Summary
Vaskularisering er nøglen til tilgange i vellykket tissue engineering. Derfor er pålidelige teknologier nødvendige for at vurdere udviklingen af vaskulære netværk i væv-konstruktioner. Her præsenterer vi en enkel og omkostningseffektiv metode til at visualisere og kvantificere vaskularisering in vivo.
Abstract
Utilstrækkelig vaskularisering anses for at være en af de vigtigste faktorer, der begrænser den kliniske succes for væv-manipuleret konstruktioner. For at vurdere nye strategier, der sigter mod at forbedre vaskularisering, er pålidelige metoder kræves for at gøre det i vækst af nye blodkar i bio-kunstige stilladser synlige og kvantificere resultaterne. Gennem de seneste par år, har vores gruppe indført et komplet hud defekt model, der gør det muligt direkte visualisering af blodkar ved gennemlysning og giver mulighed for kvantificering via digital segmentering. I denne model, en kirurgisk skaber fuld overfladefejl i ryggen af mus og erstatter dem med det afprøvede materiale. Molekyler eller celler af interesse kan også indgå i sådanne materialer til at studere deres potentielle effekt. Efter en observationstid på ens egen valg, materialer eksplanteret til evaluering. Bilaterale sår giver muligheden for at gøre de interne sammenligninger thved minimering af artefakter mellem individer samt mindske antallet af dyr, der er nødvendige for undersøgelsen. I sammenligning med andre fremgangsmåder, vores metode giver en enkel, pålidelig og omkostningseffektiv analyse. Vi har implementeret denne model som en rutine værktøj til at udføre høj opløsning screening ved test vaskularisering af forskellige biomaterialer og bio-aktivering tilgange.
Introduction
I de seneste årtier har tissue engineering åbnet en ny terapeutisk mulighed for at erstatte vævsdefekter med kroppens egne celler 1. For at støtte den fysiologiske proces vævsregenerering er stilladser udformet som en bionedbrydelig struktur, der giver et scenarie, hvor celler fra sårlejet kan vokse og genoprette defekten 2,3.
Utilstrækkelig vaskularisering anses for at være den største hindring, som holder tilbage den kliniske gennembrud Bioartificial stilladser 4. Med indvækst af celler, bliver væsentlig efterspørgsel efter næringsstoffer og ilt stiger, og vaskularisering af materialet. Utilstrækkelig eller forsinket vaskularisering kan derfor føre til central nekrose af væv-manipuleret 5. Desuden blodkar forsyner immunkompetente celler og fjerne de metaboliske rester i regenererende område. Høje infektion satser og lav regenerering er kunnogle af konsekvenserne af utilstrækkelig blodperfusion observeret i tissue engineering, der har til formål at afværges ved at øge vaskularisering af stilladser 6,7.
Adskillige strategier, der sigter mod at forbedre vaskularisering fokus på den centrale rolle, biomaterialet selv og mikrostruktur af stilladset. Der er intensiv forskning bestræbelser på at udvikle nye tilgange i skiftende helingsprocessen fra reparation til regenerering, og dermed (gen) generere en væv med de nærmeste fysiologiske egenskaber til en, der skal genoprettes 8,9. Biomaterialer, der blev undersøgt og evalueret med hensyn til deres regenerative potentiale inkluderet kollagen, fibrin, chitosan og alginat 10,11. Disse biomaterialer kan bruges og kombineres som en rygrad til at bygge nye stilladser ved hjælp af forskellige strategier såsom væv decellularization, self-assembly, rapid prototyping og electrospinning 12. For at ENHstemmelse kroppens egen regenerationsevne kan stilladser blive bioaktiveres. Inkorporeringen af rekombinant angiogene vækstfaktorer 13 eller gen vektorer, der koder for sådanne faktorer, 14 har vist sig at forbedre vaskularisering af stilladset. Anvendelsen af stamceller er i vid udstrækning blevet vist at være en lovende strategi til forbedring vaskularisering, hvor mesenchymale stromale celler og endotheliale progenitorceller har fået mest opmærksomhed 15,16. Andre tilgange forsøger at bygge konstruktioner, der indeholder præfabrikerede netværk fartøj før transplantation 17. Trods intensiv indsats i stillads design og deres bio-aktivering, har ingen strategi forbedret vaskularisering ved et klinisk signifikant niveau, og med undtagelse af dermale udskiftninger i massive forbrændinger, er oversættelsen af gensplejsede materialer i klinisk rutine kun finder sted tøvende 18 .
En af grundene til, at vaskulariseringaf kunstige vævskonstruktioner er stadig et uløst problem, er vanskeligheden ved at evaluere resultaterne af nye teknologier i in vivo-metoder. Selvom in vitro-forsøg kan give vigtige indsigter vaskulariseringen potentiale stilladser, er egnede dyremodeller der kræves for at studere centrale parametre såsom biokompatibilitet af materialet, sikkerhed og effekt af behandlingen, og af særlig betydning, at vaskularisering af vævet konstruere. Derfor er pålidelige værktøjer visualisere og kvantificere blodkar netværk in vivo er afgørende.
I denne undersøgelse præsenterer vi en enkel og pålidelig metode, der tillader visualisering og kvantificering af det vaskulære netværk inde eksplanterede stillads. Denne metode er baseret på væv gennemlysning og digital segmentering. Da denne metode er ikke-invasiv, det giver mulighed for yderligere molekylære og histologiske analyser af målmaterialet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af stilladser
- Generer prøver af stilladser ved hjælp af 12 mm biopsi slag.
- At introducere bioaktive molekyler eller celler i stillads, dræne stilladser ved forsigtigt at klemme dem med en steril gaze. Derefter rehydrere stilladser ved tilsætning af 160 pi af en opløsning indeholdende de bioaktive molekyler eller celler af interesse. Dobbelt-tjek succes bioaktivering med celler gennem metaboliske assays, såsom MTT assays.
- Hvis det er nødvendigt, fastsætte forbindelserne eller celler, der skal testes inden stilladset ved at levere dem, for eksempel i en fibrin-thrombin-opløsning eller en hydrogel, igen gennem rehydrering som beskrevet i trin 1.2.
BEMÆRK: Dette trin kan være af nyttige, når forbindelser eller cellerne ikke mekanisk tillægger materialet. Man kan også kontrollere frigivelsen dynamik af forbindelserne .. - Forbered titanized masker, som vil blive placeret under hvert stillads i hvert forsøg og kontrolgruppen ved cutting ud runde formede stykker, ca 14 mm i diameter.
BEMÆRK: titanized net fungerer som en fysisk grænse kræves for at afgrænse det regenererede væv fra såret sengen.
2. Dyr
- Forud for gennemførelsen af den præsenterede model, konsultere de tilsvarende love om beskyttelse af dyr og indhente tilladelse fra de lokale myndigheder. I dette arbejde blev alle eksperimenter udført med mus, i henhold til den gældende tyske dyreværnsloven og godkendt af District regering Oberbayern (Regierung von Oberbayern).
- Omhyggeligt vælge dyret og stamme. Selvom modellen blev etableret for mus, kan det blive oversat til andre almindelige dyr, såsom rotter, kaniner eller svin.
- Hvis du arbejder med pelsdyr, barbere ryggen af dyrene før implantation af stilladserne.
BEMÆRK: Dette arbejde bruger mus af 6 til 8 uger gamle med en kropsvægt på mellem 20 g og 25 g, dog forskellige aldre og BODY vægte kan også anvendes.
3. Anæstesi
- Gennemføre drift under sterile forhold. For at opretholde dyrets normale kropstemperatur bruge en opvarmning måtten.
- Forud for inhalation anæstesi dyrene får Buprenorphin i en dosis på 0,05-0,1 mg / kg legemsvægt, subkutant hver 8. time.
- Placer dyret under inhalativ anæstesi (Isofluran) eller anvende tilsvarende standardprocedurer. Bekræft anæstesi enten ved forsigtigt at klemme dyrets tæer eller gennem en hud knivspids.
- For at forhindre exsiccosis injiceres 0,5 ml fysiologisk saltvandsopløsning subkutant i begyndelsen af operationen.
4. Excision af hud
- Placer dyret i en udsat position og markere midterlinjen af musens tilbage med en fin spids permanent pen (figur 1A).
- Definer excision området. Placer defekter i det område, der er vist i Figure 1C. Bemærk, at hvis de mangler, er placeret for kaudalt, dyr er mere tilbøjelige til at fjerne de forbindinger og stilladser.
- Opret runde bilaterale defekter ved hjælp af en 10 mm biopsitang (figur 1B). Dornen skal omhyggeligt tvinges mod huden og må ikke anvendes til at skære helt igennem huden, men for at afgrænse excision område (figur 1C og 1E).
- Løft forsigtigt fra det markerede huden med pincet og incise langs den markerede cirkel med fine kirurgiske sakse (figur 1F). I tilfælde af blødning, forsigtigt komprimere med steril gaze. En trin-for-trin beskrivelse af udskæringen er vist i figur 1.
BEMÆRK: Defekten er skabt med et mindre slag end den til generering stilladserne, at kompensere for udvidelsen af defekten på grund af hudens elasticitet.
5. Stillads Implantation
- For at gøre plads til titaniumniseret mesh forlænge adskillelse af huden og det underliggende væv i såret grænser for 2-4 mm (figur 2A).
- Placer titanized maske ind i det defekte direkte på såret sengen og under sårkanterne (figur 2A og B).
- Sted stilladser direkte over masken.
- Suturere stilladser til de tilstødende sårkanterne med 4 til 6 enkelt knob, forlader kanterne lidt over stilladset (figur 2C).
BEMÆRK: Undgå at bruge biologisk nedbrydelige suturer. - Suturen en transparent sårforbinding over mangler at beskytte stillads samtidig med at overvågningen af sårområdet (Figur 2D).
6. Postoperativ pleje
- Hold en mus pr bur for at undgå gensidig manipulation af forbindingen og stilladser.
- Beregn den generelle tilstand af dyret dagligt ved at observere motorisk aktivitet, legemsvægt, tegn på smerte, tolerancetil dressingen og auto-lemlæstelse. Også overvåge såret område for blødning, lokal og systemisk tegn på infektion og placeringen af bandagen.
- For at minimere smerten af dyret, injicere Buprenorphin dagligt med en dosis på 0,05-0,1 mg / kg legemsvægt eller tilsvarende smertestillende medicin.
- Hvis musen fjerner eller skader såret dressing, erstatte eller vedhæfte den under anæstesi.
7. Aflivning og eksplantation af stilladset
- På de ønskede tidspunkter, ofre dyrene ved overdoser af pentobarbital (150 mg / kg).
- Markere stedet for huden excision med en permanent markør, som bør omfatte de stilladser og så meget af musen tilbage af huden som muligt (figur 3A).
- Incise huden langs de markerede linjer med en saks eller en skalpel. Frigør hele huden, herunder stilladser og titanized mesh, fra det underliggende væv gennem stump forberedelse (Fifigur 3B).
- Placer det eksplanterede væv strakt ud på en petriskål (figur 3C og D)
8. Visualisering og kvantificering af det vaskulære netværk
- Gennemlysning:
- Opsæt en gennemlysning enhed, ved at montere en petriskål over en stærk kilde til hvidt lys (100 watt standard pære).
- Løs et digitalt kamera over transilluminatoren at opnå digitale billeder.
- Anbring prøverne på hovedet på petriskålen over gennemlysning enhed.
- Tag billeder af de fuldstændige stilladser i makro mode samt lige store områder af normal hud. Opbevar billederne i TIFF-format til yderligere digital analyse.
- Gem væv til yderligere biokemisk eller histologisk analyse.
- Digital segmentering og kvantificering:
- Download og installer VesSeg-værktøj software, som kan fås free beregning på: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
- Åbn billedet med VesSeg-værktøj software.
- Vælg den del af billedet, der er omfattet af stilladset til digital analyse (Billede → Select).
- For at øge kontrasten af fartøjer anvender indstillingen "Hysterese tærskling" (Billede → Vessel ekstraudstyr filter → hysterese tærskelværdiansættelse → Bedst Hat transformation → Beregn fartøj ekstraudstyr).
- Fortsæt med segmentering af fartøjet kortet (Billede → Vessel ekstraudstyr filter → hysterese tærskelværdiansættelse → Threshold grænser). Vælg den første tærskel ("Vessel dækning"), så hver pixel, som er endnu fjernt fartøj-lignende, vil blive mærket som fartøj. Vælg den anden tærskel ("Baggrund dækning"), så kun de pixels, som er særligt skib-lignende vil blive mærket som skibe.
- Kontroller den automatiske segmentering forslag manuelt at tilføje ikke-erobrede skibe og for at fjerne fælles falsk positive strukturer, som normalt er lange og tynde, fartøj-lignende strukturer såsom hår eller suturer.
- Beregn længden af fartøjerne og det samlede areal dækket af fartøjer (statistik Billede → Billede → binært billede statistik).
BEMÆRK: Ved beregningen af fartøjets-længder, der er skibe i den resulterende fartøj kort fortyndet på strækninger med en bredde på én pixel 20.
- Analyser den indfødte hudområde under de samme parametre som stilladserne, tildele en værdi på 100% til den native væv og relatere stilladset til denne værdi. For eksempel, hvis procentdelen af hvide pixler er 60% i det normale væv og 30% i stilladset, ville det udgøre en 50% vaskularisering af stilladset. Bemærk: Den hvide fartøjer dækning er tildelt til det område af en firkant omkring stilladset. Justér antallet af hvide pixels dækning OVERVEJEvaskning at cirklens areal er betydeligt mindre (π x R2) end pladsen (4 x R2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der kan skabes en pålidelig bilateral fuld hud defekt i mus (figur 1), hvor huden kan erstattes af et biomateriale under undersøgelse (figur 2). Her er ingen større komplikationer under eller efter den operative procedure, hverken makroskopiske tegn på infektion eller udenlandsk organ reaktion. I sjældne tilfælde, bliver et stillads tabt, når en mus fjerner det. Sårkontraktion blev aldrig observeret (figur 3). Tissue gennemlysning tilladt klar visualisering af vaskulære strukturer på op til 30 um i bredden, i en hel vævsprøve, der omfattede både naturligt forekommende væv og implanterede stilladser (figur 4). Efter digital segmentering, kan fartøjerne let kvantificeres på ønskede tidspunkter efter implantation. For eksempel, 2 uger efter implantation, vaskularisering niveauer af 62,28 ± 8,6% blev observeret (middelværdi ± standardfejl på middelværdien, n = 8) 21. I alt omkring 25 min &# 160; per dyr (2 stilladser) er nødvendige for implantation, 5 min til væv høst og Picturing og 10 min til digital analyse af en prøve. Som et sidste punkt, er denne metode ikke påvirke kvaliteten af det eksplanterede væv til yderligere analyse. For eksempel kan proteiner og RNA-ekstrakter let opnås fra prøven ved standardmetoder.
Figur 1. Fuld huddefekten. Midterlinjen af musens ryg er markeret med en fin spids pen og en biopsitang bruges til at markere området blev defekten vil blive oprettet (A, B, C og D). Når områderne er defineret, er fuld hud fjernes med gængse kirurgiske saks som det ses i nærbillede af præparatet (E og F). En fginal resultat af defekten er vist i (D) og forstørret i (G). Skala søjler repræsenterer 1 cm i ABCD og 5 mm i EFG. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Implantation af stilladset. Forud for implantation af stilladset er et net anbragt i defekten direkte på såret og under sårkanterne (A og B). Næste stilladser er placeret over mesh og sutureres til sårkanterne (C). Endelig er en transparent sårforbinding placeret og sutureres til huden (D). Målestokken repræsenterer 5 mm (A, B, og C) end 1 cm i (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Tissue explantation. Til vævsanalyse fuld hud fra bagsiden af dyret fjernes kirurgisk (A og B) og strakt ud på en petriskål (C). Til gennemlysning huden vendes på hovedet og et digitalt billede er taget (D). Fjernelse af huden ved siden af stilladser er nødvendig for normalisering af vaskularisering data. Skalapanelerne repræsenterer 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. gennemlysning, digital segmentering og kvantificering. Hud væv blev udskåret og det vaskulære netværk inden blev visualiseret ved gennemlysning (øverste billeder) Fuld hud på ryggen (A) og detaljerede områder af det native hud (B) og stilladset (C ) er vist. Pile viser den forstørrede områder i (B) og (C). Hver af de nedre billeder viser resultaterne af den digitale segmenteringsprocessen for billedet placeret direkte ovenfor. Skalapanelerne repræsenterer 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er behov for at etablere vellykkede tilgange til at forbedre blodperfusion i manipuleret væv konstruktioner, som kræver udvikling af nye pålidelige metoder til at studere vaskulariseringen processer inden for biomaterialer. Almindelige metoder til fremstilling stillads vaskularisering ex vivo synlig indbefatter anvendelse af mikroskopi, som giver en høj opløsning værktøj. I de fleste tilfælde, selv om denne metode er begrænset til analyse af små vævs områder, og har tendens til at være dyrt og tidskrævende. Desuden er det ofte indeholder omfattende mærkning og farvningsmetoder, hvor der ikke kan skelnes blod perfunderet skibe fra ikke-funktionelle dem 22. Metoder i brug for at vurdere funktionaliteten af skibe er computertomografi, magnetisk resonans og positron elektron tomografi. Disse metoder har ulemperne ved ekstremt kostbart udstyr og lav opløsning magt 23. En anden almindeligt anvendt strategi for at visualisere vaskularisering eranvendelse af vaskulær kaster efterfulgt af kemisk korrosion af vævet 24. Denne metode gør det muligt at opnå en repræsentativ 3D-struktur af det vaskulære netværk, men resultaterne kraftigt varierer afhængigt af størrelsen af kunstig perfusion og væv kan ikke anvendes til yderligere biokemiske undersøgelser, såsom protein eller RNA-analyse. Kylling chorioallantoisk membran (CAM) model 25 og skinfold kammer modellen i gnavere 26,27 har vist sig at være effektive metoder til at analysere angiogenese, kapillær perfusion og blodgennemstrømningen. For nylig har skinfold kammer modellen også blevet anvendt til vævsdyrkningsapplikationer evaluerer MSC-baserede vaskularisering strategier i porøse polyurethan stilladser 28. Disse metoder er til stede vigtige fordele til in vivo billeddannelse og repræsentere et attraktivt mål for den her beskrevne metode.
Modellen præsenteres her blev udviklet til at afhjælpe manglerne i den metoder mble- vet ovenfor. Drage fordel af de unikke iboende egenskaber i huden, er fuld defekter oprettet og bruges til at evaluere vaskularisering af biomaterialer. Hud er et eksternt organ, som letter visualisering og manipulation af vævet. På grund af sin store overflade og homogen struktur, kan skabes flere mangler, der gør interne sammenligninger muligt, samtidig med at mindske antallet af dyr til undersøgelsen. På grund af den anteriore-posteriore symmetri af dyret, er bilaterale defekter foreslog imidlertid; indflydelsen af systemiske virkninger bør overvejes, når begge sider i forhold til hinanden. Endelig hud er en forholdsvis gennemsigtige væv, der repræsenterer en optimal orgel valg for gennemlysning. Selv om den her beskrevne metode er velegnet til mange forskellige indfødte væv og flere biomaterialer blev denne protokol oprindelig oprettet for at blive brugt med et dobbelt lag collagen-baserede stillads, der er FDA-godkendt og klinisk anvendt til dermal reparation. En vigtig forudsætning for gennemførelsen af denne metode er, at stilladset skal være delvist gennemsigtige. Afhængig af den valgte stillads materiale, kan nogle tilpasning af protokollen være påkrævet. Tidligere har vores gruppe brugt modellen til at vise, hvordan anvendelsen af humane mesenchymalceller til stilladser øger deres vaskularisering 29.
En standard digital kamera og en lyskilde er tilstrækkelige til visualisering af det vaskulære netværk, som kan kvantificeres gennem fri software. Den semiautomatisk segmentering af billederne fra VesSeg-værktøjet består af to trin. I det første trin, tages billedet fra det vaskulære netværk er kontrasten forbedret fører til et fartøj kort. Derefter segmentering algoritme vælger fartøjets områder, og endelig er forslaget segmentering præsenteret som et billede (Figur 4) 30. I et andet behandlingstrin, ved hjælp af den kendsgerning, at fartøjerne er tilsluttet structures (hvilket betyder, at fartøjsejere pixel hænge sammen rumligt), er en anden segmentering bruges til at vælge fra det første kun de sande fartøj pixels, og alle sande fartøj pixels. Derfor er en endelige etiket af "en" tildeles kun til de lave tillid fartøj pixel fra det første billede, der er forbundet via en kæde af naboer til en høj tillid fartøj pixel i det andet billede.
Da ingen kemiske tilsætningsstoffer er nødvendig, er denne fremgangsmåde også omkostningseffektiv. Digital analyse viser en god reproducerbarhed ved fastsættelsen fartøjets dimensioner, intravaskulære afstande, antal forgrening point, vaskulariserede område og samlede længde af vaskulære netværk. Vi har tidligere vist, at blodkarret netværk kan bedre visualiseres ved gennemlysning end ved radio-angiografiske undersøgelser 31. Tilstedeværelsen af titan mesh har en dobbelt funktion. På den ene side forhindrer sårkontraktion, som er en almindelig ulempe ved brug af musen til models; på den anden side giver det en fysisk grænse mellem stilladset og sårbunden. Fordi de fleste stilladser er biologisk nedbrydelige, sidstnævnte funktion er afgørende for fysisk afgrænser grænsen mellem stillads og sårbunden ved høst af stilladser. Blandt de største ulemper ved denne fremgangsmåde er behovet for eksplantation stilladserne og dermed begrænse analysen til en enkelt tidspunkt; således den dynamiske observation af vaskularisering er ikke muligt med den aktuelle indstilling. Et andet problem er, at denne metode er begrænset til halvgennemsigtige biomaterialer, der tillader gennemlysning. Endelig, selv om operationen proceduren ikke kræver særlige kirurgiske færdigheder, en indlæringskurve på omkring 6 - 12 betjente dyr skal anses for at mestre den metode korrekt.
Vi introducerer en tid og omkostningseffektiv tilgang, der tillader høj opløsning visualisering og kvantificering af vaskulære strukturer, Representing en ideel metode til at sammenligne vaskularisering i forskellige biomaterialer eller forskellige stillads-bioaktivering strategier. Denne metode er let at etablere og kræver ikke særligt udstyr. Et centralt element i denne model er, at efter fartøj visualisering, væv kan yderligere bruges til undersøgelser såsom histologisk eller molekylær analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Erklæring om interessekonflikt:
Alle forfattere: Ingen
Økonomiske oplysninger:
Ingen af forfatterne har en økonomisk interesse i nogen af de produkter, enheder eller narkotika, der er nævnt i dette manuskript.
Acknowledgments
Integra dermal regenerering skabelon er venligst leveret af Integra LifeSciences Corporation. Kilder til midlerne til støtte for arbejdet: Dette arbejde blev delvist finansieret af CIRM-BMBF Tidlig Translationel II Award og FONDAP Center for Genome regulering både JTE (Nr 15090007.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 | Ethicon, Norderstedt, Germany | 698G | Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture |
| Biopsy punches (10 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1050 | |
| Biopsy punches (12 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1250 | |
| Digital camera | Ricoh, Hannover, Germany | Cx1 | |
| Gazin Mullkompresse | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany | 13622 | Sterile gauze (10 cm x 10 cm) |
| Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10') | Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA | 88101 | |
| Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia | Baxter, Unterschleissheim, Germany | 100196040 | |
| Pentobarbital, 16 g / 100 ml | Fa. Merial, Hallbergmoos | ||
| Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu | Charles River, Sulzfeld, Germany | Strain code 088 | Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g |
| Buprenorphine (0.3 mg/ml) | Essex Pharma GmbH, Munich, Germany | ||
| Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight | PFM Medical AG, Köln, Germany | 6000029 | |
| Tissucol Duo S Immuno 2 ml | Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany | B1332020110614 | Fibrin-thrombin solution |
| Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm) | KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK | M6275009/10 |
References
- Rahaman, M. N., Mao, J. J. Stem cell-based composite tissue constructs for regenerative medicine. Biotechnology and Bioengineering. 91 (3), 261-284 (2005).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23, 47-55 (2005).
- Machens, H. G., Berger, A. C., Mailaender, P. Bioartificial skin. Cells Tissues Organs. 167, 88-94 (2000).
- Priya, S. G., Jungvid, H., Kumar, A. Skin tissue engineering for tissue repair and regeneration. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 105-118 (2008).
- Papavasiliou, G., Cheng, M. H., Brey, E. M. Strategies for vascularization of polymer scaffolds. Journal of Investigative Medicine. 58 (7), 838-844 (2010).
- Laschke, M. W., et al. Angiogenesis in tissue engineering: breathing life into constructed tissue substitutes. Tissue Engineering. 12, 2093-2104 (2006).
- Zhong, S. P., Zhang, Y. Z., Lim, C. T. Tissue scaffolds for skin wound healing and dermal reconstruction. Wiley Interdisciplinary Reviews Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 510-525 (2010).
- Liu, G., Zhang, Y., Liu, B., Sun, J., Li, W., Cui, L. Bone regeneration in a canine cranial model using allogeneic adipose derived stem cells and coral scaffold. Biomaterials. 34 (11), 2655-2664 (2013).
- Hansson, A., Di Francesco, T., Falson, F., Rousselle, P., Jordan, O., Borchard, G. Preparation and evaluation of nanoparticles for directed tissue engineering. International Journal of Pharmaceutics. 439 (1-2), 73-80 (2012).
- Sarkar, S. D., Farrugia, B. L., Dargaville, T. R., Dhara, S. Chitosan-collagen scaffolds with nano/microfibrous architecture for skin tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 18, (2013).
- Wang, X., et al. The roles of knitted mesh-reinforced collagen-chitosan hybrid scaffold in the one-step repair of full-thickness skin defects in rats. Acta Biomaterials. 9 (8), 7822-7832 (2013).
- Rizzi, S. C., Upton, Z., Bott, K., Dargaville, T. R. Recent advances in dermal wound healing: biomedical device approaches. Expert Review of Medical Devices. 1, 143-154 (2010).
- des Rieux, A., et al. 3D systems delivering VEGF to promote angiogenesis for tissue engineering. Journal of Controlled Release. 150, 272-278 (2011).
- Reckhenrich, A. K., et al. Bioactivation of dermal scaffolds with a non-viral copolymer-protected gene vector. Biomaterials. 32, 1996-2003 (2011).
- Chen, J., et al. The Key Regulatory Roles of the PI3K/Akt Signaling Pathway in the Functionalities of Mesenchymal Stem Cells and Applications in Tissue Regeneration. Tissue Engineering Part B Rev. 19, 516-528 (2013).
- Fedorovich, N. E., et al. The role of endothelial progenitor cells in prevascularized bone tissue engineering: development of heterogenous constructs. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2355-2367 (2010).
- Wang, L., et al. Osteogenesis and angiogenesis of tissue-engineered bone constructed by prevascularized β-tricalcium phosphate scaffold and mesenchymal stem cells. Biomaterials. 36, 9452-9461 (2010).
- Cuadra, A., et al. Functional results of burned hands treated with Integra. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (2), 228-234 (2012).
- Wilcke, I., et al. VEGF(165) and bFGF protein-based therapy in a slow release system to improve angiogenesis in a bioartificial dermal substitute in vitro and in vivo. Langenbecks Arch Surg. 392 (3), 305-314 (2007).
- Condurache, A., Aach, T., Grzybowsky, S., Machens, H. G. Vessel segmentation and analysis in laboratory skin transplant micro-angiograms. Proceedings of the Eighteenth IEEE Symposium on Computer-Based Medical Systems. , 21-26 (2005).
- Danner, S., et al. The use of human sweat gland-derived stem cells for enhancing vascularization during dermal regeneration. Journal of Investigative Dermatology. 132 (6), 1707-1716 (2012).
- Shaterian, A., et al. Real Time Analysis of the Kinetics of Angiogenesis and Vascular Permeability in an Animal Model of Wound Healing. Burns. 35 (6), 811-817 (2009).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nature Medicine. 9 (6), 713-725 (2003).
- Bergeron, L., Tang, M., Morris, S. F. A review of vascular injection techniques for the study of perforator flaps. Plastic and Reconstructive Surgery. 117, 2050-2057 (2006).
- Schlatter, P., König, M. F., Karlsson, L. M., Burri, P. H. Quantitative study of intussusceptive capillary growth in the chorioallantoic membrane (CAM) of the chicken embryo. Microvascular Research. 54 (1), 65-73 (1997).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. American Journal of Pathology. 143 (4), 1055-1062 (1993).
- Menger, M. D., Jäger, S., Walter, P., Hammersen, F., Messmer, K. A novel technique for studies on the microvasculature of transplanted islets of Langerhans in vivo. International journal of microcirculation, clinical and experimental. 9 (1), 103-117 (1990).
- Laschke, M. W., et al. Three-dimensional spheroids of adipose-derived mesenchymal stem cells are potent initiators of blood vessel formation in porous polyurethane scaffolds. Acta Biomaterials. 9 (6), 6876-6884 (2013).
- Egaña, J. T., et al. Use of human mesenchymal cells to improve vascularization in a mouse model for scaffold-based dermal regeneration. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1191-1200 (2009).
- Condurache, A., Aach, T. Vessel segmentation in angiograms using hysteresis thresholding. Proceedings of the Ninth IAPR Conference on Machine Vision Applications. , 269-272 (2005).
- Egaña, J. T., et al. Ex vivo method to visualize and quantify vascular networks in native and tissue engineered skin. Langenbecks Archives of Surgery. 394, 349-356 (2009).
