Summary
Hier beschrijven we de instrumenten en werkwijzen voor het detecteren enkele fluorescentie-gemerkt eiwitmoleculen interactie met een enkel DNA-molecuul opgehangen tussen twee optisch gevangen microsferen.
Introduction
Enkel molecuul (SM)-technieken zijn sterk ontwikkeld in de afgelopen dertig jaar te spelen op de behoefte van het overwinnen van een aantal van de beperkingen van de traditionele, buikoplossing metingen 1-3. De manipulatie van enkele biologische moleculen heeft de mogelijkheid om de mechanische eigenschappen van biopolymeren 4 meten en controleren van de mechanische parameters van eiwit-eiwit 5 en eiwit-DNA interacties 6,7 gemaakt. SM fluorescentiedetectie, anderzijds, vertegenwoordigt een enorm veelzijdig hulpmiddel om eiwitactiviteit in vitro en in vivo, waardoor de mogelijkheid van het lokaliseren en volgen enkele moleculen nanometerprecisie. Door montage van het instrument point spread-functie beeld SM, in feite, kan lokalisatie bereiken met een precisie hoofdzakelijk afhankelijk signaal-ruisverhouding (SNR) en tot een maximum van ongeveer een nanometer 8,9. Deze methodieken vind krachtigtoepassingen in de studie van de dynamica van motorische eiwitten, alsmede de diffusie processen die doelzoek- in DNA-bindende eiwitten. Het vermogen van het bepalen diffusieconstanten als functie van de DNA-sequentie, verblijftijd op het substraat en nauwkeurig meten van de DNA lengte onderzocht tijdens eendimensionale diffusie events, vormen een krachtig hulpmiddel voor de studie van proteïne-DNA-interactie dynamiek en het onderzoek van de mechanismen van de specifieke doelgroep zoeken.
Onlangs is de combinatie van deze twee technieken een nieuwe generatie meetopstellingen 10-14 die gelijktijdige manipulatie van een biologisch substraat (bijvoorbeeld een actine filament of een DNA-molecuul) en detectie / lokalisatie van een interactie partner enzym (bijvoorbeeld geproduceerd myosine of een DNA bindend eiwit). De voordelen van deze technieken voornamelijk berusten op de mogelijkheid oefenen mechanische controle over de gevangen polymeer, waardoor enabling de studie van de interactie tussen de dynamiek versus krachten of koppels. Ook de methode maakt metingen van biochemische reacties ver van het oppervlak voorkomen een van de belangrijkste beperkingen van klassieke SM methoden, namelijk de noodzaak van immobilisatie van de moleculen onder studie op een oppervlak (glasplaatje of microbolletjes).
De combinatie van twee enkelvoudige moleculen technieken vereist het overwinnen van enkele technische problemen, vooral als gevolg van de eisen van de mechanische stabiliteit en voldoende SNR (vooral wanneer die lokalisatie met nm precisie) 15. In het bijzonder wanneer SM fluorescentie detectie koppeling met een optisch pincet, de vermindering van het lawaai en fotobleken van de trapping infrarode lasers 16 en de controle van biochemische buffers voor de montage van de biologische complexen en de prestaties van de experimentele metingen 11 van het allergrootste belang. Hier beschrijven we de werkwijzen voor succesvolle uitvoeringmetingen in een dual trapping / SM Fluorescentie lokalisatie setup. De methodiek wordt geïllustreerd met het voorbeeld van lactose repressor eiwit (LacI) fluorescent gelabelde (met Atto532) en gedetecteerd als het bindt aan een DNA-molecuul (opgesloten tussen twee optische pincetten) met specifieke LacI bindingssequenties (dwz operators). We tonen de doeltreffendheid van de werkwijze het detecteren van binding van LacI aan DNA en diffusie langs de contour in het doel zoekproces. De methode is van toepassing op elke combinatie van DNA-sequentie en DNA-bindende eiwit, en andere systemen (microtubuli en actine filamenten en de motor eiwitten interactie met hen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 optisch pincet Setup met nanometer Stabiliteit
De experimentele opstelling moet twee optische pincetten bieden met het richten van de stabiliteit op de nanometer niveau en de intensiteit schommelingen van de trapping laser onder de 1%. Combinatie van deze voorwaarden zal nanometer stabiliteit van de halter onder normale spanning te verzekeren (1 pN - enkele tientallen PN), val stijfheid (0,1 pN / nm) en meetbandbreedte (beeldaanwinst tarief 20 sec -1). Een schema van de experimentele opstelling is weergegeven in figuur 1.
- Optische ontwerp en de bouw pincet 15,17:
- Monteer de experimentele apparaten op een optische tafel met actieve isolatoren aan mechanische trillingen te verminderen. Monteer de microscoop structuur op elastomeer isolatoren aan de akoestische muziek en mechanische resonanties van de microscoop structuur absorberen.
- Plaats een optische isolator in de weg van de opsluitende laser, bij laserbron, reduce willekeurige amplitude schommelingen als gevolg van optische feedback.
- Verlaag de weglengte van de vangst laser zoveel mogelijk en omsluiten de gehele pad in een verzegelde doos laser richtend fluctuaties door luchtstromen en turbulentie te verminderen.
- Maak double optisch pincet door het splitsen van een nabij-infrarood laserbron (Nd: YAG laser, 1064 nm golflengte) in twee bundels met orthogonale polarisaties. Gebruik geen time-shared vallen, omdat ze leiden tot oscillatie van de halter onder spanning 12.
- Gebruik akoestisch-optische deflectors (gedelegeerde ordonnateurs) gedreven door Direct Digital Synthesizer (DDSS) om fijne bewegingen van (ten minste) een val en nauwkeurige regeling van DNA spanning staan. DDSS maken een betere stabiliteit dan val-voltage controlled oscillatoren (VCO).
- Plaats twee kwadranten detektor fotodiodes (QDPs) in de achterkant brandvlak van de condensor om de positie van de gevangen korrels nauwkeurig sub-nm gedetecteerd.
- Controleer of de intensiteit fkijkt wat van de trapping laser op de microscoop ingang zijn onder de 1% met behulp van een fotodiode met een bandbreedte groter dan het tarief van de beeldopname.
- Controleer wijzen stabiliteit van de twee trapping lasers:
- Bereid silicapareltjes in fosfaatbuffer: Verdun 20 pi silicapareltjes (1,54 urn, 10% vaste stof) in 1 ml aceton, ultrasone trillingen 30 sec, vortex kort en centrifugeer 2 minuten bij 19.000 x g. Resuspendeer in 1 ml aceton en herhaal wassen. Resuspendeer in 1 ml 50 mM fosfaatbuffer, was 2 maal en tenslotte resuspendeer in 100 ul van 50 mM fosfaatbuffer.
- Kalibreer optisch pincet met silica beads: bereid een stroomcel door het aanbrengen van een dekglaasje op een objectglaasje met dubbelzijdig plakband (ongeveer 60 urn dik). Flow 1 mg / ml BSA en wacht 3 minuten. Flow silica kralen verdund 1/1000 in fosfaatbuffer en sluit de stroom kamer met siliconenvet. Trap een kraal in elke val en kalibreren de vallen met de power spectrum methode 18. Bereid silicapareltjes in pentyl acetaat en nitrocellulose: Verdun 20 pi silicapareltjes (1,54 urn, 10% vaste stof) in 1 ml aceton, ultrasone trillingen 30 sec, vortex kort en centrifugeer 2 minuten bij 19.000 x g. Resuspendeer in 1 ml aceton en herhaal wassen. Resuspendeer in 1 ml pentylacetaat en was 2 keer. Tenslotte resuspendeer ze in pentylacetaat met 0,1% nitrocellulose opgelost in pentylacetaat.
- Spreid 2 ui 1,54 urn diameter silicapareltjes opgelost in pentylacetaat + 0,1% nitrocellulose op het oppervlak van een dekglaasje (24 x 24 mm) met een tweede dekglaasje (24 x 60 mm). Bevestig het dekglaasje op een objectglaasje met twee stukken dubbelzijdige tape een stroomcel maken. Vul het stroom-cel met 50 mM fosfaatbuffer en verzegelen met siliconenvet.
- Beeld dat men silica kraal in helderveld microscopie op 2,000X vergroting. Het gezichtsveld moet 7 x 5 urn verkregen bij 768 x 576 pixel, zodat het beeld kraal heeft een diameter van 190 pixels. Compensatie thermische afwijkingen met een feedback software die, zoals in ref. 17 berekent xy positie van het beeld en zwaartepunt z van de diffractie ringen en corrigeert afwijkingen verplaatsen van een piëzo podium met nm-precisie of beter.
- Overlap het centrum van links val met de hiel midden (de xy signaalniveaus van de QDP moet dezelfde gemeten tijdens de kalibratie) en meet de positie geluid en de standaardafwijking van de QDP. Herhaal de meting voor de juiste val.
2 Single Molecule Localization met nanometer nauwkeurigheid
- Fluorescentie microscopie ontwerp en de bouw 15,19
- Gebruik een hoog kwantumrendement en elektronen vermenigvuldigd CCD en hoge signaal-ruisverhouding noodzakelijk nanometernauwkeurigheid lokalisatie bereikt.
- Kies optiek een pixelgrootte ~ 80 nm te krijgen (bijvoorbeeld een vergroting ~ 200X met een camera pixelgrootte van 16 um). Dit is suffidoende klein lokalisatiefout verwaarlozen door pixelation 8, maar groot genoeg om een groot aantal fotonen per pixel verzamelen.
- Als excitatie bron gebruikt laserlicht dat is gepolariseerd (door passage door een niet-polarisatiebehoudende glasvezel) of circulair gepolariseerd (door passage door een λ / 4 golfplaat) tot excitatie van enkele chromoforen maximaliseren, ongeacht hun oriëntatie.
- Kies emissie bandpass filters die efficiënt afgesneden zowel excitatie en trapping laserlicht. Opmerking: In onze experimenten gelabeld we onze eiwit met Atto532 kleurstof en gebruikt een bandpass emissie filter gecentreerd bij 600 nm met 100 nm bandbreedte.
3 Microfluidics
Om een nauwkeurige controle van de buffer uitwisseling en 'halter' assembly, dat wil zeggen, de verankering van een enkel DNA-molecuul tussen twee optisch gevangen microbolletjes, een custom-built laminaire multichannel doorstroming te bereikensysteem worden ontwikkeld. Deze bestaat uit een stromingskamer, een druk-reservoir en een drukregelsysteem (figuur 2).
- Flow celpreparaat
OPMERKING: De stroom kamer wordt gebruikt voor single-molecule experimenten op eiwit-DNA-interactie heeft bij voorkeur 4 ingangen en 1 uitgang, om maximaal 4 parallelle buffer stromen, elk met een van de verschillende componenten die nodig zijn voor het experiment: kralen, DNA, fluorescentie-gemerkt eiwit en imaging buffer. Scheiding van de componenten in de stroom-kanalen maakt een efficiënte inbouw van een halter. Bovendien is de beeldvorming kanaal is nuttig om achtergrondfluorescentie voorkomen diffundeert eiwitten en bereiken de hoge signaal-ruisverhouding vereist voor de lokalisatie van het DNA-bindende eiwit met een nauwkeurigheid in de orde van enkele nanometers.- Boor gaten 1 mm diameter in het objectglaasje (76 x 76 x 1 mm) met een diamant-tip, om 4 ingangen en een uitgang creëren.
- Clean the microscoopglaasjes met ethanol en centreren de poort met de O-ring geplaatst en de lijm ring in de slede rond de toegangsopeningen. Het is van fundamenteel belang om handschoenen te dragen tijdens deze stap om vingerafdrukken, die het lijmen proces zou verstoren voorkomen.
- Klem de NanoPorts aan de glijbaan, en plaats deze in de voorverwarmde oven op 180 ° C gedurende 1 uur om volledige bevestiging mogelijk te maken.
- Teken de omtrek patroon van de stroomcel op een stuk papier. De kanalen moeten worden ~ 3 mm breed en overeenkomen met de gaten positie op het objectglaasje.
- Leg de tekening op de top van twee stukken van Parafilm, en met een scalpel te scherp en voortdurende bezuinigingen langs de getekende omtrek. Verwijder eventuele uitstulping gevormd. Gooi de onderste Parafilm laag, die alleen wordt gebruikt om een schone support garanderen.
- Plaats de microscoop dia met de bijgevoegde NanoPorts ondersteboven in de metalen steun.
- Lijn de Parafilm kamer schets met de gaten en zorg ervoor dat eop de parafilm niet opdringen de inlaten en uitlaat van de kamer.
- Dek af met een schoon microscoop dekglaasje (62 x 56 x 0,15 mm) en verwijder voorzichtig overtollige Parafilm rondom de kamer.
- Plaats twee verwarmingsblokken vooraf bij 120 ° C verwarmd, bovenop de stroomcel constante druk uitoefenen op het. Laat de Parafilm smelten voor ongeveer 25 minuten.
- Druk reservoir en buffer containers
De druk reservoir moet worden gemaakt van plexiglas (of soortgelijke) en laat accommodatie zes buffer containers. De mogelijkheid om ten minste twee extra buffer containers verbetert de flexibiliteit instrument. Merk op dat transparante containers en buizen aanzienlijk helpen in flow-systeem hanteren en oplossen van problemen van ingesloten luchtbellen. Steriele en disposable luer lock-tip spuiten (2,5 ml), waarvan de plunjers eerder zijn verwijderd, zijn goede buffer containers en maken een gemakkelijke verbinding met de inlaatslang. Zorg ervoor dathet totale vloeistofvolume is klein vergeleken met de hoeveelheid lucht in het drukreservoir, een voorwaarde noodzakelijk om een goede en stabiele stroom te verkrijgen.- Sluit afsluiters bij de uitgang van de buffer containers voor het draaien van de buffer stroom aan of uit tijdens de experimenten.
- Monteer de stroom cel op de microscoop podium. Sluit de afsluiters aan de stroom kamer inlaten met polyetheretherketone buis (binnendiameter ~ 150 micrometer) en flensloze fittingen. Voeg ~ 3 cm van gefluoreerde ethyleen-propyleen-buis (binnendiameter ~ 500 micrometer) als een koppeling tussen de slang en de NanoPort vergaderingen van de stroom cel. Deze stap is essentieel om de buffer stroom bij de inlaatkamer verminderen breuk van de stroomcel of NanoPort onthechting van het glas te vermijden. Het gebruik van grote buis binnendiameter alleen, anderzijds, zouden grote hoeveelheden biologische monsters nodig.
- Sluit de stromingskamer uitlaat een open Falcon buis bij atmosferische druk. Dezebuis dient als beschikking voor de buffer stroomt uit de stroming kamer.
- Drukregeling
- Bouw een drukregeling kan fijn instellen van de luchtdruk in het drukreservoir. Dit kan door twee computergestuurde magneetventielen, een verbonden met een 0,5 atm drukbron (compressor) en de tweede tot atmosferische druk. Magneetafsluiters herhaaldelijk geopend ongeveer 7 msec te verhogen of de druk te verlagen in de lijn totdat de gewenste waarde is bereikt. LET OP: deze aanpak werd aangepast van Carlos Bustamante 20, en het levert een betere doorstroming dan het gebruik van een stappenmotor injectiepomp 21.
- Voeg een drukomzetter geregeld door een op maat ontworpen software om de effectieve druk op het drukreservoir controleren. Typische de werkdruk in de orde van 20 mbar voor halter montage en 200 mbar voor het wassen van de stroom systeemcomponenten.
4 DNA Tailing met Biotinylated Deoxycytidine trifosfaat (biotine-dCTP)
Het DNA molecuul moet langer dan 1 urn om haar uitbreiding onder de stroom en verankering aan de gevangen beads vergemakkelijken. Bovendien zal een lange DNA voorkomen IR trapping licht verlichten DNA bindend eiwit. Dit is van bijzonder belang omdat de absorptie van IR-licht van een opgewonden chromofoor resulteert in een verhoogde fotobleking. OPMERKING: In de huidige studie, het DNA-molecuul was 3,7 micrometer lang. Het molecuul bevat drie kopieën van de primaire operator O1 en een kopie van elk van de twee extra operatoren, O2 en O3. Deze sequenties zijn ingevoegd in het midden van het molecuul, hetgeen resulteert ongeveer gelijke afstand van de gevangen kralen en IR laserstralen.
- Meng 1 pmol van lineair DNA 3'-uiteinden met 60 pmol van biotine-14-dCTP, 4 pl 5x Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) buffer (1 M kalium cacodylate, 125 mM Tris, 0,05% (v / v) Triton X-100, 5 mM CoCl2 (pH 7,2 bij 25 ° C)) en 1,5 pl TdT en DDH 2 O tot een totaal volume van 20 ul. Incubeer het mengsel bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Dit resulteert in de toevoeging van tot 60 nucleotiden per DNA uiteinde. Merk op dat DNA 3'-overhangen zijn tailed met hoger rendement dan verzonken of stompe uiteinden.
- Zuiver tailed DNA met spin kolommen of fenol / chloroform extractie en de daaropvolgende ethanolprecipitatie om CoCl2 verwijderen uit de TdT reactie buffer.
- Na zuivering, kan DNA worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele weken bij -20 ° C voor langere periodes maar niet herhaaldelijk ontdooien en opnieuw invriezen.
5. Labeling Eiwit thiolgroepen met ATTO532
Labelen door modificatie van cysteïne residuen moeten niet weg eiwit activiteit. Om dit probleem op te lossen, hebben we gebruik gemaakt van een LacI mutant, LacIQ231C, ontwh draagt slechts een cysteïne per monomeer op positie 231 Deze mutant behoudt dezelfde eigenschappen van het wildtype en chemische modificaties op positie 231 is aangetoond dat ze niet interfereren met eiwitstabiliteit 22. LET OP: Wij gelabeld het eiwit met ATTO532 maleïmide.
- Zorg ervoor dat het eiwit wordt opgelost in een buffer met een pH lopend 7,0-7,5 en met een concentratie variërend van 2 tot 10 mg / ml. Opmerking: in deze experimenten werd LacI opgelost in 0,3 M kaliumfosfaat, 5% glucose, pH 7,5 (buffer A).
- Los tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride (TCEP) tot een uiteindelijke concentratie van 100 mg / ml in H2O TCEP oplossing moet vers bereid vóór gebruik.
- Meng 100 pi van het eiwit met 3 ul TCEP en vortex goed.
- Los de kleurstof in N, N-dimethylformamide (DMF) om een eindconcentratie van 10 mg / ml werken bij weinig licht. Vortex tot het volledig is opgelost.
- Reactie mix: Voeg 33 ul van kleurstof aan het eiwit + TCEP en vortex voorzichtig. Snelzwierend zoveel oplossing te verzamelen.
- Incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur in een shaker (8.000 rpm) bij 20 ° C (of bij 4 ° CO / N), beschermd tegen licht.
- Los L-Glutathione gereduceerd (GSH) tot een uiteindelijke concentratie van 100 mg / ml in H2O Voeg 3 ul aan het reactiemengsel en incubeer op de schudinrichting bij 8000 rpm gedurende 15 minuten. GSH de reactie te stoppen door blokkering van de reactiviteit van thiolgroepen.
- Zuiver het gemerkt eiwit met behulp van standaard gelfiltratiekolommen, dialyse of draai concentrators. Opmerking: In deze experimenten werd gelabeld LacI gezuiverd middels 10 kDa cutoff rotatie concentrators.
- Verdun het reactiemengsel met tot 12 ml van buffer A, toepassen op de concentrator apparaat en Centrifugeer bij 8.000 xg, 1 uur, 4 ° C. De gemerkte LacI is dus geconcentreerd tot een eindvolume van 500 pl en de overmaat kleurstof passeert het membraan in het flow-through. Gooi de doorstroom en herhaal stap 5.8.1 minstens drie keer.
- Verdeel het gelabelde eiwit in kleine porties en bewaar bij -80 ° C. Vermijd herhaaldelijk bevriezen en ontdooien.
6 gecombineerde optische overvullen en Single-molecule fluorescentie beeldvorming Experimenten
- Voeg 1 ml van buffer A tot buffer containers en breng 200 mBar druk de verbindingsleidingen wassen en flow cel. Om diffusie van het bindende eiwit op DNA, naar en in de volgende stappen te maximaliseren, buffer A worden vervangen met een lage ionische sterkte buffer. Opmerking: In deze experimenten gebruikten we TBE 0.5x.
- Controleren op de aanwezigheid van lucht-belletjes, die de stroom gladheid kan verstoren. Een zachte tik op de afvoerbuis zal helpen om eventuele resterende luchtbellen te verwijderen.
- Verlaag de druk tot 20 mbar en controleer of alle kanalen en buizen zijn duidelijk van luchtbellen en de buffer stroomt met vergelijkbare snelheden in alle kanalen.
- Bereid de monsters tot een eindvolume van 300 pi: met streptavidine gecoate polystyreenkorrels 1,87 urn; 20 pM van lineair DNA, gebiotinyleerd aan beide uiteinden overeenkomstig punt 4; 300 pM van LacI tetramer gelabeld met ATTO532 volgens paragraaf 5.
- Voeg elk monster een van de spuit containers in de volgende volgorde: parels in het eerste kanaal, DNA in het tweede, derde kanaal met de beeldvormende enige buffer (buffer A + zuurstofwegvanger systeem) en het gemerkte eiwit in het vierde kanaal.
- Schakel de stroom op 200 mBar gedurende 3 minuten te laten de monsters pas in het stromingskanaal. Dan verminderen de druk tot 20 mbar.
- Terwijl de beeldvorming van de eerste kanaal onder helderveld, het inschakelen van de twee optische pincet en vangen een polystyreenparel in elke val.
- Beweeg snel naar het tweede kanaal te vermijden dat andere kralen vallen in de vallen. Merk op dat de aankomst in het DNA kanaal gemakkelijk zichtbaar door het einde van de kraal flow.
- Met one AOD Verplaats een trap (kraal) heen en weer in de nabijheid van de tweede hiel naar de verbinding van de stroming uitgebreide DNA tussen de twee optisch gevangen kralen mogelijk. Wanneer een DNA halter wordt gevormd, de statische kraal begint na de beweging van de kraal die actief heen en weer door de trap wordt verplaatst.
- Beweeg snel naar de buffer kanaal en zet de buffer flow. Voer een kracht-verlenging curve analyse 4,23-25 om de aanwezigheid van een enkel DNA-molecuul te verifiëren. Als er meer dan een molecuul aanwezig is (dat wil zeggen, de enthalpische, het verhogen fase van de kracht-extensie curve optreedt bij een lengte korter dan de DNA-contour lengte), gooi de halter en begin opnieuw vanaf stap 6.7.
- Zodra een enkel DNA halter wordt verkregen, schakelt u de stroom weer en beweeg de halter aan het eiwit kanaal. Schakel over naar brede veld fluorescentie microscopie om de interactie van de gelabelde-LacI met DNA controleren. Schakel de stroom en start acquisitie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In een succesvolle experiment, ondergaan een (of meer) gemerkte eiwitten bindmiddel / vrijblijvend en / of monodimensional diffusie langs het DNA-molecuul (Figuur 3A). Lokalisatie van eiwitten aan het DNA-molecuul maakt de kwantificering van kinetische parameters als functie van de DNA-sequentie. Als buffer omstandigheden waardoor 1D diffusie toegepast is het mogelijk om eiwitten trajecten volgen en bepalen bijvoorbeeld de diffusiecoëfficiënt D 1D.
De exacte plaats van een enkele vlek in elk frame, kan worden bepaald door het aanbrengen van de puntspreidingsfunctie (PSF) met een tweedimensionale Gaussische functie of, als alternatief, bij het hanteren van grote data set, een snellere, onlangs gepubliceerd algoritme (Radial Symmetrie Center, RSC) 26,27. De laatste methode wordt het punt van maximale radiale symmetrie van het beeld, het bereiken van een lokalisatie precisie die typisch vergelijkbaar met Gaussian fitting. In boste gevallen kan bijhouden worden bereikt door MATLAB routines die vrij 27 toegankelijk.
Figuur 3A toont een kymogram van een typisch experiment waarbij een enkele molecule LacI verspreidt langs niet-specifieke DNA-sequenties terwijl nog LacI molecuul specifiek aan een operator gebonden, zich in het midden van het DNA-molecuul. Figuur 3B toont de positie van de twee LacI moleculen (verkregen middels RSC) in de richting die de middelpunten van de twee traps (x) als functie van de tijd. Vanuit het standpunt van het molecuul diffunderen langs de DNA molecule, berekenden we de Mean Square Displacement (MSD) op verschillende tijdstippen volgens de volgende vergelijking:
(1)
waarbij N het totale aantal posities gemeten en n de meting index van mi rom 1 tot N. Bij zuivere eendimensionale Brownse diffusie, de MSD is recht evenredig met n At (At is het tijdsinterval tussen twee opeenvolgende frames 100 msec in onze experimenten), met een helling gelijk aan tweemaal de diffusiecoëfficiënt (MSD (n, N) = 2D 1 nΔt). Figuur 4 toont de MSD vs nΔt plot voor de molecule het verspreiden langs het DNA. De diffusiecoëfficiënt van het eiwit kan gemakkelijk worden verkregen uit een lineaire regressie van de MSD vs nΔt plot. Merk op dat als n toeneemt, het aantal punten voor het berekenen van MSD Eq. 1 bijgevolg afneemt. De fout in de evaluatie van de MSD aldus toe met n. Daarom kozen we onze analyse beperkt tot n = N / 4. Dit is eigenlijk een vrij grote waarde in vergelijking met de N / 10 gebruikt door veel laboratoria.
tp_upload / 51446 / 51446fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 1 De experimentele opstelling bestaat uit: halogeen (H), condensor (C) monster (S), piezo vertalers (xy en z), doel (O), een lage vergroting camera (CCD 200X) en een hoge -Vergroting camera (CCD 2,000X) voor de nm-stabilisatie feedback (BS is een 50:50 beam splitter cube). dubbel optisch pincet inbrengen en uittrekken van de optische as van de microscoop door dichroïsche spiegels (D2 en D3) en omvatten: Nd: YAG laser (1064 nm), optische isolator (OI), λ / 2 golfplaten, polariserende bundelsplitser blokjes (PBS), acousto-optic deflectors (AOD), 1.064 nm interferentie filters (F1 en F2), kwadrant detector fotodiodes (QDP). Signalen van QDPs werden verworven via een analoog-digitaal omzetter (ADC) en uitgewerkt met een FPGA board. Twee custom-built directe digitale synthesizers (DDS) reed de gedelegeerde ordonnateurs om de positie vallen 'beheersen. Een digitale input-output board (DIO) controleerde deopening van twee magneetventielen (V1 en V2) aangesloten op een compressor (0,5 atm) en omgevingsdruk (0 atm), respectievelijk. Een Labview software bewaakt de druk in de druktank (C1) via een drukmeter (PM) automatisch geopend en een van de twee kleppen het gewenste drukniveau bereikt. De fluorescentie excitatie was door een gedupliceerd Nd: YAG laser (532 nm) en het beeld geprojecteerd op een elektron vermenigvuldigd camera (EMCCD). M is een beweegbare spiegel, F3 een emissie filter. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 (A) Flow systeem diagram. De druk-regelsysteem bestaat uit een drukmeter (PM) en twee elektromagnetische kleppen V1 en V2 verbindened om een compressor op 0,5 atm (PRS) en omgevingsdruk (ATM), respectievelijk. X1 en X2 vertegenwoordigen 3-way connectors. De opening van de kleppen is nauwkeurig op de gewenste druk in het drukreservoir C1 met 4 buffer containers bereikt. Elke inlaat buis is voorzien van een onafhankelijke aan / uit klep aan de ingang van de multichannel stroom kamer. De uitlaat slang is verbonden met de afvalcontainer C2 geplaatst bij omgevingsdruk. Tekeningen zijn niet op schaal. (B) Schematische weergave van de multikanaals stromingskamer. Vier laminaire stromingen afzonderlijk transloceren gefunctionaliseerde polystyreen kralen, DNA moleculen, imaging buffer en gemerkte eiwitten. Twee kralen zijn betrapt met een dubbele optische pincetten en verhuisde naar de DNA-kanaal om DNA te verankeren in de tussen hen. Een DNA kracht-verlenging analyse wordt uitgevoerd in de buffer kanaal de aanwezigheid van een enkel DNA-molecuul te verifiëren en slechts daarna wordt het DNA geïncubeerd in het eiwit kanaal. De inzet toont een magnicatie van de uiteindelijke moleculaire constructie, klaar voor single-molecule imaging in de buffer kanaal. Tekeningen zijn niet op schaal. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Lokalisatie van enkele LacI moleculen interactie met een gestrekte DNA molecuul. (A) De verticale as van de kymogram vertegenwoordigt de x-coördinaat, evenwijdig aan het DNA-molecuul, terwijl de horizontale as is de tijd (100 msec opnametijd). (B ) X-positie van de LacI molecule vs tijd. De positie van de moleculen werd bepaald door RSC. Beelden werden verkregen bij 100 msec belichtingstijd en 1,25 x 10 -2 W cm -2 EXCItatie laserintensiteit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4 Plot van de MSD vs tijd voor een LacI molecule verspreiden langs een uitgerekte DNA-molecuul. MSD wordt berekend uit de positie plaat weergegeven in figuur 3B (rood). De diffusiecoëfficiënt D 1D, verkregen door lineaire regressie van de gegevens weergegeven in de figuur, is 0.030 ± 0.002 urn 2 sec -1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de afgelopen tien jaar hebben enkel molecuul manipulatie en beeldvormende technieken een grote vooruitgang op het gebied van ruimtelijke en temporele resolutie te zien. De combinatie van manipulatie en beeldvormingstechnieken aan de basis van krachtige instrumenten die nu toelaten de controle van de mechanische condities van een biologisch polymeer, zoals DNA, RNA of cytoskelet filamenten en de gelijktijdige lokalisatie van afzonderlijke eiwitten die interageren met hetzelfde polymeer . Beheersing van de mechanische condities van de gevangen polymeer van bijzonder belang. In feite, in levende cellen, nucleïnezuren continu ondergaan mechanische spanning veroorzaakt door interactie enzymen en eiwitten; Ook een complex netwerk van interagerende eiwitten en moleculaire motoren moduleert spanning op cytoskelet filamenten. Anderzijds, de mogelijkheid te detecteren en nauwkeurig eiwitten interageren met nucleïnezuren lokaliseren, maakt de meting van moleculaire interacties in functie van hun positie langs de DNA of RNA sequentie.
De combinatie van single-molecule manipulatie en beeldvormende technieken vereist een zorgvuldige ontwerp van de experimentele opstelling en de biologische constructies. Optische vallen moet een stabiele ondersteuning te bieden, zodat nm-niveau stabiliteit van de geschorste polymeer. Dergelijke stabiliteit kan worden bereikt door een zorgvuldige scheiding van de experimentele apparatuur uit de vele bronnen van mechanisch geluid en door het minimaliseren van laserpointer en amplitude schommelingen. Precieze (sub-nm) bewegingen van de optische vallen worden bereikt met behulp van gedelegeerde ordonnateurs gedreven door DDSS. Hier hebben we geïllustreerde stap-voor-stap protocol optimaliseren en controleer de stabiliteit optische pincetten bij het nm-niveau.
Eenvoudige wide-field epi-fluorescentie microscopie gekoppeld met een EMCCD camera wordt gebruikt om enkele chromoforen interactie met de zwevende polymeer lokaliseren. Onze experimentele assay beperkt tot lange DNA of RNA moleculen (≥6 kbp) een ruimtelijke scheiding bet waarborgenween de trapping laserstraal en de fluorescente probe. In feite zou superpositie van de nabij-infrarode laser vangen met de zichtbare excitatie laser leiden tot verbeterde fotobleken van de chromoforen door absorptie van het nabij-infrarood licht, terwijl de chromofoor in de aangeslagen toestand 16. Dumbbell samenstel is een lastige procedure die beter wordt verkregen met een multikanaals flow cell, waarvoor wij een gedetailleerde beschrijving. We aangegeven hoe de buffer stroom en hoe om luchtbellen, die anders ernstig in gevaar kunnen brengen de experimenten te voorkomen optimaliseren. We beschreven protocollen voor het labelen van de DNA uiteinden met biotine, vereist voor dumbbell montage met met streptavidine beklede parels en protocollen voor het merken van eiwitten. Tenslotte we geïllustreerde stap voor stap verrichtingen experimenten waarin de binding en verspreiding van een lactose repressor molecuul op een uitgerekte DNA molecuul gekwantificeerd voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Gijs Wuite, Erwin JG Peterman, en Peter Gross voor hulp bij de microfluidics en Alessia Tempestini voor hulp bij de monstervoorbereiding. Dit onderzoek werd gefinancierd door de Europese Unie Zevende Kaderprogramma (KP7 / 2007-2013) onder subsidieovereenkomst n ° 284464 en van het Italiaanse ministerie van Onderwijs, Universiteit en Research FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro in Ricerca 2013 RBFR13V4M2, en in het kader van de Flagship Project NANOMAX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies |
| Optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | |
| Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | |
| Acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | ||
| Quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | |
| Electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | |
| Silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | |
| Pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapor (No 1272/2008) |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) |
| Heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120 °C |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | |
| Polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | |
| Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | |||
| Luer lock-tip syringes 2.5 ml | Terumo | SS 02LZ1 | |
| Shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | |
| Flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | |
| Fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | |
| Two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | |
| Pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | |
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | |
| Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 |
References
- Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
- Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
- Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
- Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
- Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
- van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).
- Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
- Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
- Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
- Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
- van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
- Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
- Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).
