Summary
La vascularización es clave para enfoques en la ingeniería de tejidos éxito. Por lo tanto, se requieren tecnologías fiables para evaluar el desarrollo de las redes vasculares en los tejidos-construcciones. Aquí presentamos un método simple y rentable para visualizar y cuantificar la vascularización in vivo.
Abstract
Vascularización insuficiente se considera que es uno de los principales factores que limitan el éxito clínico de construcciones de ingeniería tisular. Con el fin de evaluar nuevas estrategias encaminadas a mejorar la vascularización, se requieren métodos confiables para hacer la en-el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en los andamios visibles bioartificiales y cuantificar los resultados. En el último par de años, nuestro grupo ha introducido un modelo de defecto de la piel completa que permite la visualización directa de los vasos sanguíneos mediante transiluminación y ofrece la posibilidad de cuantificación a través de la segmentación digital. En este modelo, se crea quirúrgicamente defectos completos de la piel en la parte posterior de los ratones y las sustituye por el material ensayado. Moléculas o células de interés también se pueden incorporar en tales materiales para estudiar su efecto potencial. Después de un tiempo de observación de la propia elección de uno, los materiales se explantaron para su evaluación. Heridas bilaterales ofrecen la posibilidad de hacer comparaciones internas ªa minimizar los artefactos entre los individuos, así como de reducir el número de animales necesarios para el estudio. En comparación con otros enfoques, nuestro método ofrece un análisis simple, fiable y rentable. Hemos aplicado este modelo como una herramienta rutinaria para llevar a cabo el cribado de alta resolución cuando se prueba la vascularización de diferentes biomateriales y enfoques bio-activación.
Introduction
En las últimas décadas, la ingeniería de tejidos ha abierto una nueva opción terapéutica para reemplazar defectos de tejidos con células del propio cuerpo 1. Con el fin de apoyar el proceso fisiológico de la regeneración de tejidos, andamios están diseñados como una estructura biodegradable, que proporciona un escenario en el que las células de la lecho de la herida pueden crecer y restaurar el defecto de 2,3.
Vascularización insuficiente se considera que es el principal obstáculo, que retiene el avance clínico de andamios bioartificiales 4. Con el crecimiento hacia el interior de las células, la demanda de nutrientes y oxígeno aumenta y vascularización del material se convierte en esencial. Por lo tanto, la vascularización insuficiente o tardía puede llevar a necrosis central de productos de ingeniería tisular 5. Además, los vasos sanguíneos proporcionan células inmunocompetentes y eliminar los residuos metabólicos en la zona de regeneración. Las tasas de infección altas y bajas de regeneración son sóloalgunas de las consecuencias de la perfusión insuficiente de sangre observados en la ingeniería de tejidos, que tienen por objeto que se estén produciendo por el aumento de la vascularización de los andamios de 6,7.
Varias estrategias encaminadas a mejorar la vascularización foco en el papel clave de la propia biomaterial y la microestructura del andamio. Hay esfuerzos de investigación intensiva para desarrollar nuevos enfoques en el cambio del proceso de curación de la reparación a la regeneración, por lo tanto (re) generar un tejido con las propiedades fisiológicas más cercanas a la de ser restaurados 8,9. Biomateriales que fueron estudiados y evaluados en cuanto a su potencial de regeneración incluyen colágeno, fibrina, quitosano y alginato 10,11. Estos biomateriales se pueden utilizar y combinar como columna vertebral para la construcción de nuevos andamios utilizando diferentes estrategias como descelularización tejido, auto-ensamblaje, prototipado rápido y electrospinning 12. Con el fin de ENHAnce propia capacidad de regeneración del cuerpo, los andamios se pueden bioactivados. La incorporación de factores de crecimiento angiogénico recombinante o gen 13 vectores que codifican para tales factores 14 ha demostrado mejorar la vascularización del andamio. El uso de células madre se ha demostrado ampliamente ser una estrategia prometedora para mejorar la vascularización, donde las células estromales mesenquimales y células progenitoras endoteliales han ganado la mayor atención 15,16. Otros enfoques intentan construir construcciones que contienen redes de vasos prefabricados antes del trasplante 17. A pesar de los intensos esfuerzos en el diseño de andamio y su bio-activación, ninguna estrategia ha mejorado la vascularización en un nivel clínicamente significativo y, con la excepción de los reemplazos dérmicos en las lesiones por quemaduras masivas, la traducción de los materiales de bioingeniería en la rutina clínica sólo está teniendo lugar vacilante 18 .
Una de las razones por las que la vascularizaciónde construcciones de tejidos artificiales sigue siendo un problema sin resolver, es la dificultad para evaluar el éxito de las nuevas tecnologías en los enfoques in vivo. Aunque los experimentos in vitro pueden proporcionar importantes conocimientos sobre el potencial de la vascularización de los andamios, se requieren modelos animales apropiados para estudiar los parámetros clave tales como la biocompatibilidad del material, la seguridad y eficacia del tratamiento y, de particular importancia, la vascularización del tejido construir. Por lo tanto, herramientas fiables para visualizar y cuantificar redes de vasos sanguíneos in vivo son esenciales.
En este estudio se presenta un método simple y fiable que permite la visualización y cuantificación de la red vascular en el interior andamios explantados. Este método se basa en la transiluminación del tejido y la segmentación digital. Dado que este método no es invasivo, permite nuevos análisis moleculares e histológicas del material objetivo.
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Protocol
1 Preparación de andamios
- Generar muestras de los andamios utilizando 12 mm punzones biopsia.
- Para introducir moléculas bioactivas o células en el andamiaje, la fuga de los andamios, apretando suavemente con una gasa estéril. Entonces rehidratar los andamios mediante la adición de 160 l de una solución que contiene las moléculas bioactivas o células de interés. Compruebe el éxito de bioactivación con las células a través de ensayos metabólicos como MTT ensayos.
- Si es necesario, fijar los compuestos o células a ensayar en el interior del andamio mediante la entrega de ellos, por ejemplo en una solución de fibrina-trombina o un hidrogel, de nuevo a través de la rehidratación como se describe en el paso 1.2.
NOTA: Este paso puede ser de utilidad cuando los compuestos o células no se adhieren mecánicamente al material. También se puede controlar la dinámica de liberación de los compuestos .. - Preparar las mallas titanizado, que serán colocados en cada andamio en cada grupo experimental y el control, por cutting trozos de forma redonda, de aproximadamente 14 mm de diámetro.
NOTA: La malla titanizado funciona como una frontera física necesaria para delimitar el tejido regenerado del lecho de la herida.
2. Animales
- Antes de la implementación del modelo presentado, consulte las leyes de protección animal correspondientes y obtener el permiso de las autoridades locales. En este trabajo, todos los experimentos se realizaron con ratones, de acuerdo con la actual ley de bienestar animal alemán y aprobados por el Gobierno del Distrito de la Alta Baviera (Regierung von Oberbayern).
- Elija cuidadosamente el animal y la tensión. Aunque el modelo se estableció para los ratones, que se puede traducir a otros animales comunes, tales como ratas, conejos o cerdos.
- Si estás trabajando con animales de pelo, afeitarse la parte posterior de los animales antes de la implantación de los andamios.
NOTA: Este trabajo utiliza ratones de 6 a 8 semanas de edad con un peso corporal entre 20 gy 25 g, sin embargo diferentes edades y bpesos ody también se pueden utilizar.
3. Anestesia
- Llevar a cabo la operación en condiciones estériles. Con el fin de mantener la temperatura normal del cuerpo del animal, utilizar una estera de calentamiento.
- Antes de la inhalación de anestesia a los animales reciben buprenorfina a una dosis de 0,05-0,1 mg / kg de peso corporal, por vía subcutánea cada 8 horas.
- Colocar el animal bajo anestesia por inhalación (isoflurano) o aplicar procedimientos estándar equivalentes. Confirme la anestesia, ya sea apretando suavemente los dedos del pie del animal oa través de un pliegue cutáneo.
- Para evitar exsiccosis, inyectar 0,5 ml por vía subcutánea solución salina fisiológica al comienzo de la operación.
4. La escisión de la piel
- Colocar el animal en posición prona y marcar la línea media de la espalda del ratón con un bolígrafo de punta fina permanente (Figura 1A).
- Defina el área de la escisión. Coloca los defectos en el área mostrada en Figure 1C. Tenga en cuenta que si los defectos se colocan demasiado caudal, los animales son más propensos a retirar los apósitos y los andamios.
- Crear ronda defectos bilaterales usando un punzón de biopsia de 10 mm (Figura 1B). El punzón debe ser cuidadosamente forzado contra la piel y no debe ser utilizado para cortar completamente a través de la piel, pero para delinear el área de la escisión (Figuras 1C y 1E).
- Levantar suavemente la piel marcada con una pinza y una incisión a lo largo del círculo marcado con unas tijeras quirúrgicas finas (Figura 1F). En caso de hemorragia, comprimir cuidadosamente con una gasa estéril. Una descripción paso a paso de la escisión se muestra en la Figura 1.
NOTA: El defecto se crea con un punzón más pequeño que el de la generación de los andamios, para compensar la ampliación del defecto debido a la elasticidad de la piel.
5. Andamios Implantación
- Con el fin de hacer espacio para la titazada malla, extender la separación de la piel y el tejido subyacente en las fronteras de la herida de 2-4 mm (Figura 2A).
- Coloque el titanizado de malla en el defecto directamente en el lecho de la herida y bajo los bordes de la herida (Figuras 2A y B).
- Lugar andamios directamente sobre la malla.
- Suturar los andamios a los bordes de la herida adyacentes con 4 a 6 nudos individuales, dejando los bordes ligeramente en el andamio (Figura 2C).
NOTA: Evite el uso de suturas biodegradables. - Suturar una herida apósito transparente por encima de los defectos para proteger el andamio al tiempo que permite el seguimiento de la zona de la herida (Figura 2D).
6. Cuidado Postoperatorio
- Mantenga un ratón por jaula para evitar la manipulación mutua del vestidor y andamios.
- Evaluar el estado general del animal sobre una base diaria por la observación de la actividad del motor, el peso corporal, signos de dolor, la toleranciaal vestidor y auto-mutilación. También supervisar el área de la herida para el sangrado, local y signos sistémicos de infección y la posición del apósito.
- Con el fin de minimizar el dolor del animal, inyectar buprenorfina diaria en una dosis de 0,05-0,1 mg / kg de peso corporal o la medicación analgésica equivalente.
- Si el ratón elimina o daña el vendaje de la herida, reemplazar o volver a instalarlo bajo anestesia.
7. Eutanasia y explantación del andamio
- En los puntos de tiempo deseados, sacrificar los animales por sobredosis de pentobarbital (150 mg / kg).
- Marque el sitio de escisión de la piel con un marcador permanente, que debe incluir los andamios y la mayor cantidad de ratón de nuevo la piel como sea posible (Figura 3A).
- Incisión en la piel a lo largo de las líneas marcadas con un par de tijeras o un bisturí. Separar la totalidad de la piel, incluyendo los andamios y la malla titanizado, desde el tejido subyacente a través de la preparación romo (Figura 3B).
- Coloque el tejido explantado tendido en una placa de Petri (Figura 3C y D)
8. visualización y cuantificación de la Red Vascular
- Transiluminación:
- Configurar un dispositivo de transiluminación, mediante el montaje de una placa de Petri encima de una fuente intensa de luz blanca (100 vatios bombilla estándar).
- Fijar una cámara digital por encima del transiluminador para obtener imágenes digitales.
- Colocar las muestras en posición invertida sobre la placa de Petri sobre el dispositivo de transiluminación.
- Tome fotos de los andamios completos en modo macro, así como de las áreas de igual tamaño de la piel normal. Guarde las imágenes en un formato TIFF para su posterior análisis digital.
- Guarde el tejido para su posterior análisis bioquímicos o histológicos.
- Segmentación digital y cuantificación:
- Descargue e instale el software VesSeg-Herramienta, que se puede obtener free de forma gratuita en: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
- Abra la imagen con el software VesSeg-Herramienta.
- Seleccione el área de la imagen cubierta por el andamio para el análisis digital (imagen → Select).
- Para aumentar el contraste de los vasos utilizar la opción "umbral de histéresis" (Imagen → mejora Vessel filtro → Histéresis de umbral → Top-Hat transformación → mejora buque Calcular).
- Proceda con la segmentación del mapa buque (las fronteras de imagen → mejora Vessel filtro → → umbral Histéresis de umbral). Seleccione el primer umbral ("cobertura de buques"), por lo que cada píxel, que es ni remotamente buque similar, será etiquetado como recipiente. Seleccione el segundo umbral ("cobertura de fondo"), por lo que sólo aquellos píxeles que son particularmente buque similar será etiquetado como vasos.
- Compruebe la propuesta automática segmentación manualmente añadir buques no capturados y eliminar estructuras falsos positivos comunes, que generalmente son largas y delgadas estructuras, como los vasos tales como pelos o suturas.
- Calcular la longitud de los vasos y el área total cubierta por los buques (estadísticas de imagen → Imagen → Estadísticas imagen binaria).
NOTA: Para el cálculo de las longitudes de los vasos, vasos en el mapa buque resultante se adelgazan a las líneas con un ancho de un pixel 20.
- Analizar el área de la piel nativa bajo los mismos parámetros que los andamios, la asignación de un valor de 100% para el tejido nativo y se refieren al cadalso a ese valor. Por ejemplo, si el porcentaje de píxeles blancos es 60% en el tejido normal y 30% en el andamio, representaría una vascularización 50% del andamio. Nota: La cobertura vasos blanco se asigna al área de un cuadrado alrededor del andamio. Ajuste el número de píxeles blancos consi coberturaDering que el área del círculo es significativamente menor (π x R 2) que el cuadrado (4 x R 2).
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Representative Results
Un defecto de la piel completa bilateral fiable se puede crear en el ratón (Figura 1) donde la piel puede ser reemplazado por un biomaterial en estudio (Figura 2). Aquí, no se observan complicaciones mayores durante o después del procedimiento quirúrgico, ni signos macroscópicos de infección o reacción de cuerpo extraño. En casos raros, un andamio se pierde cuando un ratón elimina. Contracción de la herida que nunca se observó (Figura 3). Transiluminación tejido permitió una clara visualización de las estructuras vasculares de hasta 30 m de ancho, en una muestra de tejido completo que incluía tanto, el tejido nativo y andamios implantados (Figura 4). Después de la segmentación digital, los vasos pueden ser fácilmente cuantificados en momentos deseados después de la implantación. Por ejemplo, 2 semanas después de la implantación, se observaron niveles de vascularización de 62,28 ± 8,6% (media ± error estándar de la media, n = 8) 21. En total, unos 25 minutos y# 160; por animal (2 andamios) son necesarios para la implantación, 5 min para la cosecha de tejidos y picturing y 10 min para análisis digital de una muestra. Como punto final, este método no afecta a la calidad del tejido explantado para su posterior análisis. Por ejemplo, las proteínas y los extractos de ARN se pueden obtener fácilmente a partir de la muestra por métodos estándar.
Figura 1. completo defecto de la piel. La línea media de la espalda del ratón se marca con un lápiz de punta fina y un punzón de biopsia se utiliza para marcar la zona fueron el defecto se creará (A, B, C y D). Una vez que se definen las áreas, la piel llena se retira con unas tijeras quirúrgicas estándar como se ve en el primer plano de la preparación (E y F). Un final resultado del defecto se muestra en (D) y magnificada en (G). Las barras de escala representan 1 cm de ABCD y 5 mm de EFG. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Implantación del andamio. Antes de la implantación del andamio, se coloca una malla en el defecto directamente en el lecho de la herida y debajo de los bordes de la herida (A y B). Andamios siguientes se colocan sobre la malla y se suturan los bordes de la herida (C). Finalmente, un vendaje para heridas transparente se coloca y se sutura a la piel (D). La barra de escala representa 5 mm en (A, B, y C) und 1 cm en (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. tejido explantación. Para el análisis de tejido se quita la piel de la parte posterior completa del animal quirúrgicamente (A y B) y se estiró en una placa de Petri (C). Para la transiluminación la piel se pone patas arriba y una fotografía digital se toma (D). La eliminación de la piel junto a los andamios es necesario para la normalización de los datos de la vascularización. Las barras de escala representan 1 cm. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. transiluminación, la segmentación digital y el tejido de la piel fue extirpada (cuantificación., Y la red vascular dentro se visualizó mediante transiluminación (fotos superiores) de la piel completa de la parte posterior (A) y zonas detalladas de la piel nativa (B) y el andamio C ) se muestran. Las flechas indican las zonas ampliadas en (B) y (C). Cada una de las imágenes inferiores muestran los resultados del proceso de segmentación digital para la imagen situada directamente por encima. Las barras de escala representan 5 mm. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay una necesidad de establecer enfoques eficaces en la mejora de la perfusión sanguínea en construcciones de ingeniería tisular, lo que exige el desarrollo de nuevos métodos fiables para estudiar los procesos de vascularización dentro de los biomateriales. Los métodos comunes para hacer visible la vascularización andamio ex vivo incluyen el uso de la microscopía, que proporciona una herramienta de alta resolución. En la mayoría de los casos, sin embargo, este método está limitado al análisis de pequeñas áreas de tejido y tiende a ser caro y consume tiempo. Además, a menudo incluye el etiquetado elaborado y métodos de tinción, donde los vasos sanguíneos perfundidos no se pueden distinguir de los no-funcionales 22. Los métodos utilizados para evaluar la funcionalidad de los vasos son la tomografía computarizada, la resonancia magnética y la tomografía de electrones positrones. Estos métodos tienen los inconvenientes de equipos extremadamente costosos y de baja resolución de energía 23. Otra estrategia comúnmente utilizado para visualizar la vascularización es lauso de moldes de vascular seguido por la corrosión química del tejido 24. Este método hace que sea posible obtener una estructura 3D representativa de la red vascular, pero los resultados varían fuertemente en función del nivel de la perfusión y tejidos artificiales no se puede utilizar para otros estudios bioquímicos, como la proteína o el análisis de ARN. La membrana corioalantoidea de pollo modelo 25 (CAM) y el modelo de cámara de pliegue cutáneo en roedores 26,27 han demostrado ser métodos eficaces para analizar la angiogénesis, la perfusión capilar y el flujo sanguíneo. Recientemente, el modelo de cámara de pliegue de la piel también se ha utilizado para aplicaciones de ingeniería de tejidos evaluación de las estrategias basadas en la vascularización MSC en andamios porosos de poliuretano 28. Estos métodos presentan ventajas importantes para la formación de imágenes in vivo y representan un objetivo atractivo para el método descrito aquí.
El modelo presentado aquí fue desarrollado para superar las deficiencias de los métodos mentioned anteriormente. Aprovechando las características intrínsecas únicas de la piel, defectos completos son creados y utilizados para evaluar la vascularización de los biomateriales. La piel es un órgano externo, que permite la visualización más fácil y la manipulación del tejido. Debido a su gran estructura de la superficie y homogénea, múltiples defectos pueden ser creados que hacen comparaciones internas posible, mientras que disminuye el número de animales necesarios para el estudio. Debido a la simetría antero-posterior del animal, defectos bilaterales se sugieren, sin embargo; la influencia de los efectos sistémicos debe ser considerado cuando ambos lados se comparan entre sí. Finalmente, la piel es un tejido bastante transparente que representa un órgano de elección óptima para la transiluminación. Aunque el método aquí descrito es adecuado para muchos diferentes tejidos nativos y varios biomateriales, este protocolo se estableció originalmente para ser utilizado con un andamio a base de colágeno de doble capa que está aprobado por la FDA y clínicamente utilizado para dereparación rmal. Un requisito importante para la aplicación de este método es que el andamio tiene que ser parcialmente transparente. Dependiendo del material del andamio elegido, puede ser necesaria alguna adaptación del protocolo. Anteriormente, nuestro grupo ha utilizado el modelo para mostrar cómo la aplicación de las células mesenquimatosas humanas a los andamios aumenta su vascularización 29.
Una cámara digital estándar y una fuente de luz son suficientes para la visualización de la red vascular, que puede cuantificarse a través de software libre. La segmentación semiautomática de las imágenes de la VesSeg-herramienta consta de dos pasos. En el primer paso, la imagen tomada de la red vascular es contraste mejorado que conduce a un mapa buque. Entonces, el algoritmo de segmentación selecciona las áreas de vaso y finalmente, la propuesta de la segmentación se presenta como una imagen (Figura 4) 30. En una segunda etapa de procesamiento, usando el hecho de que los buques están conectados structures (lo que significa que los vasos píxeles cuelgan juntos en el espacio), una segunda segmentación se utiliza para seleccionar a partir del primero sólo los vasos verdaderos píxeles y todos los verdaderos vasos píxeles. Por lo tanto, una etiqueta final de "uno" se otorga únicamente a los píxeles del vaso bajo de confianza desde la primera imagen que se conectan a través de una cadena de vecinos de un píxel buque de alta confianza en la segunda imagen.
Como no hay aditivos químicos son necesarios, este método es también rentable. Análisis digital muestra una buena reproducibilidad en la determinación de las dimensiones de los buques, las distancias intravasculares, número de puntos de ramificación, zona vascularizada y la longitud total de la red vascular. Hemos demostrado previamente que la red de vasos sanguíneos puede ser mejor visualizada por transiluminación que a través de estudios de radio-angiográfico 31. La presencia de la malla de titanio tiene una doble función. Por un lado, impide la contracción de la herida, que es un inconveniente común de la utilización del ratón models; Por otro lado, proporciona una frontera física entre el andamio y el lecho de la herida. Porque la mayoría de los andamios son biodegradables, esta última función es fundamental para delimitar físicamente la frontera entre el andamio y el lecho de la herida durante la recolección de los andamios. Entre los principales inconvenientes de este método es la necesidad de explantación los andamios y por lo tanto el frenar del análisis a un único punto de tiempo; por lo tanto la observación dinámica de la vascularización no es posible con la configuración actual. Otro problema es que este método está limitado a biomateriales semi-transparente que permiten la transiluminación. Por último, a pesar de que el procedimiento de operación no requiere de habilidades quirúrgicas especiales, una curva de aprendizaje de unos 6-12 animales operados tienen que ser considerados para dominar el método correctamente.
Se introduce un enfoque de tiempo y rentable que permite alta resolución de visualización y cuantificación de las estructuras vasculares, rREPRESENTAN un método ideal para comparar la vascularización en diferentes biomateriales o diferentes estrategias de andamio-bioactivación. Este método es fácil de establecer y no requiere equipo especial. Una característica clave de este modelo es que después de la visualización de vasos, tejidos pueden ser utilizados más para estudios como histológica o análisis molecular.
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Disclosures
Declaración de conflicto de intereses:
Todos los autores: Ninguno
Divulgación de información financiera:
Ninguno de los autores tiene un interés financiero en cualquiera de los productos, dispositivos o medicamentos mencionados en este manuscrito.
Acknowledgments
Integra plantilla de regeneración dérmica fue proporcionado amablemente por Integra LifeSciences Corporation. Fuentes de fondos de apoyo a la obra: Este trabajo fue parcialmente financiado por el Premio CIRM-BMBF Early Traslacional II y el Centro FONDAP de regulación del genoma tanto a JTE (Nr 15090007.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 | Ethicon, Norderstedt, Germany | 698G | Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture |
| Biopsy punches (10 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1050 | |
| Biopsy punches (12 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1250 | |
| Digital camera | Ricoh, Hannover, Germany | Cx1 | |
| Gazin Mullkompresse | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany | 13622 | Sterile gauze (10 cm x 10 cm) |
| Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10') | Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA | 88101 | |
| Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia | Baxter, Unterschleissheim, Germany | 100196040 | |
| Pentobarbital, 16 g / 100 ml | Fa. Merial, Hallbergmoos | ||
| Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu | Charles River, Sulzfeld, Germany | Strain code 088 | Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g |
| Buprenorphine (0.3 mg/ml) | Essex Pharma GmbH, Munich, Germany | ||
| Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight | PFM Medical AG, Köln, Germany | 6000029 | |
| Tissucol Duo S Immuno 2 ml | Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany | B1332020110614 | Fibrin-thrombin solution |
| Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm) | KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK | M6275009/10 |
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