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Bioengineering

एक पूर्ण त्वचा दोष मॉडल बायोमैटिरियल्स vascularization का मूल्यांकन करने के लिए Published: August 28, 2014 doi: 10.3791/51428
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 1, 1,4
1Department of Plastic Surgery and Hand Surgery, University Hospital rechts der Isar, Technische Universität München, 2Institute for Signal Processing, University of Lübeck, 3Department of Plastic Surgery and Hand Surgery, University Hospital Zürich, 4FONDAP Center for Genome Regulation, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile

Summary

Vascularization सफल ऊतक इंजीनियरिंग में दृष्टिकोण की कुंजी है. इसलिए, विश्वसनीय प्रौद्योगिकियों ऊतक निर्माणों में संवहनी नेटवर्क के विकास का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक हैं. यहाँ हम कल्पना और इन विवो में vascularization यों के लिए एक सरल और लागत प्रभावी तरीका मौजूद है.

Abstract

अपर्याप्त vascularization ऊतक इंजीनियर निर्माणों के नैदानिक ​​सफलता सीमित मुख्य कारकों में से एक माना जाता है. Vascularization में सुधार लाने के उद्देश्य कि नई रणनीति का मूल्यांकन करने के लिए, विश्वसनीय तरीकों दिखाई जैव कृत्रिम scaffolds में नए रक्त वाहिकाओं के में वृद्धि करने के लिए और परिणाम यों के लिए आवश्यक हैं. वर्ष के पिछले कुछ अधिक है, हमारे समूह transillumination द्वारा रक्त वाहिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य सक्षम बनाता है और डिजिटल विभाजन के माध्यम से गुणात्मक रूप से संभावना प्रदान करता है कि एक पूर्ण त्वचा दोष मॉडल पेश किया है. इस मॉडल में, एक शल्य चिकित्सा चूहों की पीठ में पूर्ण त्वचा दोष बनाता है और जांच की सामग्री के साथ उन्हें बदल देता है. अणु या ब्याज की कोशिकाओं को भी उनके संभावित प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस तरह की सामग्री में शामिल किया जा सकता है. एक की अपनी पसंद का एक अवलोकन समय के बाद, सामग्री मूल्यांकन के लिए explanted रहे हैं. द्विपक्षीय घाव वें आंतरिक तुलना करने की संभावना प्रदानपर अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या कम की है और साथ ही व्यक्तियों के बीच कलाकृतियों को कम. अन्य तरीकों की तुलना में, हमारे विधि एक सरल, विश्वसनीय और लागत प्रभावी विश्लेषण प्रदान करता है. हम अलग अलग biomaterials और जैव सक्रियण दृष्टिकोण का vascularization परीक्षण जब उच्च संकल्प स्क्रीनिंग प्रदर्शन करने के लिए एक नियमित उपकरण के रूप में इस मॉडल को लागू किया है.

Introduction

हाल के दशकों में, ऊतक इंजीनियरिंग शरीर की अपनी कोशिकाओं 1 के साथ ऊतक दोषों को बदलने के लिए एक नई चिकित्सकीय विकल्प खोल दिया है. ऊतक उत्थान की शारीरिक प्रक्रिया का समर्थन करने के लिए, scaffolds के घाव बिस्तर से कोशिकाओं के विकास और दोष 2,3 बहाल कर सकते हैं, जहां एक परिदृश्य प्रदान करता है कि एक biodegradable संरचना, के रूप में तैयार कर रहे हैं.

अपर्याप्त vascularization bioartificial scaffolds 4 के नैदानिक ​​सफलता वापस रखती है जो मुख्य बाधा, माना जाता है. कोशिकाओं के कुदी तसवीर की छाप के साथ, पोषक तत्वों और ऑक्सीजन बढ़ जाती है और सामग्री की vascularization के लिए मांग आवश्यक हो जाता है. अपर्याप्त या देरी vascularization इसलिए ऊतक इंजीनियर उत्पादों 5 की केंद्रीय गल जाना हो सकता है. इसके अलावा, रक्त वाहिकाओं प्रतिरक्षा सक्षम कोशिकाओं प्रदान और Regenerating क्षेत्र में चयापचय अवशेषों को हटा दें. उच्च संक्रमण दर और कम उत्थान ही हैंउद्देश्य से कर रहे हैं जो ऊतक इंजीनियरिंग में मनाया अपर्याप्त रक्त छिड़काव के परिणामों के कुछ scaffolds 6,7 के vascularization में वृद्धि से बचा जा सके.

Biomaterial ही है और पाड़ के microstructure की महत्वपूर्ण भूमिका पर vascularization ध्यान केंद्रित में सुधार लाने के उद्देश्य है कि कई रणनीतियों. 8,9 बहाल हो जिससे (पुनः), उत्थान के लिए मरम्मत से घाव भरने की प्रक्रिया स्थानांतरण एक के सबसे करीब शारीरिक गुणों के साथ एक ऊतक पैदा करने में नए तरीकों को विकसित करने के लिए गहन अनुसंधान प्रयासों रहे हैं. उनके पुनर्योजी क्षमता के संबंध में अध्ययन किया है और मूल्यांकन किया गया कि बायोमैटिरियल्स कोलेजन, आतंच, chitosan और alginate 10,11 शामिल थे. ये biomaterials इस्तेमाल किया और इस तरह के ऊतक decellularization, आत्म विधानसभा, रैपिड प्रोटोटाइप के रूप में विभिन्न रणनीतियों का उपयोग नए scaffolds के निर्माण और 12 electrospinning के लिए एक आधार के रूप में जोड़ा जा सकता है. Enh करने के क्रम मेंशरीर की अपनी पुनर्योजी क्षमता मंजूरी, scaffolds bioactivated किया जा सकता है. पुनः संयोजक वाहिकाजनक विकास का समावेश जैसे कारकों 14 के लिए एन्कोडिंग 13 या जीन वैक्टर पाड़ की vascularization में सुधार करने के लिए दिखाया गया है कारकों. स्टेम कोशिकाओं का उपयोग व्यापक रूप से mesenchymal stromal कोशिकाओं और endothelial पूर्वज कोशिकाओं सबसे ज्यादा ध्यान 15,16 प्राप्त की है जहां vascularization, सुधार करने के लिए एक आशाजनक रणनीति होना दिखाया गया है. अन्य दृष्टिकोण प्रत्यारोपण 17 से पहले पूर्वनिर्मित पोत नेटवर्क होते हैं कि निर्माणों का निर्माण करने का प्रयास. गहन पाड़ डिजाइन में प्रयासों और उनकी जैव सक्रियण के बावजूद कोई रणनीति भारी जला चोटों में चमड़े का प्रतिस्थापन के अपवाद के साथ, एक चिकित्सकीय महत्वपूर्ण स्तर पर vascularization सुधार और है, नैदानिक ​​दिनचर्या में bioengineered सामग्री का अनुवाद केवल हिचहिचाकर 18 जगह ले जा रहा है .

कारणों में से एक क्यों vascularizationकृत्रिम ऊतक निर्माणों की, अभी भी एक अनसुलझी समस्या है इन विवो दृष्टिकोण में नई प्रौद्योगिकियों की सफलता का मूल्यांकन करने में कठिनाई है. इन विट्रो प्रयोगों scaffolds के vascularization क्षमता की महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, उपयुक्त पशु मॉडल ऐसी सामग्री की biocompatibility, विशेष महत्व की सुरक्षा और प्रभावकारिता उपचार की और,, ऊतक के vascularization के रूप में मुख्य मापदंडों का अध्ययन करने के लिए आवश्यक हैं निर्माण. इसलिए, विश्वसनीय उपकरण कल्पना और रक्त वाहिका नेटवर्क विवो में जरूरी है यों.

इस अध्ययन में हम explanted scaffolds के अंदर संवहनी नेटवर्क के दृश्य और मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है कि एक सरल और विश्वसनीय तरीका मौजूद है. इस विधि ऊतक transillumination और डिजिटल विभाजन पर आधारित है. इस विधि गैर इनवेसिव है, यह लक्ष्य सामग्री के आगे आणविक और histological विश्लेषण की अनुमति देता है.

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Protocol

Scaffolds के 1. तैयारी

  1. 12 मिमी बायोप्सी घूंसे का उपयोग कर scaffolds के नमूने उत्पन्न करता है.
  2. , पाड़ में bioactive अणुओं या कोशिकाओं परिचय धीरे एक बाँझ धुंध के साथ उन्हें फैलाएंगे द्वारा scaffolds के निकास के लिए. फिर bioactive अणु या ब्याज की कोशिकाओं से युक्त एक समाधान के 160 μl जोड़कर scaffolds rehydrate. दोबारा जाँच करें ऐसे MTT assays के रूप चयापचय assays के माध्यम से कोशिकाओं के साथ bioactivation की सफलता.
  3. यदि आवश्यक हो कदम 1.2 में वर्णित के रूप में, पुनर्जलीकरण के माध्यम से फिर से, एक आतंच थ्रोम्बिन समाधान या एक हाइड्रोजेल में उदाहरण के लिए, उन्हें देने से यौगिकों या कोशिकाओं पाड़ के अंदर परीक्षण किया जाना तय.
    नोट: यौगिकों या कोशिकाओं यंत्रवत् सामग्री को देते नहीं है जब यह कदम मददगार हो सकता है. एक भी यौगिकों की रिहाई की गतिशीलता को नियंत्रित कर सकते हैं ..
  4. Cuttin से, हर प्रयोग और नियंत्रण समूह में प्रत्येक पाड़ के तहत रखा जाएगा जो titanized meshes, तैयारजी बाहर दौर आकार के टुकड़े, व्यास में लगभग 14 मिमी.
    नोट: titanized जाल घाव बिस्तर से पुनर्जीवित ऊतक परिसीमित करने के लिए आवश्यक एक भौतिक सीमा के रूप में काम करता है.

2 पशु

  1. प्रस्तुत मॉडल के कार्यान्वयन से पहले, इसी पशु संरक्षण कानून परामर्श और स्थानीय अधिकारियों से अनुमति प्राप्त करते हैं. इस काम में, सभी प्रयोगों वर्तमान जर्मन पशु कल्याण अधिनियम के अनुसार, चूहों के साथ प्रदर्शन किया गया और ऊपरी बवेरिया की जिला सरकार (Regierung वॉन Oberbayern) ने मंजूरी दे दी.
  2. ध्यान से पशु और तनाव का चयन करें. मॉडल चूहों के लिए स्थापित किया गया था हालांकि, यह इस तरह के चूहे, खरगोश या सूअर के रूप में अन्य आम जानवरों, के लिए अनुवाद किया जा सकता है.
  3. आप furred जानवरों के साथ काम कर रहे हैं मामले में, scaffolds के आरोपण से पहले जानवरों के पीछे दाढ़ी.
    नोट: यह काम 20 ग्राम और 25 ग्राम, हालांकि अलग अलग उम्र और ख के बीच एक शरीर के वजन के साथ उम्र के 6 से 8 सप्ताह के चूहों का उपयोग करता हैODY वजन भी इस्तेमाल किया जा सकता है.

3 संज्ञाहरण

  1. बाँझ शर्तों के तहत आपरेशन आचरण. जानवर की सामान्य शरीर के तापमान को बनाए रखने के क्रम में, एक वार्मिंग चटाई का उपयोग करें.
  2. संज्ञाहरण inhalative से पहले जानवरों / किलो वजन 0.05-0.1 मिलीग्राम, subcutaneously हर 8 घंटे की एक खुराक पर Buprenorphin प्राप्त करते हैं.
  3. Inhalative संज्ञाहरण (isoflurane) के तहत पशु रखें या समकक्ष मानक प्रक्रियाओं को लागू करें. धीरे जानवर के पैर की उंगलियों फैलाएंगे द्वारा या एक त्वचा चुटकी के माध्यम से या तो संज्ञाहरण की पुष्टि करें.
  4. , Exsiccosis रोकने के ऑपरेशन की शुरुआत में 0.5 मिलीलीटर शारीरिक खारा समाधान subcutaneously इंजेक्षन.

त्वचा की 4 छांटना

  1. एक प्रवण स्थिति में पशु प्लेस और एक ठीक टिप स्थायी कलम (चित्रा 1 ए) के साथ माउस की पीठ के midline निशान.
  2. छांटना क्षेत्र को परिभाषित करें. Figu में दिखाया क्षेत्र में दोष रखें1C रहे हैं. दोष भी दुमदारी रखा जाता है, तो जानवरों ड्रेसिंग और scaffolds को दूर करने के लिए प्रवण हैं कि ध्यान दें.
  3. एक 10 मिमी बायोप्सी पंच (चित्रा 1 बी) का उपयोग द्विपक्षीय दोष दौर बनाएँ. पंच ध्यान से त्वचा के खिलाफ मजबूर किया जाना चाहिए और त्वचा के माध्यम से पूरी तरह से कटौती करने के लिए, लेकिन छांटना क्षेत्र (आंकड़े 1C और 1E) चित्रित करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए.
  4. धीरे संदंश के साथ चिह्नित त्वचा लिफ्ट बंद और ठीक शल्य कैंची (चित्रा 1F) का उपयोग कर के रूप में चिह्नित सर्कल साथ काटकर अलग कर देना. रक्तस्राव के मामले में सावधानी से बाँझ धुंध के साथ सेक. छांटना के एक कदम दर कदम विवरण चित्र 1 में दिखाया गया है.
    नोट: दोष के कारण त्वचा लोच को दोष की वृद्धि की भरपाई के लिए, scaffolds पैदा करने के लिए एक से एक छोटे पंच के साथ बनाई गई है.

5 पाड़ आरोपण

  1. Tita के लिए जगह बनाने के लिए आदेश मेंnized, जाल 2-4 मिमी (2A चित्रा) के लिए घाव सीमाओं पर त्वचा और अंतर्निहित ऊतक की जुदाई का विस्तार.
  2. सीधे घाव बिस्तर पर और घाव किनारों (आंकड़े 2A और बी) के तहत दोष में जाल titanized रखें.
  3. जगह सीधे जाल से अधिक scaffolds.
  4. थोड़ा पाड़ (चित्रा -2) पर किनारों छोड़ने, 4 से 6 एकल गांठ के साथ सटे घाव किनारों को scaffolds सीवन.
    नोट: biodegradable टांके के प्रयोग से बचें.
  5. घाव क्षेत्र (चित्रा 2 डी) की निगरानी की अनुमति है जबकि पाड़ की रक्षा के लिए दोष ऊपर ड्रेसिंग एक पारदर्शी घाव सीवन.

6 पश्चात की देखभाल

  1. ड्रेसिंग और scaffolds के आपसी हेरफेर से बचने के लिए पिंजरे प्रति एक माउस रखें.
  2. देख मोटर गतिविधि, शरीर के वजन, दर्द के लक्षण, सहिष्णुता से एक दैनिक आधार पर पशु की सामान्य स्थिति का मूल्यांकनड्रेसिंग और ऑटो विकृति को. इसके अलावा खून बह रहा है, स्थानीय और संक्रमण के प्रणालीगत लक्षण और ड्रेसिंग की स्थिति के लिए घाव क्षेत्र की निगरानी.
  3. पशु के दर्द को कम करने के लिए, 0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा वजन या समकक्ष एनाल्जेसिक दवा की एक खुराक में दैनिक Buprenorphin इंजेक्षन.
  4. माउस घाव ड्रेसिंग निकालता है या नुकसान हैं, जगह या संज्ञाहरण के तहत यह पुनः अनुलग्न.

पाड़ के 7 इच्छामृत्यु और Explantation

  1. वांछित समय बिंदुओं पर, pentobarbital (150 मिलीग्राम / किग्रा) के overdoses द्वारा पशुओं का बलिदान.
  2. Scaffolds और संभव (चित्रा 3) के रूप में वापस माउस त्वचा के रूप में ज्यादा शामिल करना चाहिए जो एक स्थायी मार्कर के साथ त्वचा छांटना की साइट निशान.
  3. कैंची या एक स्केलपेल की एक जोड़ी के साथ चिह्नित लाइनों के साथ त्वचा काटकर अलग कर देना. (कुंद तैयारी के माध्यम से अंतर्निहित ऊतक से, फाई scaffolds और titanized जाल सहित पूरे त्वचा, अलग करेंgure 3 बी).
  4. एक पेट्री डिश पर बाहर फैला explanted ऊतक प्लेस (चित्रा -3 सी और डी)

संवहनी नेटवर्क के 8 दृश्य और मात्रा का ठहराव

  1. Transillumination:
    1. सफेद प्रकाश (100 वाट मानक प्रकाश बल्ब) का एक मजबूत स्रोत के ऊपर एक पेट्री डिश बढ़ते द्वारा, एक transillumination उपकरण स्थापित करें.
    2. डिजिटल चित्र प्राप्त करने के लिए transilluminator ऊपर एक डिजिटल कैमरा को ठीक करें.
    3. उल्टा transillumination डिवाइस पर पेट्री डिश पर नमूने रखें.
    4. सामान्य त्वचा के लिए समान रूप से आकार के क्षेत्रों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मैक्रो मोड में पूरा scaffolds की तस्वीरें ले लो. आगे डिजिटल विश्लेषण के लिए एक झगड़ा प्रारूप में छवियों की दुकान.
    5. आगे जैव रासायनिक या ऊतकीय विश्लेषण के लिए ऊतक को बचाओ.
  2. डिजिटल विभाजन और मात्रा का ठहराव:
    1. Fr प्राप्त किया जा सकता है जो VesSeg-उपकरण सॉफ्टवेयर डाउनलोड और स्थापित: पर आरोप के ईई http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
    2. VesSeg-उपकरण सॉफ्टवेयर के साथ तस्वीर खोलें.
    3. डिजिटल विश्लेषण (चयन → छवि) के लिए पाड़ द्वारा कवर छवि के क्षेत्र का चयन करें.
    4. विकल्प "हिस्टैरिसीस thresholding" (गणना पोत वृद्धि → शीर्ष टोपी परिवर्तन → छवि → पोत वृद्धि फिल्टर → हिस्टैरिसीस thresholding) का उपयोग वाहिकाओं के विपरीत बढ़ाने के लिए.
    5. पोत मानचित्र (छवि → पोत वृद्धि फिल्टर → हिस्टैरिसीस thresholding → थ्रेसहोल्ड सीमाओं) के विभाजन के साथ आगे बढ़ें. पहले सीमा ("पोत कवरेज"), तो भी दूर पोत की तरह है जो हर पिक्सेल, पोत के रूप में चिह्नित किया जाएगा चुनें. , विशेष रूप से पोत की तरह जहाजों के रूप में चिह्नित किया जाएगा ताकि केवल उन पिक्सल दूसरे दहलीज ("पृष्ठभूमि कवरेज") का चयन करें.
    6. गैर कब्जा कर लिया जहाजों को जोड़ने के लिए और आम तौर पर इस तरह के बाल या टांके के रूप में लंबी और पतली, पोत संरचनाओं की तरह हैं जो आम झूठी सकारात्मक संरचनाओं, खत्म करने के लिए मैन्युअल स्वचालित विभाजन प्रस्ताव की जाँच करें.
    7. जहाजों की लंबाई और (बाइनरी छवि आंकड़े → छवि → छवि सांख्यिकी) जहाजों द्वारा कवर समग्र क्षेत्र की गणना.
      नोट: पोत लंबाई की गणना के लिए, जिसके परिणामस्वरूप पोत मानचित्र में जहाजों एक पिक्सेल 20 की चौड़ाई के साथ लाइनों को पतला कर रहे हैं.
  3. देशी ऊतक के लिए 100% की एक मूल्य बताए, scaffolds के रूप में एक ही मापदंड के तहत देशी त्वचा क्षेत्र का विश्लेषण और कहा कि मूल्य के लिए पाड़ संबंधित हैं. सफेद पिक्सल का प्रतिशत सामान्य ऊतकों में 60% और पाड़ में 30% है अगर उदाहरण के लिए, यह पाड़ की एक 50% vascularization का प्रतिनिधित्व करेंगे. नोट: सफेद जहाजों कवरेज पाड़ के चारों ओर एक वर्ग के क्षेत्र को सौंपा है. सफेद पिक्सल कवरेज consi की संख्या को समायोजित करेंवृत्त के क्षेत्रफल वर्ग (4 एक्स 2 आर) की तुलना में काफी छोटे (π एक्स आर 2) है कि DERING.

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Representative Results

एक विश्वसनीय द्विपक्षीय पूर्ण त्वचा दोष त्वचा अध्ययन (चित्रा 2) के तहत एक biomaterial द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है जहां माउस (चित्रा 1) में बनाया जा सकता है. यहाँ, कोई बड़ी जटिलताओं संक्रमण या विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया की, न तो स्थूल संकेत दौरान या ऑपरेटिव प्रक्रिया के बाद मनाया जाता है. एक माउस इसे हटा जब दुर्लभ मामलों में, एक पाड़ खो जाता है. घाव संकुचन (चित्रा 3) कभी नहीं देखा गया था. ऊतक transillumination दोनों, देशी ऊतक और प्रत्यारोपित scaffolds (चित्रा 4) शामिल है कि एक पूरे के ऊतक के नमूने में, चौड़ाई में 30 माइक्रोन से संवहनी संरचनाओं के स्पष्ट दृश्य की अनुमति दी. वांछित बार आरोपण पद पर डिजिटल विभाजन के बाद, बर्तन आसानी से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, 2 सप्ताह आरोपण के बाद, 62.28 ± 8.6% की vascularization स्तरों मनाया गया (मतलब की मानक त्रुटि ± मतलब, n = 8) 21. कुल मिलाकर, के बारे में 25 मिनट और# 160; पशु प्रति (2 scaffolds) आरोपण के लिए आवश्यक हैं, ऊतक कटाई और चित्र और एक नमूना के डिजिटल विश्लेषण के लिए 10 मिनट के लिए 5 मिनट. एक अंतिम बिंदु के रूप में, इस विधि आगे के विश्लेषण के लिए explanted ऊतकों की गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करता है. उदाहरण के लिए, प्रोटीन और शाही सेना के अर्क आसानी से मानक तरीकों से नमूना से प्राप्त किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 पूर्ण त्वचा दोष. माउस की पीठ के midline एक ठीक टिप कलम के साथ चिह्नित है और एक बायोप्सी पंच दोष (ए, बी, सी और डी) बनाया जाएगा थे क्षेत्र चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. क्षेत्रों परिभाषित कर रहे हैं एक बार तैयारी (ई और एफ) के निकट अप के रूप में देखा, पूर्ण त्वचा मानक शल्य कैंची से निकाल दिया जाता है. एक चदोष के inal परिणाम (डी) में दिखाया गया है और (छ) में बढ़ाया है. स्केल सलाखों एबीसीडी में 1 सेमी और EFG में 5 मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा पाड़ की 2 आरोपण. पाड़ के आरोपण से पहले, एक जाल सीधे घाव बिस्तर पर और घाव किनारों (ए और बी) के तहत दोष में रखा गया है. अगला scaffolds के जाल के ऊपर रखा और घाव किनारों (सी) के लिए sutured रहे हैं. अंत में, एक पारदर्शी घाव ड्रेसिंग रखा और त्वचा (डी) को sutured है. स्केल बार (ए, बी, और सी) एक में 5 मिमी का प्रतिनिधित्व करता हैडी (डी) में 1 सेमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3 ऊतक explantation. ऊतक विश्लेषण के लिए पशु के पीछे से पूरा त्वचा शल्य चिकित्सा (ए और बी) निकाल दिया जाता है और एक पेट्री डिश (सी) पर बाहर फैला. Transillumination के लिए त्वचा उल्टा हो गया है और एक डिजिटल चित्र (डी) लिया जाता है. Scaffolds के बगल में त्वचा को हटाने vascularization डेटा को सामान्य बनाने के लिए आवश्यक है. स्केल सलाखों 1 सेमी का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.


चित्रा 4 transillumination, डिजिटल विभाजन और मात्रा का ठहराव. त्वचा के ऊतकों excised था और transillumination (ऊपरी चित्र) देशी त्वचा (बी) और पाड़ की पीठ (ए) और विस्तृत क्षेत्रों की पूरी त्वचा द्वारा कल्पना की गई थी भीतर संवहनी नेटवर्क (सी ) दिखाए जाते हैं. तीर बढ़ाया (बी) में क्षेत्रों और (सी) दिखा. कम चित्रों में से प्रत्येक सीधे ऊपर स्थित तस्वीर के लिए डिजिटल विभाजन प्रक्रिया के परिणामों से पता चलता है. स्केल सलाखों 5 मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

Biomaterials के भीतर vascularization प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए नए विश्वसनीय तरीकों के विकास की मांग जो ऊतक इंजीनियर निर्माणों में रक्त छिड़काव, में सुधार लाने में सफल दृष्टिकोण स्थापित करने की आवश्यकता है. पूर्व vivo दिखाई पाड़ vascularization बनाने के लिए आम तरीकों एक उच्च संकल्प उपकरण प्रदान करता है जो माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं, शामिल हैं. ज्यादातर मामलों में, हालांकि, इस पद्धति छोटे ऊतक क्षेत्रों का विश्लेषण करने के लिए सीमित है और महंगी और समय लेने वाली हो जाता है. इसके अलावा, यह अक्सर खून perfused जहाजों गैर कार्यात्मक वाले 22 से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है, जहां व्यापक लेबलिंग और धुंधला तरीकों, शामिल हैं. उपयोग में तरीके जहाजों की कार्यक्षमता कंप्यूटर टोमोग्राफी, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग और पोजीट्रान इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी हैं मूल्यांकन करने के लिए. इन विधियों बहुत महंगा उपकरण और कम संकल्प शक्ति 23 की कमियां हैं. Vascularization कल्पना करने के लिए एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया रणनीति हैनाड़ी का उपयोग ऊतक 24 के रासायनिक जंग द्वारा पीछा डाले. इस विधि संवहनी नेटवर्क के एक प्रतिनिधि के 3 डी संरचना प्राप्त करने के लिए यह संभव बनाता है, लेकिन परिणाम जोरदार कृत्रिम छिड़काव और ऊतकों के स्तर के आधार पर इस तरह के प्रोटीन या शाही सेना विश्लेषण के रूप में आगे जैव रासायनिक अध्ययन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता बदलती हैं. चिकन chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) मॉडल 25 और कृन्तकों 26,27 में skinfold चैम्बर मॉडल angiogenesis, केशिका छिड़काव और रक्त प्रवाह का विश्लेषण करने के लिए प्रभावी तरीकों होने का पता चला है. हाल ही में, skinfold चैम्बर मॉडल भी झरझरा polyurethane scaffolds के 28 में एमएससी आधारित vascularization रणनीतियों का मूल्यांकन ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है. Vivo इमेजिंग के लिए इन तरीकों मौजूद महत्वपूर्ण लाभ और यहां वर्णित विधि के लिए एक आकर्षक लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं.

यहाँ प्रस्तुत मॉडल तरीकों मीटर की कमियों को दूर करने के लिए विकसित किया गया थाऊपर entioned. त्वचा की अनूठी आंतरिक विशेषताओं का लाभ उठाते हुए, पूरा दोष बनाया और biomaterials के vascularization का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है. त्वचा की आसान दृश्य और ऊतक के हेरफेर की अनुमति देता है जो एक बाहरी अंग है. क्योंकि इसकी बड़ी सतह और सजातीय संरचना की, कई दोषों अध्ययन के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या कम है, जबकि आंतरिक तुलना संभव बनाने के लिए जो बनाया जा सकता है. कारण पशु की Antero पीछे समरूपता के लिए, द्विपक्षीय दोष हालांकि, सुझाव दिया जाता है; दोनों पक्षों ने एक दूसरे की तुलना में कर रहे हैं जब प्रणालीगत प्रभाव के प्रभाव पर विचार किया जाना चाहिए. अंत में, त्वचा transillumination के लिए पसंद की एक इष्टतम अंग का प्रतिनिधित्व एक काफी पारदर्शी ऊतक है. यहाँ वर्णित विधि कई अलग देशी ऊतकों और कई biomaterials के लिए अनुकूल है, इस प्रोटोकॉल मूल एफडीए को मंजूरी दी और नैदानिक ​​डे के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक डबल परत कोलेजन आधारित पाड़ के साथ इस्तेमाल किया जा करने के लिए स्थापित किया गया थाrmal मरम्मत. इस विधि के कार्यान्वयन के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त पाड़ आंशिक रूप से पारदर्शी हो गया है. चुना पाड़ सामग्री पर निर्भर करता है, प्रोटोकॉल के कुछ अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. इससे पहले, हमारे समूह scaffolds के लिए मानव mesenchymal कोशिकाओं के आवेदन उनके vascularization 29 बढ़ाता कैसे दिखाने के लिए मॉडल का इस्तेमाल किया गया है.

एक मानक डिजिटल कैमरा और एक प्रकाश स्रोत मुफ्त सॉफ्टवेयर के माध्यम से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है जो संवहनी नेटवर्क के दृश्य के लिए पर्याप्त हैं. VesSeg-उपकरण द्वारा चित्रों की semiautomatic विभाजन दो चरणों के होते हैं. पहले चरण में, संवहनी नेटवर्क से लिया छवि के विपरीत बढ़ाया एक पोत के नक्शे के लिए अग्रणी है. फिर, विभाजन एल्गोरिथ्म पोत क्षेत्रों का चयन करता है और अंत में, विभाजन प्रस्ताव एक छवि (चित्रा 4) 30 के रूप में प्रस्तुत किया जाता है. एक दूसरे प्रसंस्करण चरण में, जहाजों Str जुड़े हुए हैं कि इस तथ्य का उपयोग(पोत पिक्सल स्थानिक एक साथ लटका जिसका अर्थ है कि) uctures, एक दूसरे विभाजन पहले एक ही सच्चा पोत पिक्सल और सब सच पोत पिक्सल से चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इसलिए, "एक" की एक अंतिम लेबल केवल दूसरी छवि में एक उच्च आत्मविश्वास पोत पिक्सेल को पड़ोसियों की एक श्रृंखला पर जुड़े हुए हैं कि पहली छवि से उन पर कम विश्वास पोत पिक्सल को सम्मानित किया है.

कोई रासायनिक additives आवश्यक हैं, इस विधि भी लागत प्रभावी है. डिजिटल विश्लेषण पोत आयाम, intravascular दूरी, शाखाओं में बंटी अंक, vascularized क्षेत्र और संवहनी नेटवर्क की कुल लंबाई की संख्या का निर्धारण करने में एक अच्छा reproducibility से पता चलता है. हम पहले से रक्त वाहिका नेटवर्क बेहतर रेडियो angiographic पढ़ाई 31 के माध्यम से transillumination द्वारा देखे जा सकते हैं कि पता चला है. टाइटन जाल की उपस्थिति में एक डबल कार्य किया है. एक ओर, यह माउस मो के उपयोग की एक आम दोष है जो घाव संकुचन, रोकताdels; दूसरी ओर, यह पाड़ और घाव बिस्तर के बीच एक भौतिक सीमा प्रदान करता है. सबसे scaffolds biodegradable हैं, क्योंकि पिछले उल्लेख समारोह शारीरिक रूप से scaffolds की कटाई के दौरान पाड़ और घाव बिस्तर के बीच सीमा हदबंदी करना के लिए महत्वपूर्ण है. इस विधि की मुख्य कमियों के अलावा scaffolds explanting और इसलिए एक ही समय बात करने के लिए विश्लेषण की नियंत्रित की जरूरत है; इस प्रकार vascularization की गतिशील अवलोकन वर्तमान स्थापना के साथ संभव नहीं है. एक अन्य समस्या यह विधि transillumination अनुमति कि अर्द्ध पारदर्शी biomaterials तक ही सीमित है. अंत में, आपरेशन प्रक्रिया विशेष शल्य कौशल, के बारे में 6 की एक सीखने की अवस्था की आवश्यकता नहीं है - भले ही 12 संचालित जानवरों ठीक से विधि में महारत हासिल करने के लिए विचार किया जाना है.

हम उच्च संकल्प दृश्य और संवहनी संरचनाओं की मात्रा का ठहराव, आर अनुमति देता है कि एक समय और लागत प्रभावी दृष्टिकोण का परिचयएक आदर्श विधि epresenting अलग biomaterials या अलग पाड़-bioactivation रणनीतियों में vascularization तुलना करने के लिए. इस विधि की स्थापना के लिए आसान है और विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है. इस मॉडल की एक प्रमुख विशेषता पोत दृश्य के बाद, ऊतकों आगे ऐसी ऊतकीय या आणविक विश्लेषण के रूप में अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज कथन का संघर्ष:

सभी लेखकों: कोई नहीं

वित्तीय खुलासे:

लेखकों में से कोई भी इस पांडुलिपि में उल्लेख किया है उत्पादों, उपकरणों, या दवाओं में से किसी में एक वित्तीय हित है.

Acknowledgments

एकीकरण त्वचीय उत्थान टेम्पलेट कृपया एकीकरण जीव विज्ञान निगम द्वारा प्रदान की गई थी. काम का समर्थन धन के स्रोत: (. Nr 15090007) इस काम आंशिक सीआईआरएम-BMBF अर्ली translational द्वितीय पुरस्कार और जीनोम विनियमन के लिए FONDAP केंद्र JTE के लिए दोनों द्वारा वित्त पोषण किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 Ethicon, Norderstedt, Germany 698G Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm) Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA P1050
Biopsy punches (12 mm) Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA P1250
Digital camera  Ricoh, Hannover, Germany Cx1
Gazin Mullkompresse  Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany 13622 Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10') Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA 88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia  Baxter, Unterschleissheim, Germany 100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu Charles River, Sulzfeld, Germany Strain code 088 Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g 
Buprenorphine (0.3 mg/ml) Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight PFM Medical AG, Köln, Germany 6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany B1332020110614 Fibrin-thrombin solution 
Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm) KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK M6275009/10

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 90 biomaterials vascularization ऊतक इंजीनियरिंग transillumination डिजिटल विभाजन त्वचा दोष पाड़ मैट्रिक्स,
एक पूर्ण त्वचा दोष मॉडल बायोमैटिरियल्स vascularization का मूल्यांकन करने के लिए<em&gt; इन विवो</em
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