Summary
Vaskülarizasyon başarılı doku mühendisliği yaklaşımları anahtarıdır. Bu nedenle, güvenilir teknolojileri doku yapıları vasküler ağların gelişimini değerlendirmek için gereklidir. Burada görselleştirmek ve in vivo damarlanmayı ölçmek için basit ve maliyet-etkin bir yöntem mevcut.
Abstract
Yetersiz vaskülarizasyon doku mühendisliği yapılarının klinik başarısını sınırlayan önemli faktörlerden biri olarak kabul edilir. Vaskülarizasyonu geliştirmeye yönelik yeni stratejiler değerlendirmek için güvenilir yöntemler görünür biyo-yapay iskeleler yeni kan damarlarının büyümesini olarak yapmak ve sonuçlarını ölçmek için gereklidir. Yıl geçmiş çift üzerinde, bizim grup transilüminasyon ile kan damarlarının doğrudan görüntülenmesine olanak tanıyan dijital segmentasyon yoluyla nicelikleme imkanı sağlayan tam bir cilt defekti modelini tanıttı. Bu modelde, bir cerrahi farelerin arka tam cilt bozuklukları oluşturur ve test edilen malzeme ile değiştirir. Moleküller veya ilgi duyulan hücrelerin de potansiyel etkisini incelemek için bu tür malzemelerin dahil edilebilir. Kişinin kendi seçtikleri bir gözlem süresinden sonra, malzeme değerlendirme için Eksplante edilir. İkili yaralar inci iç karşılaştırmalar yapma imkanı sağlamakde çalışma için gerekli hayvan sayısını azaltılması gibi bireyler arasında etkilerini en aza indirmek. Diğer yaklaşımlar karşılaştırıldığında, bizim yöntem basit, güvenilir ve maliyet etkin analizi sunar. Biz farklı biyomalzeme ve biyo-aktivasyon yaklaşımların vaskülarizasyonunu sınarken yüksek çözünürlüklü tarama gerçekleştirmek için bir rutin araç olarak bu modeli hayata geçirdik.
Introduction
Son yıllarda, doku mühendisliği, vücudun kendi hücrelerine 1 ile doku defektleri değiştirmek için yeni bir tedavi seçeneği açtı. Doku rejenerasyonu fizyolojik sürecini desteklemek amacıyla, iskeleleri yara yatağından hücrelerin büyümesine ve kusur 2,3 geri yükleyebilirsiniz bir senaryo sağlayan bir biyobozunur yapı olarak tasarlanmıştır.
Yetersiz vaskülarizasyon biyosentetik iskeleler 4 klinik atılım da tutar, ana engel olarak kabul edilir. Hücre büyümesinin ile, besin ve oksijen artar ve malzeme vaskülarizasyonu için talep gerekli olur. Yetersiz veya gecikmiş damarlanma nedenle doku mühendisliği ürünlerinin 5 merkez kangrene neden olabilir. Ek olarak, kan damarları, bağışıklık yetkin hücrelerin sağlamak ve yenileyici alanında metabolik kalıntılarını çıkarın. Yüksek enfeksiyon oranları ve düşük rejenerasyon yalnızcaamaçlayan doku mühendisliği gözlenen yetersiz kan perfüzyon sonuçları, bazı iskeleleri 6,7 vaskülarizasyonunu artırarak önlenecekse.
Biyomalzemenin kendisi ve iskele mikro anahtar rolü üzerinde damarlanma odak geliştirmeyi hedefliyoruz Çeşitli stratejiler. 8,9 restore edilecek şekilde (yeniden), rejenerasyon tamir den iyileşme sürecini değişen birine yakın fizyolojik özelliklere sahip bir doku üreten yeni yaklaşımlar geliştirmeye yoğun araştırma çabaları vardır. Kendi rejeneratif potansiyeli açısından incelenmiştir ve değerlendirildi biyomalzemeler kollajen, fibrin, kitosan ve aljinat 10,11 dahil. Bu biyomalzemeler kullanılan ve doku decellularization, kendini montaj, hızlı prototipleme gibi farklı stratejiler kullanarak yeni iskeleler inşa ve 12 electrospinning için omurga olarak kombine edilebilir. Gelişmiş içinde içinvücudun kendi kendini yenileme kapasitesi ance, iskeleleri bioactivated edilebilir. Rekombinant anjiyojenik büyümenin birleştirilmesi gibi faktörlere 14 şifreleyen 13 veya gen vektörleri iskele vaskülarizasyonunu artırdığı gösterilmiştir faktörleri. Kök hücrelerin kullanımı yaygın olarak mezenkimal stromal hücreleri ve endotelyal progenitör hücreler, en dikkat 15,16 kazanmıştır damarlanmasını artırmak için umut verici bir strateji olarak gösterilmiştir. Diğer yaklaşımlar transplantasyon 17 öncesinde prefabrik damar ağları içeren yapıları inşa etmek için çalışırlar. Yoğun iskele tasarım çabaları ve onların biyo-aktivasyon rağmen, hiçbir strateji masif yanık yaralanmalarında dermal değiştirmeleri hariç, klinik olarak anlamlı düzeyde vaskülarizasyonunu geliştirilmiş ve var, klinik rutin içine bulasıcı malzemelerin çevirisi sadece tereddütle 18 gerçekleşiyor .
Nedenlerinden biri damarlanmaYapay doku yapıları, hala çözülmemiş bir sorundur in vivo yaklaşımlar yeni teknolojilerin başarısını değerlendirmek için zorluk olduğunu. In vitro deneyler iskelelerinin vaskülarizasyon potansiyelinin ilgili önemli bilgiler sağlayabilir, ancak uygun hayvan modelleri, bu tür malzeme biyolojik uyumluluk, özel bir önem güvenlik ve etkinlik tedavi ve, doku vaskülarizasyonu gibi başlıca parametreleri incelemek için gereklidir inşa. Bu nedenle, güvenilir araçlar görselleştirmek ve damar ağları in vivo esastır ölçmek için.
Bu çalışmada biz Eksplante iskeleleri içindeki damar ağı görselleştirme ve kantifizasyonunu basit ve güvenilir bir yöntem mevcut. Bu yöntem, doku transillüminasyon ve dijital segmentasyon dayanmaktadır. Bu yöntem, non-invazif olduğu için, hedef maddenin daha fazla moleküler ve histolojik analizler sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İskelelerin 1. Hazırlık
- 12 mm biyopsi yumruklar kullanarak iskelelerinin örnekleri oluşturun.
- , Darağacında içine biyoaktif molekülleri veya hücreleri tanıtmak nazikçe steril bir gazlı bez ile onları sıkarak iskeleleri tahliye etmek. Daha sonra biyolojik olarak aktif moleküllerin ya da ilgi hücreleri içeren bir çözeltinin 160 ul ilave edilerek rehidrate iskeleleri. Çift-kontrol gibi MTT Tahliller gibi metabolik deneyleri yoluyla hücreleri ile biyoaktivasyonunun başarısını.
- Eğer gerekli ise aşama 1.2 'de tarif edildiği gibi, rehidrasyon boyunca yine bir fibrin-trombin çözeltisi ya da bir hidrojel içinde, örneğin bunları sağlayarak bileşikler ya da hücreler bir yapı iskeleti içine test edilecek sabitleyin.
NOT: bileşikleri veya hücrelerin mekanik malzeme eklemek değilsiniz Bu adım yardımcı olabilir. Bir de bileşiklerin serbest dinamiklerini kontrol edebilir .. - Kestirme tarafından, her deney ve kontrol grubundaki her iskele altına alınacaktır titanized kafesleri, hazırlayıngr üzerinden yuvarlak şekilli parçalar, çapı yaklaşık 14 mm.
NOT: titanized örgü yara yatağından rejenere doku sınırlandırmak için gerekli fiziksel bir sınır olarak çalışmaktadır.
2. Hayvanlar
- Sunulan modelin uygulanmasından önce, ilgili hayvan koruma yasaları danışmak ve yerel yetkililerden izin almak. Bu çalışmada, bütün deneyler mevcut Alman hayvan refahı Kanuna göre, fareler ile yapıldı ve Yukarı Bavyera Bölge Hükümeti (Regierung von Oberbayern) tarafından onaylanmıştır.
- Dikkatle hayvan ve gerginlik seçin. Modeli fareler için kurulmuş olmasa da bu, sıçanlar, tavşanlar, domuzlar ya da diğer yaygın olarak hayvanlar için tercüme edilebilir.
- Eğer kürklü hayvanlar ile çalışıyoruz durumda, iskelelerinin implantasyon öncesi hayvanların sırtını traş.
NOT: Bu çalışma 20 g ve 25 g, ancak farklı yaş ve b arasında bir vücut ağırlığı ile yaşları 6 ila 8 haftalık fareler kullanırody ağırlıkları da kullanılabilir.
3. Anestezi
- Steril koşullar altında operasyon gerçekleştiirlmesidir. Hayvanın normal vücut sıcaklığının muhafaza edilmesi amacıyla, bir sıcak tutma mat kullanın.
- Anestezi Enhalatif önce hayvan / kg vücut ağırlığı 0.05-0.1 mg, deri altına her 8 saat arasında bir dozda Buprenorphin alır.
- Inhalatif anestezi (Isoflurane) altında hayvan koyun veya eşdeğer standart prosedürleri uygulamak. Yavaşça hayvanın ayak sıkarak veya bir deri tutam yoluyla yada anestezi onaylayın.
- , Exsiccosis önlemek işlemin başında 0.5 ml fizyolojik tuzlu su çözeltisi deri altından enjekte edilmesiyle gerçekleştirilebilmektedir.
Cilt 4. eksizyonu
- Yüzükoyun pozisyonda hayvan koyun ve ince bir ucu kalıcı kalem (Şekil 1A) ile fare arka orta hat işaretleyin.
- Eksizyon alanını tanımlayın. Fig gösterilen bölgede kusurları yerleştirin1C yeniden. Kusurları çok kaudalden konursa, hayvanlar sosları ve iskeleleri kaldırmak için daha eğilimli olduğunu unutmayın.
- 10 mm biyopsi yumruk (Şekil 1B) ile bilateral kusurları yuvarlak oluşturun. Delgi dikkatli bir şekilde deriye karşı zorlanır edilmesi ve deri yoluyla tamamen kesmek için, ancak eksizyon alanı (Şekil 1C ve 1E) tanımlamak için kullanılmamalıdır.
- Forseps ile yavaşça belirgin cilt kaldırın ve ince cerrahi makas (Şekil 1F) kullanarak işaretli daire boyunca insizyon. Kanama durumunda, dikkatli bir şekilde, steril bir gazlı bez ile sıkıştırır. Eksizyon bir adım-adım açıklaması Şekil 1'de gösterilmiştir.
NOT: arıza nedeniyle cilt elastikiyeti defekt genişlemesini telafi etmek, iskeleleri oluşturmak için daha küçük bir yumruk ile oluşturulur.
5. İskele İmplantasyon
- Tita için yer yapmak içinrin, mesh, 2-4 mm (Şekil 2A) için yara sınırlarda deri ve altta uzanan doku ayrılmasını uzanır.
- Doğrudan yara yatak ve yara kenarlarının (Şekil 2A ve B) altında defekt içine örgü titanized yerleştirin.
- Yer doğrudan ağ üzeri iskeleleri.
- Hafif yapı iskeletinin (Şekil 2C) üzerine bir kenarın bırakılmayacağı, 4-6 tek mili ile bitişik yara kenarlarına iskeleleri dikin.
NOT: biyobozunur sütür kullanmaktan kaçının. - Yara alanına (Şekil 2D) izlenmesini izin verirken skafoldun korumak için kusurlar üzerinde şeffaf bir yara pansuman dikin.
6. Ameliyat Sonrası Bakım
- Soyunma ve iskelelerinin karşılıklı manipülasyon önlemek için kafes başına bir fare tutmak.
- Gözlemleyerek motor aktivite, vücut ağırlığı, ağrı işaretleri, tolerans ile günlük olarak hayvanın genel durumunu değerlendirirpansuman ve otomatik kurcalanmaları. Ayrıca kanama, lokal ve sistemik enfeksiyon belirtileri ve soyunma pozisyon için yara alanı izlemek.
- Hayvanın ağrı en aza indirmek için, 0.05-0.1 mg / kg vücut ağırlığı ya da eşdeğer bir analjezik ilaç dozunda günlük Buprenorphin enjekte edilir.
- Fare yara pansuman kaldırır ya da zarar verirse, değiştirmek veya anestezi altında takın.
İskele 7. Ötanazi ve Eksplantasyonu
- İstenen zaman noktalarında, pentobarbital (150 mg / kg) aşırı dozda alınması ile hayvanlar kurban.
- Iskeleler ve olası (Şekil 3A) ve arka fare deri kadar içermelidir kalıcı bir kalem ile deri eksizyon sitesi işaretleyin.
- Makas veya neşter bir çift ile işaretlenmiş çizgiler boyunca cildi İnsizyon. (Künt hazırlık yoluyla altta yatan doku, Fi iskeleler ve titanized örgü dahil tüm cilt, AyırGüre 3B).
- Petri kabı uzattı Eksplante doku yerleştirin (Şekil 3C ve D)
Vasküler Network 8. Görselleştirme ve
- Transillumination:
- Beyaz ışık (100 Watt standart ampul) güçlü bir kaynağı üzerinde bir Petri kabı monte edilerek, bir transillüminasyonu aygıtını kurun.
- Dijital fotoğraf elde etmek için transilluminator üzerinde bir dijital kamera düzeltmek.
- Ters transillüminasyon cihazın üzerine Petri tabağına numuneler.
- Normal deri eşit büyüklükte alanları yanı sıra makro modunda tam iskelelerinin fotoğraf çekmek. Daha fazla dijital analiz için TIFF formatında görüntüleri depolamak.
- , Başka biyokimyasal ve histolojik analizi için doku kaydedin.
- Dijital segmentasyon ve miktar:
- Fr elde edilebilir VesSeg-Aracı yazılımı indirin ve yükleyin: görevli ee http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
- VesSeg-Tool yazılımı ile resmi açın.
- Dijital analiz (Seç → Görüntü) için yapı iskelesi kapsadığı görüntünün alanını seçin.
- Seçeneğini "Histeri eşikleme" (Hesapla damar artırılması → Top-Hat dönüşüm → Görüntü → Gemi geliştirme filtre → Histeri eşiklendirme) kullanın gemilerin kontrastını artırmak için.
- Damar haritası (Görüntü → Gemi geliştirme filtre → Histeri eşikleme → Eşik sınırları) içinde segmentasyonu ile devam edin. Ilk eşik ("Gemi kapsama"), bu yüzden bile uzaktan gemi gibi her piksel, geminin olarak etiketlenmiş olacaktır seçin. Özellikle damar benzeri damarlarda etiketli edilecek böylece sadece bu pikselleri ikinci eşik ("Arka kapsama") seçin.
- Olmayan yakalanan gemiler eklemek ve genellikle tüyleri ve dikiş gibi uzun ve ince, damar benzeri yapılar olan ortak yalancı pozitif yapıları ortadan kaldırmak için manuel otomatik segmentasyon teklifi edin.
- Gemilerin uzunluğu ve (İkili görüntü istatistiği → Görüntü → Görüntü istatistik) gemiler tarafından kapsanan toplam alanını hesaplayın.
NOT: damar uzunluklarının hesaplanması için, elde edilen damar harita kaplar 20 bir piksel genişliğinde hatlarına incelmiş.
- Yerli dokuya% 100 bir değer atanması, iskeleler gibi aynı parametreleri altında yerli deri alanını analiz eder ve o değere iskele ilgilidir. Beyaz piksellerin yüzdesini normal dokuda% 60 ve% 30 iskele ise, örneğin, bu iskeletin% 50 vaskülarizasyonun temsil eder. Not: Beyaz gemiler kapsama iskelesi etrafında bir kare alana atanır. Beyaz piksel kapsama yükünüzün sayısını ayarlayındairenin alanı kare (4 x R2) önemli ölçüde daha küçük (π x R2) olduğu dering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Güvenilir bir ikili tam bir cilt defekti cilt çalışmada (Şekil 2) altında biyomalzeme ile değiştirilebilir fare (Şekil 1) oluşturulabilir. Burada önemli bir komplikasyon enfeksiyon ya da yabancı cisim reaksiyonu, ne de makroskopik bulgular sırasında ya da cerrahi bir prosedür sonra gözlenir. Bir fare kaldırır Nadir durumlarda, bir iskele kaybolur. Yara kasılma (Şekil 3) hiç görülmedi. Doku transillüminasyonu hem yerli doku ve implante iskeleleri (Şekil 4) dahil bir bütün doku örneğinde, genişliğe kadar 30 um vasküler yapılarının açıkça görüntülenmesini sağladı. Istenilen zamanlar implantasyonu sonrası dijital segmentasyon sonra, gemiler kolayca ölçülebilir olabilir. Örneğin, 2 hafta implantasyon sonrası, 62.28 ± 8.6% damarlanmasına düzeyleri gözlenmiştir (ortalama ± standart hata ortalaması n = 8) 21. Toplamda, yaklaşık 25 dak160., hayvan başına (2 iskeleleri) implantasyon için gerekli olan, doku hasat ve resmedilmesinde ve bir numune dijital analiz etmek için 10 dakika boyunca 5 Min. Bir son nokta olarak, bu yöntem, daha fazla analiz için Çıkarılan dokunun kalitesini etkilemez. Örneğin, protein ve RNA standart yöntemlerle kolayca numuneden elde edilebilir.
Şekil 1. Tam Cilt Kusur. Fare arka orta hat ince bir ucu kalem ile işaretlendi ve bir biyopsi yumruk defekt (A, B, C ve D) oluşturulacak edildi alanı işaretlemek için kullanılır. Alanlar tanımlandıktan sonra hazırlanması (E ve F) yakın çekim görüldüğü gibi, tam deri standart cerrahi makas ile kaldırılır. Bir fkusurun inal sonucu (D) gösterilir ve (G) büyütülür. Ölçek çubukları ABCD 1 cm ve EFG 5 mm temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil skafoldun 2. aşılanması. Skafoldun implantasyon öncesinde, bir ağ doğrudan yara yatağına ve yara kenarları (A ve B), noksanlık içine yerleştirilir. Sonraki iskeleleri ağ üzerine yerleştirilir ve yara kenarları (C) dikilmiştir. Son olarak, şeffaf bir yara pansuman yerleştirilir ve deri (D) dikilir. Ölçek çubuğu (A, B ve C), 5 mm olarak temsil ederd (D) 1 cm. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Doku eksplantasyonu. Doku analizi için, hayvanın arka tam deri cerrahi olarak (A ve B) çıkarılır ve bir Petri kutusu (C) uzanmış. Transilüminasyon için cilt altüst olur ve bir dijital resim (D) alınır. Iskeleler yanındaki deri çıkarılması vaskülarizasyon verilerin normalleştirilmesi için gereklidir. Ölçek çubukları 1 cm temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. transillüminasyon, dijital bölümlendirme ve miktarının belirlenmesi. Deri dokusu kesilir ve transillüminasyon (üst resim), doğal derinin (B) ve skafoldun arkasında (A) ve detaylı alanlarında tam deri ile görselleştirilmiştir içindeki damar ağı (Cı ) gösterilir. Oklar büyütülmüş (B) bulunduğu bölgede (C) göstermektedir. Alt resimlerin her birine doğrudan üzerinde bulunan resim dijital bölütleme işleminin sonuçlarını gösterir. Ölçek çubukları 5 mm temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biyomalzeme içindeki damarlanma süreçleri incelemek için yeni, güvenilir yöntemlerin geliştirilmesini talep doku mühendisliği yapıları kan perfüzyon geliştirerek başarılı yaklaşımları kurmak için bir ihtiyaç vardır. Ex vivo olarak görülebilir iskele vaskülarizasyon yapmak için yaygın yöntemler bir yüksek çözünürlüklü bir araç sağlar mikroskobu kullanımını içerir. Çoğu durumda olsa da, bu yöntem küçük doku alanlarında analizlerine sınırlı ve pahalı ve zaman alıcı olma eğilimindedir. Ayrıca, sık sık kan perfüze damarları olmayan fonksiyonel olanlar 22 ayırt edilemez ayrıntılı etiketleme ve boyama yöntemleri içerir. Kullanım Yöntemler damarların işlev, bilgisayar tomografi, manyetik rezonans görüntüleme ve pozitron elektron tomografi vardır değerlendirmek için. Bu yöntemler, son derece pahalı ekipman ve düşük çözünürlüklü güç 23 dezavantajlara sahiptir. Damarlanmayı görselleştirmek için bir başka yaygın kullanılan stratejivasküler kullanımı dokusunun 24 kimyasal korozyon takip atmalarını. Bu yöntem, damar ağının temsili bir 3 boyutlu yapının elde edilmesini mümkün kılar, ancak sonuçlar, yapay perfüzyon ve dokuların düzeyine bağlı olarak örneğin bir protein veya RNA analizi gibi başka biyokimyasal çalışmalar için kullanılamaz değişir. Tavuk koriyoallantoik membran (CAM) modeli 25 ve kemirgenler 26,27 olarak Deri kıvrım odası modeli anjiogenezisi, kapiller perfüzyon ve kan akışını analiz etkili yöntemler olduğu gösterilmiştir. Son zamanlarda, Deri kıvrım odası modeli aynı zamanda gözenekli poliüretan iskeleleri 28 MSC tabanlı damarlanma stratejilerinin değerlendirilmesi doku mühendisliği uygulamaları için kullanılmaktadır. In vivo görüntüleme için bu yöntemler mevcut, önemli avantajların ve burada tarif edilen yöntem için çekici bir hedefi temsil ederler.
Burada sunulan model yöntemleri m eksikliklerin üstesinden gelmek için geliştirilmiştirYukarıda entioned. Cildin özgü iç özelliklerinden yararlanan tam defektler ve biyomalzeme vaskülarizasyon değerlendirmek için kullanılır. Cilt kolay görselleştirme ve doku manipülasyonu sağlayan bir dış organdır. Nedeniyle geniş yüzey ve homojen bir yapıya sahip, çok sayıda kusurları çalışma için gerekli hayvan sayısını azaltırken, iç karşılaştırmalar imkan veren oluşturulabilir. Nedeniyle hayvanın ön-arka simetri, ikili kusurlar ancak önerdi edilir; Her iki taraf da birbirine göre zaman sistemik etkileri etkisi dikkate alınmalıdır. Son olarak, cilt transilüminasyon için seçim optimal organı temsil oldukça şeffaf bir dokudur. Burada tarif edilen yöntem, çok farklı doğal dokuların ve çeşitli biyomalzeme için uygun olmasına rağmen, bu protokol başlangıçta FDA onaylı ve klinik de kullanılan bir çift katmanlı kolajen-bazlı yapı iskelesi ile kullanılmak üzere kurulmuşrmal onarım. Bu yöntemin uygulanması için önemli bir ön koşul iskele kısmen saydam olmasını olmasıdır. Seçilen iskele malzemeye bağlı olarak, iletişim kuralı, bazı uyarlanması gerekli olabilir. Daha önce, bizim grup iskeleler insan mezenkimal hücreler uygulama onların vaskülarizasyonunu 29 artırır nasıl göstermek için modelini kullandı.
Standart bir dijital kamera ve bir ışık kaynağı serbest yazılımı ile sayısal olarak tespit edilebilen damar ağının görüntülenmesi için yeterlidir. VesSeg-Aracı tarafından resim yarı otomatik segmentasyon iki adımdan oluşur. Birinci aşamada, damar ağından alınan görüntü kontrastlı bir kap harita yol açmaktadır. Ardından, segmentasyon algoritması damar alanları seçer ve nihayet, segmentasyon önerisi bir görüntü (Şekil 4) 30 olarak sunulmuştur. İkinci bir işlem adımında, gemi str bağlı olduğu gerçeğini kullanarak(damar piksel mekansal birlikte asmak anlamına gelir) uctures, ikinci bir segmentasyon ilki tek gerçek damar piksel ve tüm gerçek damar piksel seçmek için kullanılır. Bu nedenle, "bir" nihai bir etiket sadece ikinci görüntüde yüksek güven damar piksele komşu bir zincir üzerinde bağlı ilk görüntüden bu düşük güven damar piksel verilir.
Herhangi bir kimyasal katkı gerekli olduğu için, bu yöntem, aynı zamanda maliyet-etkindir. Dijital analizi gemi boyutları, damar içi mesafeleri, dallanma noktaları, damarlı bölge ve damar ağının toplam uzunluğu sayısını belirlemek iyi bir tekrarlanabilirlik göstermektedir. Daha önce kan damar ağı daha iyi bir radyo-anjiyografik çalışma ile 31 daha aydınlatıcı yoluyla görselleştirilebilir göstermiştir. Titanyum ağ varlığı bir çift fonksiyona sahiptir. Bir yandan, bu fare mo kullanımının genel bir dezavantajı, yara kasılmasını önlerdels; Diğer yandan, bir yara iskelesi ve yatak arasında fiziksel bir sınır sağlar. En iskeleleri biyolojik olarak parçalanabilir olması nedeniyle, son olarak adı geçen fiziksel fonksiyon iskelelerinin hasat sırasında iskelesi ve yara yatağı arasındaki sınırı sınırlandırmak için çok önemlidir. Bu yöntemin temel sakıncaları arasında iskeleleri eksplante ve bu nedenle tek bir zaman noktası için yapılan analizin sınırlamaya ihtiyaç vardır; Böylece damarlanma dinamik gözlem güncel ayar mümkün değildir. Başka bir problem, bu yöntem, transillüminasyonun izin yarı saydam Biyomalzemelere sınırlı olmasıdır. Son olarak, çalışma prosedürü özel cerrahi becerileri, yaklaşık 6 bir öğrenme eğrisi gerektirmez olsa bile - 12 çalışan hayvanların düzgün yöntemini ana düşünülmesi gerekir.
Biz yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve vasküler yapıların ölçümü, r sağlayan bir zaman ve maliyet etkin bir yaklaşım tanıtmakİdeal yöntem epresenting farklı biyomalzeme veya farklı iskele-biyoaktivasyonu stratejileri vaskülarizasyonunu karşılaştırmak. Bu yöntem kurmak kolaydır ve özel ekipman gerektirmez. Bu modelin önemli bir özelliği, kap görselleştirme sonra dokular ayrıca, histolojik ve moleküler analizi gibi çalışmalar için kullanılabilir olmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Faiz deyimi Çatışma:
Tüm yazarlar: Yok
Finansal Açıklamalar:
Yazarların hiçbiri bu metinde söz ürünleri, cihazlar veya uyuşturucu herhangi bir mali ilgi var.
Acknowledgments
Integra dermal rejenerasyon şablon nazik Integra LifeSciences Corporation tarafından sağlanmıştır. Çalışmalarını destekleyen fonların Kaynaklar: (. No 15090007) Bu çalışma kısmen CIRM-Bmbf Erken Translational II Ödülü ve Genom düzenlenmesi için FONDAP Merkezi'nin jte hem tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 | Ethicon, Norderstedt, Germany | 698G | Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture |
| Biopsy punches (10 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1050 | |
| Biopsy punches (12 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1250 | |
| Digital camera | Ricoh, Hannover, Germany | Cx1 | |
| Gazin Mullkompresse | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany | 13622 | Sterile gauze (10 cm x 10 cm) |
| Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10') | Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA | 88101 | |
| Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia | Baxter, Unterschleissheim, Germany | 100196040 | |
| Pentobarbital, 16 g / 100 ml | Fa. Merial, Hallbergmoos | ||
| Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu | Charles River, Sulzfeld, Germany | Strain code 088 | Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g |
| Buprenorphine (0.3 mg/ml) | Essex Pharma GmbH, Munich, Germany | ||
| Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight | PFM Medical AG, Köln, Germany | 6000029 | |
| Tissucol Duo S Immuno 2 ml | Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany | B1332020110614 | Fibrin-thrombin solution |
| Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm) | KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK | M6275009/10 |
References
- Rahaman, M. N., Mao, J. J. Stem cell-based composite tissue constructs for regenerative medicine. Biotechnology and Bioengineering. 91 (3), 261-284 (2005).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23, 47-55 (2005).
- Machens, H. G., Berger, A. C., Mailaender, P. Bioartificial skin. Cells Tissues Organs. 167, 88-94 (2000).
- Priya, S. G., Jungvid, H., Kumar, A. Skin tissue engineering for tissue repair and regeneration. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 105-118 (2008).
- Papavasiliou, G., Cheng, M. H., Brey, E. M. Strategies for vascularization of polymer scaffolds. Journal of Investigative Medicine. 58 (7), 838-844 (2010).
- Laschke, M. W., et al. Angiogenesis in tissue engineering: breathing life into constructed tissue substitutes. Tissue Engineering. 12, 2093-2104 (2006).
- Zhong, S. P., Zhang, Y. Z., Lim, C. T. Tissue scaffolds for skin wound healing and dermal reconstruction. Wiley Interdisciplinary Reviews Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 510-525 (2010).
- Liu, G., Zhang, Y., Liu, B., Sun, J., Li, W., Cui, L. Bone regeneration in a canine cranial model using allogeneic adipose derived stem cells and coral scaffold. Biomaterials. 34 (11), 2655-2664 (2013).
- Hansson, A., Di Francesco, T., Falson, F., Rousselle, P., Jordan, O., Borchard, G. Preparation and evaluation of nanoparticles for directed tissue engineering. International Journal of Pharmaceutics. 439 (1-2), 73-80 (2012).
- Sarkar, S. D., Farrugia, B. L., Dargaville, T. R., Dhara, S. Chitosan-collagen scaffolds with nano/microfibrous architecture for skin tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 18, (2013).
- Wang, X., et al. The roles of knitted mesh-reinforced collagen-chitosan hybrid scaffold in the one-step repair of full-thickness skin defects in rats. Acta Biomaterials. 9 (8), 7822-7832 (2013).
- Rizzi, S. C., Upton, Z., Bott, K., Dargaville, T. R. Recent advances in dermal wound healing: biomedical device approaches. Expert Review of Medical Devices. 1, 143-154 (2010).
- des Rieux, A., et al. 3D systems delivering VEGF to promote angiogenesis for tissue engineering. Journal of Controlled Release. 150, 272-278 (2011).
- Reckhenrich, A. K., et al. Bioactivation of dermal scaffolds with a non-viral copolymer-protected gene vector. Biomaterials. 32, 1996-2003 (2011).
- Chen, J., et al. The Key Regulatory Roles of the PI3K/Akt Signaling Pathway in the Functionalities of Mesenchymal Stem Cells and Applications in Tissue Regeneration. Tissue Engineering Part B Rev. 19, 516-528 (2013).
- Fedorovich, N. E., et al. The role of endothelial progenitor cells in prevascularized bone tissue engineering: development of heterogenous constructs. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2355-2367 (2010).
- Wang, L., et al. Osteogenesis and angiogenesis of tissue-engineered bone constructed by prevascularized β-tricalcium phosphate scaffold and mesenchymal stem cells. Biomaterials. 36, 9452-9461 (2010).
- Cuadra, A., et al. Functional results of burned hands treated with Integra. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (2), 228-234 (2012).
- Wilcke, I., et al. VEGF(165) and bFGF protein-based therapy in a slow release system to improve angiogenesis in a bioartificial dermal substitute in vitro and in vivo. Langenbecks Arch Surg. 392 (3), 305-314 (2007).
- Condurache, A., Aach, T., Grzybowsky, S., Machens, H. G. Vessel segmentation and analysis in laboratory skin transplant micro-angiograms. Proceedings of the Eighteenth IEEE Symposium on Computer-Based Medical Systems. , 21-26 (2005).
- Danner, S., et al. The use of human sweat gland-derived stem cells for enhancing vascularization during dermal regeneration. Journal of Investigative Dermatology. 132 (6), 1707-1716 (2012).
- Shaterian, A., et al. Real Time Analysis of the Kinetics of Angiogenesis and Vascular Permeability in an Animal Model of Wound Healing. Burns. 35 (6), 811-817 (2009).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nature Medicine. 9 (6), 713-725 (2003).
- Bergeron, L., Tang, M., Morris, S. F. A review of vascular injection techniques for the study of perforator flaps. Plastic and Reconstructive Surgery. 117, 2050-2057 (2006).
- Schlatter, P., König, M. F., Karlsson, L. M., Burri, P. H. Quantitative study of intussusceptive capillary growth in the chorioallantoic membrane (CAM) of the chicken embryo. Microvascular Research. 54 (1), 65-73 (1997).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. American Journal of Pathology. 143 (4), 1055-1062 (1993).
- Menger, M. D., Jäger, S., Walter, P., Hammersen, F., Messmer, K. A novel technique for studies on the microvasculature of transplanted islets of Langerhans in vivo. International journal of microcirculation, clinical and experimental. 9 (1), 103-117 (1990).
- Laschke, M. W., et al. Three-dimensional spheroids of adipose-derived mesenchymal stem cells are potent initiators of blood vessel formation in porous polyurethane scaffolds. Acta Biomaterials. 9 (6), 6876-6884 (2013).
- Egaña, J. T., et al. Use of human mesenchymal cells to improve vascularization in a mouse model for scaffold-based dermal regeneration. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1191-1200 (2009).
- Condurache, A., Aach, T. Vessel segmentation in angiograms using hysteresis thresholding. Proceedings of the Ninth IAPR Conference on Machine Vision Applications. , 269-272 (2005).
- Egaña, J. T., et al. Ex vivo method to visualize and quantify vascular networks in native and tissue engineered skin. Langenbecks Archives of Surgery. 394, 349-356 (2009).
