Summary
Qui si descrive la strumentazione e metodi per la rilevazione di molecole proteiche singolo fluorescenza marcata che interagiscono con una singola molecola di DNA sospeso tra due microsfere otticamente intrappolati.
Introduction
Tecniche di singola molecola (SM) hanno notevolmente sviluppato nel corso degli ultimi trenta anni per rispondere alla necessità di superare alcune delle limitazioni delle tradizionali, alla rinfusa misure soluzione 1-3. La manipolazione di molecole biologiche singoli ha creato la possibilità di misurare le proprietà meccaniche dei biopolimeri 4 e controllare i parametri meccanici di proteina-proteina 5 e le interazioni proteina-DNA 6,7. Fluorescenza SM, dall'altro, rappresenta uno strumento estremamente versatile per studiare l'attività della proteina in vitro e in vivo, che conduce alla possibilità di localizzazione e inseguimento singole molecole con precisione nanometrica. Attraverso il montaggio del punto-spread-funzione strumento all'immagine SM, infatti, si può realizzare localizzazione con precisione in funzione principalmente segnale-rumore (SNR) e raggiungere un limite di circa un nanometro 8,9. Queste metodologie trovano potenteapplicazioni nello studio della dinamica delle proteine motrici, nonché dei processi di diffusione sottostanti ricerche bersaglio di proteine che legano il DNA. La capacità di determinare costanti di diffusione in funzione della sequenza di DNA, tempo di permanenza sul bersaglio e con precisione la misurazione della lunghezza del DNA esplorato durante gli eventi di diffusione monodimensionali, rappresentano un potente strumento per lo studio di interazioni proteina-DNA dinamiche di interazione e per la verifica dei meccanismi di specifica destinazione della ricerca.
Recentemente, la combinazione di queste due tecniche ha prodotto una nuova generazione di apparati sperimentali 10-14 consentano la manipolazione simultanea di un substrato biologico (per esempio un filamento di actina o una molecola di DNA) e rilevamento / localizzazione di un partner interagenti enzima (per esempio miosina o una proteina di legame al DNA). I vantaggi di queste tecniche poggiano principalmente sulla possibilità di esercitare un controllo meccanico sul polimero intrappolato, così enabling lo studio delle dinamiche di interazione rispetto a forze o coppie. Inoltre, il metodo consente di misurare le reazioni biochimiche lontano dalla superficie, evitando una delle principali limitazioni dei metodi classici SM, cioè, la necessità di immobilizzazione delle molecole in esame su una superficie (vetrino o microsfere).
La combinazione di due molecole singole tecniche è necessario superare diverse difficoltà tecniche, derivanti principalmente dai requisiti di stabilità meccanica e adeguata SNR (specialmente quando richiede la localizzazione con precisione nm) 15. In particolare, in caso di allacciamento di rilevamento della fluorescenza SM con pinzette ottiche, la riduzione del rumore e photobleaching da intrappolamento laser a infrarossi 16 e il controllo di buffer biochimici per l'assemblaggio dei complessi biologici e le prestazioni delle misure sperimentali 11 sono di fondamentale importanza. Qui, descriviamo i metodi per l'esecuzione di successomisurazioni in una configurazione a doppio localizzazione cattura / SM fluorescenza. La metodologia è illustrata con l'esempio della proteina repressore lattosio (LacI) fluorescente (con Atto532) e rilevato come si lega ad una molecola di DNA (intrappolato tra due pinzette ottiche) contenente specifiche sequenze di legame Laci (ad esempio, operatori). Abbiamo dimostrato l'efficacia del metodo di rilevazione di legame al DNA di LacI e diffusione lungo il suo profilo nel processo di ricerca di destinazione. Il metodo è applicabile a qualsiasi combinazione di sequenze di DNA e proteine di legame al DNA, come pure ad altri sistemi (microtubuli o filamenti di actina e le proteine motrici che interagiscono con essi).
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Protocol
1. ottici Pinzetta installazione con Nanometer Stabilità
Il setup sperimentale deve fornire due pinzette ottiche con punta stabilità alle fluttuazioni del livello del nanometro e intensità del laser intrappolamento sotto l'1%. La combinazione di queste condizioni assicurerà stabilità nanometri del manubrio sotto tensione tipica (1 pN - poche decine di PN), trappola rigidità (0,1 PN / nm) e la larghezza di banda di misura (immagine velocità di acquisizione di 20 sec -1). Uno schema del setup sperimentale è illustrato in Figura 1.
- Ottica di progettazione e costruzione pinzette 15,17:
- Montare l'apparato sperimentale su un tavolo ottico con isolatori attivi per ridurre le vibrazioni meccaniche. Montare la struttura microscopio su isolatori elastomerici per assorbire il rumore acustico e risonanze meccaniche della struttura microscopio.
- Inserire un isolatore ottico nel percorso del laser cattura, nei pressi della sorgente laser, ad reduce fluttuazioni casuali di ampiezza a causa di feedback ottico.
- Ridurre la lunghezza del percorso del laser intrappolamento per quanto possibile e racchiudere l'intero percorso in una scatola sigillata per ridurre le fluttuazioni di puntamento laser dovuti a correnti d'aria e turbolenze.
- Crea pinzette ottiche doppie dividendo un'unica sorgente laser nel vicino infrarosso (laser Nd: YAG, 1.064 nm di lunghezza d'onda) in due fasci con polarizzazioni ortogonali. Non utilizzare trappole a tempo condiviso perché causano oscillazione del manubrio in tensione 12.
- Utilizzare deflettori acusto-ottico (AOD) guidati da diretti Sintetizzatori digitali (DDS) per consentire i movimenti fini di (almeno) una trappola e precisa regolazione della tensione del DNA. DDS permettono una stabilità trappola migliore di oscillatori controllati in tensione-(VCO).
- Inserire due fotodiodi rivelatore quadrante (QDPs) nel piano focale posteriore del condensatore per rilevare la posizione delle perline intrappolati con precisione sub-nm.
- Verificare che l'intensità fluctuations del laser intrappolamento all'ingresso microscopio sono inferiori a 1% utilizzando un fotodiodo con una larghezza di banda maggiore del tasso di acquisizione dell'immagine.
- Controllare che indica la stabilità dei due laser di cattura:
- Preparare perline di silice in tampone fosfato: Diluire 20 ml di perline di silice (1.54 micron, 10% di solidi) in 1 ml di acetone, sonicare 30 sec, vortice brevemente, e centrifugare 2 min a 19.000 x g. Risospendere in 1 ml di acetone e lavare ripetere. Risospendere in 1 ml di tampone fosfato 50 mM, lavare 2 volte, e, infine, risospendere in 100 ml di 50 mM tampone fosfato.
- Calibrare pinzette ottiche con perline di silice: preparare una cella di flusso collegando un coprioggetto di un vetrino da microscopio con nastro bi-adesivo (spessore di circa 60 micron). Portata 1 mg / ml di BSA e attendere 3 minuti. Flusso perline di silice diluiti 1/1000 in tampone fosfato e sigillare la camera di flusso con grasso al silicone. Trappola una perlina in ogni trappola e calibrare le trappole utilizzando il metodo dello spettro di potenza 18. Preparare perline di silice in acetato di pentile e nitrocellulosa: Diluire 20 ml di perline di silice (1.54 micron, 10% di solidi) in 1 ml di acetone, sonicare 30 sec, vortice brevemente, e centrifugare 2 min a 19.000 x g. Risospendere in 1 ml di acetone e lavare ripetere. Risospendere in 1 ml di acetato di pentile e lavare 2 volte. Infine li risospendere in acetato di pentile con 0,1% di nitrocellulosa disciolta in acetato pentil.
- Distribuire 2 ml di 1,54 micron di diametro perle di silice disciolta in acetato di pentile + 0,1% di nitrocellulosa sulla superficie di un vetrino coprioggetto (24 x 24 mm) utilizzando un secondo vetrino coprioggetto (24 x 60 mm). Fissare il vetrino di un vetrino da microscopio utilizzando due pezzi di nastro biadesivo per creare una cella di flusso. Riempire la cella a flusso con tampone fosfato 50 mm e sigillare con grasso al silicone.
- Immagine tallone uno di silice in microscopia in campo chiaro a 2,000X ingrandimento. Il campo di visualizzazione dovrebbe essere 7 x 5 micron acquisita a 768 x 576 pixel, in modo che l'immagine tallone ha un diametro di 190 pixels. Compensare derive termiche con un software di feedback che, come in rif. 17, calcola la posizione xy dal centroide dell'immagine e z dagli anelli di diffrazione e corregge derive in movimento una fase piezo con nm-precisione o meglio.
- Sovrapporre il centro di trappola sinistra con il centro tallone (i livelli del segnale xy dal QDP deve essere la stessa misurata durante la calibrazione) e misurare il rumore posizione e la sua deviazione standard dalla QDP. Ripetere la misura per la trappola giusta.
2. singola molecola di localizzazione con precisione nanometrica
- Progettazione microscopia a fluorescenza e costruzione 15,19
- Utilizzare una elevata efficienza quantica e CCD elettrone-moltiplicato per raggiungere gli elevati rapporti necessari per la precisione la localizzazione nanometri segnale-rumore.
- Scegli ottica per ottenere un'immagine pixel dimensione ~ 80 nm (per esempio, un ingrandimento di un'immagine ~ 200X con una dimensione pixel fotocamera di 16 micron). Questo è sufficientemente piccola trascurare errore di localizzazione causa pixelation 8, ma sufficientemente grande per raccogliere un considerevole numero di fotoni per pixel.
- Come sorgente di eccitazione, utilizzare la luce laser che è non polarizzata (passando attraverso una fibra ottica non mantenimento di polarizzazione) o polarizzata circolarmente (passando attraverso un λ / 4 waveplate) per massimizzare eccitazione di singoli cromofori, indipendentemente dal loro orientamento.
- Scegli filtri passa-banda di emissione che entrambe le luci laser di eccitazione e di cattura in modo efficiente cut-off. Nota: Nei nostri esperimenti abbiamo etichettato la nostra proteina con Atto532 colorante e usato un filtro passa-banda di emissione centrato a 600 nm con larghezza di banda di 100 nm.
3 microfluidica
Per ottenere un controllo preciso di scambio tampone e assemblaggio 'manubrio', cioè, l'ancoraggio di una singola molecola di DNA tra due microsfere otticamente intrappolati, un flusso laminare multicanale fuoriseriesistema deve essere sviluppato. Questo è composto da una camera di flusso, una pressione del serbatoio e un sistema di controllo della pressione (Figura 2).
- Preparazione Cella di flusso
NOTA: La camera di flusso utilizzato per esperimenti di singola molecola su interazioni proteina-DNA ha preferibilmente 4 ingressi e 1 uscita, per consentire fino a 4 flussi tampone parallele, ciascuna contenente uno dei diversi componenti necessari per l'esperimento: perline, DNA, proteine, e il buffer di imaging fluorescenza marcata. Separazione dei componenti nelle portate canali permette assemblaggio efficiente del manubrio. Inoltre, il canale di imaging è utile per evitare la fluorescenza da proteine diffondenti e raggiungere l'elevato rapporto segnale-rumore richiesto per la localizzazione della proteina di legame al DNA con una precisione dell'ordine di pochi nanometri.- Praticare uno millimetri fori di diametro nel vetrino da microscopio (76 x 76 x 1 mm) con una punta di diamante, al fine di creare 4 ingressi ed una uscita.
- Clean the vetrini da microscopio con etanolo e centrare la porta con l'O-ring inserito e l'anello adesivo nella diapositiva che circonda i fori di accesso. E 'fondamentale indossare guanti durante questa fase per evitare di lasciare impronte, che potrebbero disturbare il processo di incollaggio.
- Bloccare le NanoPorts alla diapositiva, e metterlo in forno preriscaldato a 180 ° C per 1 ora per consentire l'attaccamento completa.
- Disegnare lo schema contorno della cella di flusso su un pezzo di carta. I canali dovrebbero essere ~ larghezza di 3 mm e corrispondere alla posizione fori sul vetrino da microscopio.
- Posizionare il disegno sulla parte superiore di due pezzi di Parafilm, e con un bisturi effettuare tagli netti e continui lungo il contorno disegnato. Rimuovere qualsiasi protuberanza formata. Eliminare lo strato Parafilm più basso, che è solo utilizzato per garantire un supporto pulito.
- Posizionare il vetrino contenente i NanoPorts allegate a testa in giù nel supporto metallico.
- Allineare con cura il contorno camera di Parafilm con i fori, facendo attenzione thal parafilm non obtrude le insenature e di uscita della camera.
- Coprire con un vetrino coprioggetto microscopio pulito (62 x 56 x 0,15 millimetri) e rimuovere con cura l'eccesso Parafilm che circonda la camera.
- Inserire due blocchi di calore, precedentemente riscaldato a 120 ° C, in cima alla cella di flusso per applicare una pressione costante su di esso. Lasciate che il Parafilm sciogliere per circa 25 min.
- Serbatoio di pressione e contenitori tampone
Il serbatoio a pressione deve essere fatta di plexiglas (o simile) e permettono sistemazione di sei contenitori tampone. La possibilità di disporre di almeno due contenitori tampone supplementare migliora la flessibilità dello strumento. Si noti che i contenitori trasparenti e tubi notevolmente aiutare nella gestione del flusso del sistema e risoluzione dei problemi di bolle d'aria intrappolate. Luer sterile e monouso siringhe lock-tip (2,5 ml), da cui i pistoni sono stati precedentemente rimossi, sono buoni contenitori tampone e consentono un facile collegamento con il tubo di ingresso. Assicurarsi cheil volume totale del fluido è piccolo rispetto al volume di aria all'interno del serbatoio di pressione, una condizione essenziale per ottenere un flusso regolare e stabile.- Collegare valvole di intercettazione all'uscita dei contenitori tampone per trasformare il flusso di buffer o disattivare durante gli esperimenti.
- Montare la cella di flusso sul palco microscopio. Collegare le valvole di intercettazione agli ingressi camera di flusso con tubo polietereterchetone (diametro interno ~ 150 micron) e raccordi senza flangia. Aggiungere ~ 3 cm di tubo etilene propilene fluorurato (diametro interno ~ 500 micron) come collegamento tra il tubo e le assemblee NanoPort della cella di flusso. Questo passaggio è essenziale per ridurre il flusso del buffer all'ingresso della camera per evitare la rottura della cella di flusso o distacco NanoPort dal vetro. L'uso di grandi tubi diametro interno da solo, invece, richiederebbe ingenti volumi di campioni biologici.
- Collegare l'uscita della camera di flusso per un tubo Falcon aperto a pressione atmosferica. Questotubo funge disposizione per il tampone scorre fuori dalla camera di flusso.
- Sistema di controllo della pressione
- Costruire un sistema di controllo della pressione in grado di regolare con precisione la pressione dell'aria all'interno del serbatoio a pressione. Questo può essere fatto utilizzando due valvole controllate da computer elettrovalvole, uno collegato ad una sorgente di pressione di 0,5 atm (compressore) e il secondo alla pressione atmosferica. Le elettrovalvole vengono ripetutamente aperti per circa 7 msec per aumentare o diminuire la pressione nella condotta fino al raggiungimento del valore desiderato. NOTA: questo approccio è stato adattato da Carlos Bustamante 20, e produce un flusso più regolare rispetto all'utilizzo di una pompa a siringa motore passo-passo 21.
- Aggiungere un trasduttore di pressione controllato da un software personalizzato scritto per monitorare la pressione effettiva esercitata sul serbatoio pressione. Pressioni di esercizio tipiche sono dell'ordine di 20 mbar per montaggio manubrio e 200 mBar per il lavaggio dei componenti del sistema di flusso.
4. Tailing DNA con Biotinylated desossicitidina trifosfato (biotina-dCTP)
La molecola di DNA deve essere più lungo di 1 micron per facilitare la sua estensione sotto flusso e l'ancoraggio ai talloni intrappolati. Inoltre, una lunga DNA impedirà la luce IR intrappolamento di illuminare la proteina legante il DNA. Questo è di particolare importanza per l'assorbimento della luce a infrarossi da un eccitato risultati cromofori in aumento photobleaching. NOTA: Nel presente studio, la molecola di DNA era lungo 3,7 micron. La molecola conteneva tre copie del primario operatore O1 e una copia di ciascuno dei due operatori ausiliari, O2 e O3. Queste sequenze sono state inserite nel mezzo della molecola, risultando quindi circa equidistante dalle perline intrappolati e raggi laser IR.
- Mescolare 1 pmol di DNA 3'-end lineari con 60 pmol di biotina-14-dCTP, 4 ml di 5x Terminal deossinucleotidil transferasi (TdT) tampone (1 M di potassio cacodylate, 125 mM Tris, 0,05% (v / v) Triton X-100, 5 mM CoCl 2 (pH 7,2 a 25 ° C)) e 1,5 ml di TdT e DDH 2 O per un volume totale di 20 microlitri. Incubare la miscela a 37 ° C per 15 min. Ciò comporterà l'aggiunta di fino a 60 nucleotidi per estremità del DNA. Si noti che il DNA 3'-sporgenze sono pedinati con maggiore efficienza rispetto estremità da incasso o contundenti.
- Purificare il DNA coda con colonne di spin o fenolo / estrazione con cloroformio e successiva precipitazione in etanolo per rimuovere CoCl 2 dal buffer di reazione TdT.
- Dopo la purificazione, il DNA può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane oa -20 ° C per periodi più lunghi, ma evitare lo scongelamento ripetuti e ricongelamento.
5. Etichettatura proteine tiolo gruppi con ATTO532
Etichettatura attraverso la modificazione di residui di cisteina non deve alterare l'attività della proteina. Per ovviare a questo problema, abbiamo utilizzato un LacI mutante, LacIQ231C, which trasporta solo una cisteina per monomero alla posizione 231 Questo mutante mantiene le stesse caratteristiche del tipo selvaggio e modificazioni chimiche in posizione 231 hanno dimostrato di non interferire con la stabilità proteica 22. NOTA: Abbiamo etichettato la proteina con ATTO532 maleimide.
- Assicurarsi che la proteina è disciolta in un tampone con un pH compreso 7,0-7,5 e con una concentrazione che varia da 2 a 10 mg / ml. NOTA: in questi esperimenti, LacI è stato disciolto in fosfato di potassio 0,3 M, 5% di glucosio, pH 7,5 (tampone A).
- Sciogliere Tris- (2-carbossietil) fosfina cloridrato (TCEP) ad una concentrazione finale di 100 mg / ml di H 2 O. TCEP soluzione va preparata di fresco prima dell'uso.
- Mescolare 100 ml di proteina con 3 microlitri TCEP e con attenzione vortex.
- Sciogliere il colorante in N, N -dimethylformamide (DMF) ad una concentrazione finale di 10 mg / ml di lavoro in condizioni di scarsa luminosità. Vortex fino a completa dissoluzione.
- Mi di reazionex: Aggiungere 33 ml di colorante alle proteine + TCEP e vortex con attenzione. Rotazione veloce a raccogliere quanto più soluzione possibile.
- Incubare la miscela di reazione per 2 ore in un agitatore (8.000 rpm) a 20 ° C (o 4 ° CO / N), al riparo dalla luce.
- Sciogliere L-Glutatione ridotto (GSH) ad una concentrazione finale di 100 mg / ml in H 2 O. Aggiungere 3 ml di miscela di reazione e incubare l'agitatore a 8,000 rpm per 15 min. GSH si arresta la reazione bloccando la reattività dei gruppi tiolici.
- Purificare la proteina marcata con colonne di filtrazione gel standard, dialisi o concentratori di spin. NOTA: In questi esperimenti, etichettato LacI è stato purificato utilizzando 10 kDa concentratori taglio di spin.
- Diluire la miscela di reazione fino a 12 ml di tampone A, applicarlo al dispositivo concentratore e centrifugare a 8000 xg, 1 ora, 4 ° C. Il LacI marcata viene quindi concentrata a un volume finale di 500 microlitri e il colorante in eccesso passa la membrana nel flow-through. Gettare il flow-through e ripetere il punto 5.8.1 almeno tre volte.
- Dividere la proteina marcata in piccole aliquote e conservare a -80 ° C. Evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento.
6. combinato ottico Trapping e singola molecola esperimenti di imaging di fluorescenza
- Aggiungere 1 ml di tampone A per i contenitori di buffer e applicare pressione di 200 mbar a lavare i tubi di collegamento e il flusso delle cellule. Per massimizzare la diffusione della proteina legante il DNA, qui e nelle seguenti procedure, tampone A possono essere sostituiti con un tampone a bassa forza ionica. NOTA: In questi esperimenti, abbiamo usato TBE 0.5x.
- Verificare la presenza di bolle d'aria, che possono influenzare negativamente la scorrevolezza del flusso. Un film delicato sul tubo di scarico aiuterà a rimuovere eventuali bolle rimanenti.
- Diminuire la pressione a 20 mbar e verificare che tutti i canali ei tubi sono chiare da bolle d'aria e il buffer flussi con velocità simili in tutti i canali.
- Preparare i campioni ad un volume finale di 300 ml: rivestite di streptavidina sferette di polistirene 1,87 micron; 20 pM di DNA lineare, biotinilato su entrambe le estremità conformemente alla sezione 4; 300 pM di LacI tetramero etichettato con ATTO532 conformemente al punto 5.
- Aggiungere a ciascun campione uno dei contenitori siringa nel seguente ordine: perline nel primo canale, DNA nel secondo, terzo canale con il tampone di imaging unica (sistema A + scavenger di ossigeno buffer) e la proteina marcata nel quarto canale.
- Accendere il flusso su a 200 mbar per 3 minuti per lasciare che i campioni arrivano all'interno del canale di flusso. Quindi ridurre la pressione a 20 mbar.
- Mentre l'imaging il primo canale sotto illuminazione in campo chiaro, accendere le due pinzette ottiche e prendere una sferetta di polistirene in ogni trappola.
- Muoversi rapidamente al secondo canale, per evitare che altre perle di cadere nelle trappole. Si noti che l'arrivo nel canale DNA è facilmente evidente dalla fine del flusso tallone.
- Uso one AOD, spostare una trappola (tallone) avanti e indietro in prossimità del secondo tallone per consentire il fissaggio del DNA flusso esteso tra i due perle otticamente intrappolati. Quando si forma un manubrio DNA, il tallone statica inizia seguendo il movimento del tallone che è attivamente spostato avanti e indietro dalla trappola.
- Muoversi rapidamente al canale tampone e spegnere il flusso del buffer. Eseguire una forza-estensione curva di analisi 4,23-25 per verificare la presenza di una singola molecola di DNA. Se più di una molecola è presente (cioè, la entalpico, sollevando fase della curva di forza-estensione avviene ad una lunghezza più corta della lunghezza del profilo del DNA), scartare il manubrio e ricominciare dal punto 6.7.
- Una volta ottenuto un singolo manubrio DNA, accendere il flusso di nuovo e spostare il manubrio al canale proteina. Passare ampio campo microscopia a fluorescenza per monitorare l'interazione del marcato-LacI con il DNA. Spegnere il flusso e avviare l'acquisizione.
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Representative Results
In un esperimento riuscito, uno (o più) proteine marcate sottoposti vincolante / non vincolante diffusione e / o monodimensionale lungo la molecola di DNA (Figura 3A). La localizzazione delle proteine lungo la molecola di DNA consente la quantificazione dei parametri cinetici in funzione della sequenza di DNA. Quando vengono applicate le condizioni di buffer causano diffusione 1D, è possibile seguire traiettorie proteici, e determinare, per esempio, il coefficiente di diffusione D 1D.
La posizione precisa di un solo punto, in ciascun frame, può essere determinata inserendo Point Spread Function (PSF) con una funzione gaussiana bidimensionale o, in alternativa, quando si maneggia un grande insieme di dati, con un più rapido, algoritmo recentemente pubblicato (radiale Simmetria Center, RSC) 26,27. Quest'ultimo metodo determina il punto di massima simmetria radiale dell'immagine, raggiungendo una precisione di localizzazione che è tipicamente comparabile con raccordo gaussiana. In bocasi th, monitoraggio possono essere raggiunti attraverso le routine MATLAB si può accedere liberamente 27.
Figura 3A mostra una kymogram di un tipico esperimento in cui una singola molecola LacI diffonde lungo non specifiche sequenze di DNA, mentre un'altra molecola LacI è specificamente destinata a un operatore, situato nel centro della molecola di DNA. Figura 3B mostra la posizione dei due molecole laci (ottenuti utilizzando RSC) lungo la direzione che collega i centri dei due trappole (x), in funzione del tempo. Dalla posizione della molecola diffondente lungo la molecola di DNA, è stata calcolata la Mean Square spostamento (MSD) a diversi intervalli di tempo secondo la seguente equazione:
(1)
dove N è il numero totale di posizioni misurate e n è l'indice di misura f andare rom 1 a N. Nel caso di pura diffusione browniano unidimensionale, l'MSD è direttamente proporzionale an Dt (Dt è l'intervallo di tempo tra due fotogrammi consecutivi, 100 msec nei nostri esperimenti), con una pendenza pari al doppio del coefficiente di diffusione (MSD (n, N) = 2D 1 nΔt). Figura 4 mostra la MSD vs nΔt trama per la molecola di DNA diffusione lungo. Il coefficiente di diffusione della proteina può essere facilmente ottenuto da un fit lineare del MSD vs nΔt trama. Si noti che al crescere di n, il numero di punti per il calcolo MSD da Eq. 1 di conseguenza diminuisce. L'errore nella valutazione del MSD quindi aumenta con n. Per questo motivo, abbiamo scelto di limitare la nostra analisi per n = N / 4. Si tratta comunque di un valore abbastanza grande rispetto alla N / 10 usato da molti laboratori.
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Figura 1 L'apparato sperimentale è costituito da: lampada alogena (H), condensatore (C), del campione (S), traduttori piezo (XY e Z), oggettiva (O), una macchina fotografica a basso ingrandimento (CCD 200X) e un alto -magnification fotocamera (CCD 2,000X) utilizzato per le valutazioni nm-stabilizzazione (BS è un cubo 50:50 beam splitter). pinzette ottiche doppie sono inseriti ed estratto dal asse ottico del microscopio mediante specchi dicroici (D2 e D3) e comprendono: Nd: YAG (1.064 nm), isolatore ottico (OI), λ / 2 waveplates, polarizzando cubi beam splitter (PBS), deflettori acusto-ottico (AOD), 1.064 nm filtri interferenziali (F1 e F2), rivelatore quadranti fotodiodi (QDP). Segnali dal QDPs sono state acquisite attraverso un convertitore analogico-digitale (ADC) ed elaborati con una scheda FPGA. Due sintetizzatori digitali dirette personalizzate (DDS) ha spinto i AOD per controllare la posizione di trappole. Una tavola input-output digitale (DIO) controllava ilapertura di due elettrovalvole (V1 e V2) collegati ad un compressore (0,5 atm) e pressione ambiente (0 atm), rispettivamente. Un software Labview monitorata la pressione all'interno del serbatoio (C1) attraverso un misuratore di pressione (PM) e aperto automaticamente una delle due valvole di raggiungere il livello di pressione desiderato. Fluorescenza di eccitazione è stato fornito da un duplicato laser Nd: YAG (532 nm) e l'immagine proiettata su un elettrone moltiplicato fotocamera (EMCCD). M è uno specchio mobile, F3 un filtro di emissione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2 Schema di (A) sistema di flusso. Il sistema di controllo pressione è composto da un misuratore di pressione (PM) e due elettrovalvole V1 e V2 colleganoed a un compressore a 0,5 atm (PRS) e alla pressione ambiente (ATM), rispettivamente. X1 e X2 rappresentano connettori a 3 vie. L'apertura delle valvole è finemente regolata per raggiungere la pressione desiderata nel serbatoio C1 pressing 4 contenitori tampone. Ogni tubo di ingresso include una indipendente valvola on / off all'ingresso della camera di flusso multicanale. Il tubo di uscita è collegato al contenitore di rifiuti C2 livello locale a pressione ambiente. I disegni non sono in scala. (B) Rappresentazione schematica della camera di flusso multicanale. Quattro flussi laminari traslocano separatamente perle di polistirene funzionalizzati, molecole di DNA, di buffer di immagini e proteine marcate. Due perle sono catturati con due pinzette ottiche e spostati nel canale DNA per permettere l'ancoraggio del DNA tra di loro. Una analisi del DNA forza-estensione viene eseguita nel canale tampone per verificare la presenza di una singola molecola di DNA e, solo successivamente, il DNA viene incubato nel canale proteina. L'inserto mostra un magnizione del costrutto molecolare finale, pronto per singola molecola di imaging nel canale tampone. I disegni non sono in scala. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3 localizzazione di molecole singole laci interagiscono con una molecola di DNA allungata. (A) L'asse verticale del kymogram rappresenta la coordinata x, parallela alla molecola di DNA, mentre l'asse orizzontale rappresenta il tempo (tempo di acquisizione 100 msec). (B ) posizione X della molecola LacI vs tempo. La posizione delle molecole è stata determinata mediante RSC. Le immagini sono state acquisite a 100 msec tempo di esposizione e 1.25 x 10 -2 W cm -2 EXCIintensità del laser zione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4 Trama del MSD vs tempo per una singola molecola LacI diffondendo lungo una molecola di DNA allungato. L'MSD viene calcolata dal record posizione rappresentata nella figura 3B (rosso). Il coefficiente di diffusione D 1D, ottenuto dalla regressione lineare dei dati rappresentati in figura, è 0,030 ± 0,002 micron 2 sec -1.
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Discussion
Negli ultimi dieci anni, le tecniche di manipolazione e di imaging singole molecole hanno visto grandi progressi in termini di risoluzione spaziale e temporale. La combinazione di tecniche di manipolazione e di imaging è alla base di strumenti potenti che ora permettono il controllo delle condizioni meccaniche di un singolo polimero biologico, come DNA, RNA o filamenti del citoscheletro, e la localizzazione simultanea di singole proteine interagenti con lo stesso polimero . Controllare le condizioni meccaniche del polimero intrappolato è di particolare interesse. Infatti, nelle cellule viventi, gli acidi nucleici sono continuamente sottoposti a sollecitazioni meccaniche causate interagendo enzimi e proteine; similmente, una complessa rete di proteine interagenti e motori molecolari modula tensione filamenti del citoscheletro. D'altra parte, la possibilità di rilevare e localizzare precisamente proteine che interagiscono con gli acidi nucleici, permette la misura di interazioni molecolari in funzione della loro posizione lungo la sequenza di DNA o RNA.
Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging tecniche richiede un'attenta progettazione del setup sperimentale e costrutti biologici. Trappole ottici devono fornire un supporto stabile, garantendo la stabilità a livello nm del polimero sospesa. Tale stabilità può essere raggiunta attraverso un'attenta isolamento dell'apparato sperimentale dalle numerose fonti di rumore meccanico e riducendo al minimo il laser di puntamento e le fluttuazioni di ampiezza. Precisi (sub-nm) i movimenti di trappole ottiche sono realizzati utilizzando AOD guidate da DDS. Qui, abbiamo illustrato un protocollo step-by-step per ottimizzare e verificare la stabilità pinzette ottiche "a livello di nm.
A grande campo semplice microscopia a fluorescenza accoppiato ad una telecamera EMCCD viene utilizzato per localizzare singoli cromofori che interagiscono con il polimero in sospensione. Il nostro test sperimentale è limitato a lunga DNA o molecole di RNA (≥6 KBP) per garantire una scommessa separazione spazialeween la cattura raggio laser e la sonda fluorescente. Infatti, sovrapposizione del laser nel vicino infrarosso cattura con il laser di eccitazione visibile porterebbe a maggiore photobleaching dei cromofori causa dell'assorbimento della luce vicino infrarosso mentre il cromoforo è nello stato eccitato 16. Montaggio Dumbbell è un'altra procedura delicata che è meglio ottenuto utilizzando una cella a flusso multicanale, per il quale abbiamo fornito una descrizione dettagliata. Abbiamo indicato come ottimizzare il flusso di tampone e come evitare bolle d'aria, che possono comunque compromettere seriamente gli esperimenti. Abbiamo descritto i protocolli per l'etichettatura delle estremità del DNA con biotina, che è richiesto per il montaggio manubri con perle rivestite di streptavidina, e protocolli per l'etichettatura delle proteine. Infine, abbiamo illustrato passo-passo le operazioni da eseguire esperimenti in cui il legame e la diffusione di una singola molecola di repressore del lattosio in una molecola di DNA allungato è quantificato.
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Acknowledgments
Ringraziamo Gijs wuite, Erwin JG Peterman, e Peter Gross aiuto per la microfluidica e Alessia Tempestini di aiuto per la preparazione del campione. Questa ricerca è stata finanziata dal Settimo programma quadro dell'Unione europea (7 ° PQ / 2007-2013), contratto di sovvenzione n ° 284.464 e dal Ministero italiano dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro in Ricerca 2013 RBFR13V4M2, e nel quadro di il Flagship Progetto NANOMAX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies |
| Optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | |
| Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | |
| Acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | ||
| Quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | |
| Electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | |
| Silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | |
| Pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapor (No 1272/2008) |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) |
| Heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120 °C |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | |
| Polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | |
| Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | |||
| Luer lock-tip syringes 2.5 ml | Terumo | SS 02LZ1 | |
| Shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | |
| Flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | |
| Fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | |
| Two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | |
| Pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | |
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | |
| Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 |
References
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