision Bereich. Legen Sie die Mängel in der in Figu gezeigten Bereichre 1C. Beachten Sie, dass, wenn die Mängel zu kaudal platziert, sind Tiere anfälliger für die Verbände und die Gerüste entfernen.
  3. Erstellen bilaterale Defekte mit einem 10 mm-Biopsie Punch (Abbildung 1B). Der Stempel sollte sorgfältig gegen die Haut gedrückt werden und darf nicht verwendet werden, um komplett durch die Haut geschnitten, aber die Exzision Bereich (1C & 1E) abzugrenzen.
  4. Vorsichtig heben Sie die markierten Haut mit einer Pinzette und einzuschneiden entlang der markierten Kreis mit feinen chirurgischen Schere (1F). Im Falle von Blutungen, sorgfältig zu komprimieren mit steriler Gaze. Eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Exzision ist in Abbildung 1 dargestellt.
    HINWEIS: Der Defekt wird mit einem kleineren Punch als die für die Erzeugung der Gerüste durch die Elastizität der Haut erstellt, um die Erweiterung der Mangel auszugleichen.

5. Gerüst Implantation

  1. Um Platz zu machen für die TitaNetz erfasst, verlängern die Trennung der Haut und des darunterliegenden Gewebes an der Wundränder für 2-4 mm (Abbildung 2A).
  2. Legen Sie die titanisierten direkt auf das Wundbett und unter den Wundrändern (2A & B) in den Defekt Netz.
  3. Ort Gerüste direkt über das Netz.
  4. Naht der Gerüste zu den benachbarten Wundränder mit 4 bis 6 einzelne Knoten, so dass die Kanten leicht über das Gerüst (Abbildung 2C).
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von biologisch abbaubaren Nähten.
  5. Naht eine transparente Wundverband über die Mängel, das Schafott zu schützen und ermöglicht die Überwachung der Wundfläche (2D).

6. Postoperative Pflege

  1. Halten Sie eine Maus pro Käfig zum gegenseitigen Manipulation des Verbandes und Gerüsten abzuwenden.
  2. Bewerten Sie die allgemeinen Zustand des Tieres auf einer täglichen Basis durch die Beobachtung der motorischen Aktivität, Körpergewicht, Anzeichen von Schmerzen, Toleranzin die Umkleide und Auto-Verstümmelung. Überwachen auch den Wundbereich zu Blutungen, lokale und systemische Infektionszeichen und der Position des Aufzugs.
  3. Um die Schmerzen des Tieres zu minimieren, injizieren Buprenorphin täglich in einer Dosis von 0,05-0,1 mg / kg Körpergewicht oder äquivalente Analgetika.
  4. Wenn die Maus entfernt oder Schäden die Wundauflage, ersetzen oder bringen Sie ihn in Narkose.

7. Euthanasie und Explantation des Gerüsts

  1. In gewünschten Zeitpunkten, zu opfern, die Tiere durch Überdosis Pentobarbital (150 mg / kg).
  2. Markieren Sie die Stelle der Haut Exzision mit einem Permanent-Marker, die die Gerüste und so viel von der Maus wieder Haut wie möglich (3A) umfassen sollte.
  3. Inzision der Haut entlang der markierten Linien mit einer Schere oder einem Skalpell. Trennen Sie die gesamte Haut, einschließlich der Gerüste und der titanisierten Masche, von der darunterliegenden Gewebe durch stumpfe Präparation (Figurieren 3B).
  4. Platzieren des explantierten Gewebes auf einer Petrischale gestreckt (3C und D)

8. Visualisierung und Quantifizierung der Gefäßnetz

  1. Durchleuchtung:
    1. Richten Sie eine Durchleuchtungseinrichtung, durch Montage einer Petrischale über einer starken Weißlichtquelle (100 Watt Standard-Glühlampe).
    2. Fix eine Digitalkamera über dem Transilluminator, um digitale Bilder zu erhalten.
    3. Legen Sie die Proben nach oben auf die Petrischale über die Durchleuchtungseinrichtung.
    4. Machen Sie Fotos von der kompletten Gerüsten im Makro-Modus sowie der gleich große Bereiche der normalen Haut. Speichern Sie die Bilder in einer TIFF-Format zur weiteren digitalen Analyse.
    5. Speichern Sie das Gewebe für die weitere biochemische oder histologische Analyse.
  2. Digitale Segmentierung und Quantifizierung:
    1. Download und Installation des VesSeg-Tool-Software, die fr erhalten werden kann,ee Ausgabe bei: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
    2. Öffnen Sie das Bild mit dem VesSeg-Tool.
    3. Wählen Sie den Bereich der durch das Gerüst für die digitale Analyse (Bild → Select) abgedeckt Bild.
    4. Um den Kontrast der Schiffe zu erhöhen verwenden Sie die Option "Hysterese Schwellen" (Bild → Fahrzeug Verstärkungsfilter → Hysterese Schwellen → Top-Hat-Transformation → Berechnen Schiff Enhancement).
    5. Fahren Sie mit der Segmentierung des Schiffes Karte (Bild → Fahrzeug Verstärkungsfilter → Hysterese Schwellen → Schwellwert Grenzen). Wählen Sie die erste Schwelle ("Vessel coverage"), so dass jedes Pixel, was auch nur entfernt gefäßartigen, wird als Schiff bezeichnet werden. Wählen Sie die zweite Schwelle ("Hintergrunddeckung"), so dass nur die Pixel, die besonders gefäßartigen wird als Gefäße beschriftet werden sollen.
    6. Überprüfen Sie die automatische Segmentierung Vorschlag manuell auf nicht-eingefangen Gefäße hinzuzufügen und falsch-positive gemeinsame Strukturen, die in der Regel lange und dünne, gefäßartige Strukturen wie Haare oder Fäden zu beseitigen.
    7. Berechnen Sie die Länge der Schiffe und des Gesamtbereichs von Schiffen bedeckt (Bild → Bilddaten → Binary Bildstatistik).
      HINWEIS: Für die Berechnung der Behälterlängen sind Schiffe im resultierenden Behälter Karte, um Linien mit einer Breite von einem Pixel 20 ausgedünnt.
  3. Analysieren Sie den nativen Hautbereich unter den gleichen Parametern wie die Gerüste, die Zuweisung einen Wert von 100% auf die native Gewebe und betreffen das Gerüst auf diesen Wert. Zum Beispiel, wenn der Prozentsatz der weißen Pixel beträgt 60% im Normalgewebe und 30% in dem Gerüst, wäre eine 50% Vaskularisierung des Gerüsts darstellen. Anmerkung: Der weiße Gefäße Abdeckung ist auf den Bereich ein Quadrat um das Gerüst zugeordnet. Stellen Sie die Anzahl der weißen Pixel Abdeckung Considering, dass die Fläche des Kreises ist deutlich kleiner (π x R 2) als das Quadrat (4 x R 2).

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Representative Results

Eine zuverlässige bilateralen Vollhautdefekt in der Maus (Abbildung 1), wo die Haut durch ein Biomaterial untersucht (Abbildung 2) ersetzt werden erstellt. Hier werden keine größeren Komplikationen während oder nach dem operativen Eingriff, weder makroskopische Anzeichen einer Infektion oder Fremdkörperreaktion beobachtet. In seltenen Fällen wird ein Gerüst verloren, wenn eine Maus entfernt es. Wundkontraktion wurde nicht beobachtet (Abbildung 3). Gewebedurch erlaubt klare Visualisierung von Gefäßstrukturen von bis zu 30 um in der Breite, in einer ganzen Gewebeprobe, die sowohl native Gewebe implantiert und Gerüste (Abbildung 4) enthalten. Nach der digitalen Segmentierung könnte Gefäße leicht quantifiziert werden zu gewünschten Zeiten nach der Implantation. Zum Beispiel, 2 Wochen nach der Implantation, Vaskularisation Ebenen 62,28 ± 8,6% beobachtet (Mittelwert ± Standardabweichung vom Mittelwert, n = 8) 21. Insgesamt etwa 25 min und# 160; pro Tier (2 Gerüsten) für die Implantation erforderlich ist, 5 min zur Gewebeernte und Bebildern und 10 min für die digitale Analyse einer Probe. Als ein letzter Punkt, ist dieses Verfahren nicht auf die Qualität des explantierten Gewebes für die weitere Analyse. Zum Beispiel können Proteine ​​und RNA-Extrakte leicht von der Probe durch Standardverfahren erhalten werden.

Figur 1
Abbildung 1. Volle Hautdefekt. Der Mittellinie des Maus Rückseite ist mit einem feinen Filzstift markiert und eine Biopsie Punch wird verwendet, um den Bereich zu markieren wurden der Defekt (A, B, C und D) erstellt werden. Sobald die Bereiche definiert sind, wird die volle Haut mit Standard-OP-Schere entfernt, wie in der Nahaufnahme der Zubereitung (E und F) gesehen. A final aufgrund des Defekts in (D) gezeigt, und in (G) vergrößert. Maßstabsbalken repräsentieren 1 cm in ABCD und 5 mm in EFG. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Implantation des Gerüsts. Vor der Implantation des Gerüsts, ist ein Geflecht in den Defekt direkt an das Wundbett und unter den Wundrändern (A und B) platziert. Weiter Gerüste sind über das Gitter gelegt und auf die Wundränder (C) angenäht. Schließlich wird eine transparente Wundauflage angeordnet und mit der Haut (D) vernäht. Maßstabsbalken entspricht 5 mm (A, B, und C) eind 1 cm (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Tissue Explantation. Für Gewebeanalyse der volle Haut vom Rücken des Tieres wird operativ entfernt (A und B) und auf einer Petrischale (C) gestreckt. Für Durchleuchtung die Haut auf den Kopf gestellt und eine digitale Bildaufnahme (D). Entfernen der Haut neben den Gerüsten ist zur Normierung der Vaskularisierung Daten erforderlich. Maßstabsbalken repräsentieren 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


Abbildung 4. Durchleuchtung, digitale Segmentierung und Quantifizierung. Hautgewebe herausgeschnitten wurde und das Gefäßnetz in wurde von Durchleuchtung (obere Bilder) Volle Haut des Rückens (A) und Detailbereiche der nativen Haut (B) und das Gerüst sichtbar (C ) gezeigt. Pfeile zeigen die vergrößerten Bereiche, in (B) und (C). Jede der unteren Bilder zeigen die Ergebnisse der digitalen Segmentierung des Bildes befindet sich direkt über. Maßstabsbalken repräsentieren 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Es besteht die Notwendigkeit, erfolgreiche Ansätze bei der Verbesserung der Durchblutung im Gewebe Konstrukte, die die Entwicklung von neuen zuverlässigen Methoden verlangt, um die Gefäßprozesse in den Biomaterialien zu untersuchen etablieren. Übliche Verfahren zur Herstellung von Gerüst Vaskularisierung ex vivo sichtbar umfassen die Verwendung von Mikroskopie, die eine hochauflösende Werkzeug bietet. In den meisten Fällen jedoch ist dieses Verfahren beschränkt auf die Analyse von kleinen Gewebebereiche und wird zu teuer und zeitaufwendig sein. Darüber hinaus ist es oft auch aufwendige Kennzeichnung und Färbeverfahren, wo blutet Schiffe können nicht von nicht-funktionalen diejenigen 22 unterschieden werden. Verfahren in Anwendung zur Beurteilung der Funktionalität der Gefäße Computertomographie, Kernspintomographie und Positronen-Elektronen-Tomographie. Diese Verfahren haben den Nachteil sehr kostspielige Ausrüstung und niedriger Auflösung Leistung 23. Eine weitere, häufig verwendete Strategie zu visualisieren ist die GefäßVerwendung von Gefäß wirft durch chemische Korrosion des Gewebes 24 gefolgt. Dieses Verfahren macht es möglich, eine repräsentative 3D-Struktur des Gefäßnetz zu erhalten, aber die Ergebnisse stark variieren, je nach dem Niveau der künstlichen Durchblutung und Gewebe können nicht für weitere biochemische Untersuchungen, wie Protein-oder RNA-Analyse verwendet werden. Das Huhn Chorioallantoismembran (CAM)-Modell 25 und das Hautkammer-Modell in Nagetieren haben gezeigt, 26,27, wirksame Methoden, um die Angiogenese, Kapillar-Durchblutung und den Blutfluss zu analysieren. Vor kurzem hat die Hautkammer-Modell auch für Tissue Engineering Auswertung MSC-basierte Strategien Vaskularisierung in porösen Polyurethangerüst 28 verwendet. Verfahren weisen entscheidende Vorteile für die in vivo-Bildgebung und für ein attraktives Ziel für das hier beschriebene Verfahren.

Das hier vorgestellte Modell wurde entwickelt, um die Nachteile der Methoden m überwindenentioned oben. Unter Ausnutzung der einzigartigen intrinsischen Eigenschaften der Haut, sind voller Mängel erstellt und verwendet werden, um Gefäß von Biomaterialien zu bewerten. Haut ist ein externer Orgel, die einfacher Visualisierung und Manipulation des Gewebes ermöglicht. Aufgrund seiner großen Oberfläche und homogene Struktur können mehrere Mängel geschaffen werden, die internen Vergleiche möglich zu machen, während die Verringerung der Anzahl der Tiere, für die Studie erforderlich. Aufgrund der antero-posterioren Symmetrie des Tieres, sind bilateral Defekte jedoch darauf hingewiesen; der Einfluss der systemischen Wirkungen in Betracht gezogen, wenn beide Seiten miteinander verglichen werden. Schließlich ist die Haut ein ziemlich transparent Gewebe, die eine optimale Organ der Wahl für Durchleuchtung. Obwohl das hier beschriebene Verfahren ist für viele verschiedene nativen Geweben und mehrere Biomaterialien geeignet, wurde dieses Protokoll ursprünglich gegründet, um mit einem Doppelschicht-Kollagen-basierten Gerüst, das von der FDA zugelassenen und klinisch für de verwendet ist, verwendet werdenrmal Reparatur. Eine wichtige Voraussetzung für die Durchführung dieses Verfahrens ist, dass das Gerüst teilweise transparent sein. Abhängig von der gewählten Gerüstmaterial kann eine gewisse Anpassung des Protokolls erforderlich. Bisher hat unsere Gruppe das Modell verwendet werden, um zu zeigen, wie die Anwendung von humanen mesenchymalen Zellen Gerüste erhöht ihre Gefäß 29.

Ein Standard-Digitalkamera und eine Lichtquelle ausreichend sind zur Visualisierung des Gefäßnetz, das durch freie Software quantifiziert werden kann. Die halbautomatische Segmentierung der Bilder von der VesSeg-Tool besteht aus zwei Schritten. Im ersten Schritt wird das aus dem Gefäßsystem aufgenommene Bild mit verbessertem Kontrast führt zu einem Behälter anzeigen. Dann wird das Segmentierungsalgorithmus wählt die Gefäßbereichen und schließlich wird die Segmentierung Vorschlag als Bild (Figur 4) 30 dargestellt. In einem zweiten Verfahrensschritt unter Verwendung der Tatsache, dass Schiffe str verbundenuctures (was bedeutet, dass Schiff Pixel räumlich zusammenhängen), wird eine zweite Segmentierung verwendet werden, um von der ersten nur die wahren Schiff Pixel und alle wahren Schiff Pixel wählen. Daher wird eine endgültige Bezeichnung von "eins" wird nur für diejenigen mit niedrigem Vertrauen Gefäß Pixel aus dem ersten Bild, das über eine Kette von Nachbarn zu einem hohen Vertrauensgefäßpixel in dem zweiten Bild verbunden sind ausgezeichnet.

Da keine chemischen Zusätze benötigt werden, ist diese Methode auch kostengünstig. Digitale Analyse zeigt eine gute Reproduzierbarkeit bei der Bestimmung Behälterabmessungen, intravaskuläre Entfernungen, Anzahl der Verzweigungspunkte, vaskularisierten Bereich und einer Gesamtlänge von Gefäßnetz. Wir haben bereits gezeigt, dass die Blutgefäßnetzwerk kann besser durch Durchleuchtung als durch Radio-angiographischen Studien 31 visualisiert werden. Die Anwesenheit des Titan-Mesh hat eine Doppelfunktion. Zum einen verhindert es die Wundkontraktion, die eine gemeinsame Nachteil der Verwendung von Maus-models; Auf der anderen Seite stellt sie eine physikalische Grenze zwischen dem Gerüst und dem Wundbett. Da die meisten Gerüste sind biologisch abbaubar ist die letztgenannte Funktion wichtig, die Grenze zwischen dem Gerüst und dem Wundbett während der Gewinnung der Gerüste physisch abzugrenzen. Zu den wichtigsten Nachteilen dieses Verfahrens ist die Notwendigkeit der Explantation die Gerüste und somit zurückhalten der Analyse zu einem einzelnen Zeitpunkt; damit die dynamische Beobachtung der Gefäß ist nicht mit der aktuellen Einstellung möglich. Ein weiteres Problem ist, dass dieses Verfahren beschränkt sich auf halbtransparente Biomaterialien, die Durchleuchtung zu ermöglichen. Schließlich, obwohl das Betriebsverfahren keine speziellen chirurgischen Fähigkeiten, eine Lernkurve von etwa 6 erforderlich - 12 operierten Tieren in Betracht gezogen, das Verfahren richtig zu meistern.

Wir führen eine Zeit und kostengünstiger Ansatz, der hochauflösende Visualisierung und Quantifizierung von Gefäßstrukturen, r erlaubtepresenting eine ideale Methode, um in verschiedenen Gefäß Biomaterialien oder verschiedene Gerüst-Bioaktivierung Strategien zu vergleichen. Dieses Verfahren ist einfach herzustellen und erfordert keine spezielle Ausrüstung erforderlich. Ein wesentliches Merkmal dieses Modells ist, dass nach Gefäßdarstellung, Gewebe kann weiter für Studien, wie die histologische oder molekulare Analyse verwendet werden.

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Disclosures

Interessenkonflikt:

Alle Autoren: Keine

Finanz Angaben:

Keiner der Autoren hat ein finanzielles Interesse an einem der Produkte, Geräte oder in diesem Manuskript erwähnt Drogen.

Acknowledgments

Integra dermalen Regeneration Vorlage wurde freundlicherweise von Integra Lifesciences Corporation. Finanzierungsquellen zur Unterstützung der Arbeit: (. Nr 15090007) Diese Arbeit wurde teilweise durch die CIRM-BMBF Früh Translational II Award und dem FONDAP Zentrum für Genom Regelung sowohl JTE finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 Ethicon, Norderstedt, Germany 698G Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm) Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA P1050
Biopsy punches (12 mm) Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA P1250
Digital camera  Ricoh, Hannover, Germany Cx1
Gazin Mullkompresse  Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany 13622 Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10') Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA 88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia  Baxter, Unterschleissheim, Germany 100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu Charles River, Sulzfeld, Germany Strain code 088 Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g 
Buprenorphine (0.3 mg/ml) Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight PFM Medical AG, Köln, Germany 6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany B1332020110614 Fibrin-thrombin solution 
Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm) KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK M6275009/10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Schenck, T. L., Chávez, M. N., Condurache, A. P., Hopfner, U., Rezaeian, F., Machens, H. G., Egaña, J. T. A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo. J. Vis. Exp. (90), e51428, doi:10.3791/51428 (2014).

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