Summary
Här beskriver vi instrumentering och metoder för att detektera enstaka fluorescensmärkta proteinmolekyler som interagerar med en enda DNA-molekyl upphängd mellan två optiskt fångade mikrosfärer.
Introduction
Enda molekyl (SM) tekniker har utvecklats mycket under de senaste trettio åren för att svara på behovet att övervinna några av de begränsningar av traditionella, bulkmätningar lösnings 1-3. Den manipulation av enskilda biologiska molekyler har skapat möjligheten att mäta mekaniska egenskaper hos biopolymerer 4 och kontrollera de mekaniska parametrarna för protein-protein 5 och protein-DNA-interaktioner 6,7. SM fluorescensdetektion, å andra sidan, utgör en oerhört mångsidigt verktyg för att studera protein-aktivitet in vitro och in vivo, vilket leder till möjligheten att lokalisera och spåra enskilda molekyler med nanometerprecision. Genom montering av instrumentet punkt-spridningsfunktion till SM bild, i själva verket kan en utföra lokalisering med en precision beroende huvudsakligen på signal-till-brusförhållandet (SNR) och når en gräns av cirka en nanometer 8,9. Dessa metoder hitta kraftfullapplikationer i studiet av dynamiken i motorproteiner, liksom de diffusionsprocesser underliggande målet sökning i DNA-bindande proteiner. Förmågan att bestämma diffusionskonstanter som en funktion av DNA-sekvensen, uppehållstiden på målet och exakt mätning av DNA-längd utforskas under endimensionella diffusion händelser, representerar ett kraftfullt verktyg för att studera protein-DNA-interaktion dynamik och för undersökning av mekanismerna för specifikt mål ökning.
Nyligen har kombinationen av dessa två tekniker produceras en ny generation av experimentella uppställningar 10-14 möjliggör samtidig manipulering av ett biologiskt substrat (t ex en aktin filament eller en DNA-molekyl) och detektion / lokalisering av en samverkande partner enzym (t.ex. myosin eller ett DNA-bindande protein). Fördelarna med dessa tekniker vilar i huvudsak på möjligheten att utöva mekanisk kontroll över den instängda polymeren, sålunda ENAbling studier av interaktionsdynamik kontra krafter eller moment. Dessutom tillåter den metod mätning av biokemiska reaktioner långt från ytan, undviker en av de viktigaste begränsningarna hos klassiska SM metoder, dvs behovet för immobilisering av molekyler under studien på en yta (glasskiva eller mikrosfärer).
Kombinationen av två enkla molekyler tekniker kräver vinna flera tekniska svårigheter, främst till följd av kraven på mekanisk stabilitet och tillräcklig SNR (speciellt när det krävs lokalisering med nm precision) 15. Speciellt vid koppling SM fluorescensdetektion med optisk pincett, minskning av buller och fotoblekning från fångstinfraröda lasrar 16 och kontroll av biokemiska buffertar för montering av de biologiska komplex och prestanda för experimentella mätningar 11 är av största vikt. Här beskriver vi de metoder för framgångsriktmätningar i en dubbel fångst / SM Fluorescens lokaliseringsinställningar. Metodiken illustreras med exempel på laktosrepressorproteinet (LacI) fluorescerande (med Atto532) och detekteras som den binder till en DNA-molekyl (fångade mellan två optisk pincett) innehåller specifika Laci bindande sekvenser (dvs operatörer). Vi visar effektiviteten av metoden i detektering av bindning av Lacl till DNA och diffusion utmed sin kontur i mål-sökningsprocessen. Metoden kan tillämpas på alla kombinationer av DNA-sekvensen och DNA-bindande protein, liksom till andra system (mikrotubuli eller aktinfilament och motorproteiner som interagerar med dem).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 optisk pincett Setup med Nanometer Stabilitet
Den experimentuppställning måste ge två optisk pincett med pekande stabilitet på nanometernivå och intensitet fluktuationer i fångst laser under 1%. Kombination av dessa villkor kommer att försäkra nanometer stabiliteten i hantel i typiska spänning (1 pN - några tiotal PN), fälla styvhet (0,1 pN / nm) och mätbandbredd (bild förvärv hastighet 20 sek -1). Ett system av experimentuppställningen visas i fig 1.
- Optisk pincett design och konstruktion 15,17:
- Montera den experimentella apparaten på en optisk bord med aktiva isolatorer för att minska mekaniska vibrationer. Montera mikroskopstrukturen på elastomer isolatorer att absorbera akustiskt brus och mekaniska resonanser i mikroskop strukturen.
- Sätt i en optisk isolator i banan för det fångande lasern, nära laserkälla, med reduce slump amplitud fluktuationer på grund av optisk återkoppling.
- Minska väglängd av fångst lasern så mycket som möjligt och bifoga hela sökvägen i en sluten låda för att minska laser pekande fluktuationer på grund av luftströmmar och turbulens.
- Skapa dubbel optisk pincett genom att dela en enda nära infraröd laserkälla (Nd: YAG-laser, 1064 nm våglängd) i två strålar med ortogonala polariseringar. Använd inte tidsdelade fällor eftersom de orsakar svängning av hantel under spänning 12.
- Använd akustooptiska avvisare (AODs) drivs av Direct Digital Synthesizer (DDSS) att låta fina rörelser (minst) en fälla och exakt reglering av DNA spänning. DDSS möjliggöra en bättre fälla stabilitet än spänningsstyrda oscillatorer (VCO).
- Sätt i två kvadrantdetektorn fotodioder (QDPs) i ryggen fokalplan kondensorn för att detektera läget för de fångade pärlor med sub-nm noggrannhet.
- Kontrollera att intensiteten fluctuations av fångst laser vid mikroskopet ingången är under 1% med hjälp av en fotodiod med en bandbredd större än andelen bilden förvärvet.
- Kontrollera pekar stabiliteten hos de två fångst lasrar:
- Förbered kiseldioxidpärlor i fosfatbuffert: Späd 20 | il av kiselpärlor (1,54 | im, 10% fasta ämnen) i en ml aceton, sonikera 30 sekund, skaka snabbt och centrifugera 2 minuter vid 19.000 x g. Resuspendera i 1 ml aceton och upprepad tvätt. Resuspendera i 1 ml 50 mM fosfatbuffert, tvätta 2 gånger, och slutligen resuspendera i 100 pl 50 mM fosfatbuffert.
- Kalibrera optisk pincett med kiseldioxidpärlor: utarbeta en flödescell genom att fästa en täck till ett objektglas med dubbelhäftande tejp (cirka 60 pm tjock). Flöde 1 mg / ml BSA och vänta 3 minuter. Flödes kiseldioxidpärlor utspätt 1/1000 i fosfatbuffert och försegla flödeskammare med silikonfett. Trap en pärla i varje fälla och kalibrera fällor med hjälp av kraftspektrum metoden 18. Förbered kiseldioxidpärlor i pentylacetat och nitrocellulosa: Späd 20 | il av kiselpärlor (1,54 | im, 10% fasta ämnen) i en ml aceton, sonikera 30 sekund, skaka snabbt och centrifugera 2 minuter vid 19.000 x g. Resuspendera i 1 ml aceton och upprepad tvätt. Resuspendera i 1 ml pentylacetat och tvätta två gånger. Slutligen resuspendera dem i pentylacetat med 0,1% nitrocellulosa upplöst i pentylacetat.
- Sprid 2 ul av 1,54 ^ m diameter kiseldioxidpärlor upplösta i pentylacetat + 0,1% nitrocellulosa på ytan av ett täckglas (24 x 24 mm) med användning av ett andra täckglas (24 x 60 mm). Fäst täckglas till ett mikroskopobjektglas med användning av två stycken av dubbelhäftande tejp för att skapa en flödescell. Fyll den flödescell med 50 mM fosfatbuffert och försegla den med silikonfett.
- Bild ett kvarts pärla i bright mikroskopi på 2,000X förstoring. Synfältet skall vara 7 x 5 pm förvärvades 768 x 576 bildpunkter, så att pärlan bilden har en diameter på 190 pixels. Kompensera termiska drivor med återkoppling program som, som i ref. 17, beräknar xy position från bildtyngd och z från diffraktion ringar och korrigerar drivor flyttar en piezo skede med nm-precision eller bättre.
- Lappa centrum i vänstra fälla med pärlan centret (XY signalnivåerna från QDP måste vara samma som uppmätts under kalibreringen) och mäta positionen buller och dess standardavvikelse från QDP. Upprepa mätningen för rätt fällan.
2. enda molekyl Lokalisering med nanometerprecision
- Fluorescensmikroskopi design och konstruktion 15,19
- Använd en hög kvanteffektivitet och elektron multiplicerat CCD för att nå de höga signal-till-brusförhållanden som är nödvändiga för nanometerlokaliseringsnoggrannhet.
- Välj optik för att få en bild pixelstorlek ~ 80 nm (till exempel en bildförstoring ~ 200X med en kamera pixelstorlek på 16 mikrometer). Detta är i tillräckligräckligt liten för att försumma lokalisering fel på grund av pixelation 8, men som är tillräckligt stor för att samla ett stort antal fotoner per pixel.
- Eftersom exciteringskälla, använder laserljus som är opolariserad (genom att passera genom en icke-polarisationsbevarande optisk fiber) eller cirkulärt polariserade (genom att passera genom en λ / 4 retardationsskiva) för att maximera excitation av enkel kromoforer, oavsett deras orientering.
- Välj emissionsbandpassfilter som effektivt cut-off både excitation och fångstlaserljus. Obs: I våra experiment märkt vi vårt protein med Atto532 färgämne och använde ett filter bandpassemissions centrerat vid 600 nm med 100 nm bandbredd.
3. Microfluidics
För att uppnå en exakt kontroll över buffertbyte och "hantel" montering, det vill säga, förankringen av en DNA-molekyl mellan två optiskt fångade mikrosfärer, en specialbyggd laminärt flerkanalig flödeSystemet måste utvecklas. Detta består av en flödeskammare, en tryckreservoar och en tryckregleringssystem (figur 2).
- Beredning Flödescell
OBS: flödeskammare används för enda molekyl experiment på protein-DNA-interaktion har företrädesvis fyra inlopp och 1 utlopp, för att låta upp till fyra parallella buffertflöden, var och en innehållande en av de olika komponenter som krävs för experimentet: pärlor, DNA, fluorescensmärkt protein och bildåtergivningsbuffert. Separation av komponenterna i flödeskanalerna medger effektiv montering av hantel. Dessutom är avbildningskanalen användbar för att undvika bakgrundsfluorescens från diffunderande proteiner och uppnå det höga signal-till-brusförhållande som erfordras för lokalisering av DNA-bindande protein med en precision av storleksordningen några nanometer.- Hål Borra 1 mm diameter i objektglas (76 x 76 x 1 mm) med en diamantspets, för att skapa fyra inlopp och ett utlopp.
- Ren the objektglas med etanol och centrera porten med O-ringen insatt och klisterring i bilden kring åtkomsthålen. Det är grundläggande att bära handskar under detta steg för att undvika fingeravtryck, vilket skulle störa limningsprocessen.
- Kläm de NanoPorts till bilden, och placera den i ugnen förvärmd vid 180 ° C i 1 timme för att möjliggöra fullständig fastsättning.
- Rita konturerna mönster av flödescellen på en bit papper. Kanalerna ska vara ~ 3 mm bred och matcha hålen position på objektglas.
- Placera ritningen ovanpå två bitar av Parafilm och med en skalpell göra skarpa och kontinuerliga nedskärningar längs den ritade konturen. Ta bort eventuella utbuktning bildas. Kasta det lägre Parafilm lagret, som just används för att garantera en ren support.
- Placera objektglas innehållande de bifogade NanoPorts uppochned i metallstöd.
- Försiktigt anpassa Parafilm kammar kontur med hålen och se thpå parafilm inte obtrude inloppen och utloppet av kammaren.
- Täck med en rengjord mikroskop täckglas (62 x 56 x 0,15 mm) och ta försiktigt bort överflödigt Parafilm omger kammaren.
- Placera två värmeblock, som i förväg upphettats till 120 ° C, på toppen av flödescellen att tillämpa konstant tryck på den. Låt Parafilm smälta för ca 25 min.
- Tryck reservoar och buffertbehållare
Reservoartrycket ska vara av plexiglas (eller liknande) och låt boende av sex buffertbehållare. Möjligheten att ha åtminstone två extra buffertbehållare förbättrar flexibilitet. Observera att det finns klara behållare och rör kraftigt bidra flödessystemet hantering och felsökning av luftbubblor. Sterilt och disponibel luer lock-tip sprutor (2,5 ml), från vilken kolvarna tidigare har avlägsnats, är goda buffertbehållare och möjliggöra en enkel anslutning med inloppsslangen. Säkerställ attden totala vätskevolymen är liten jämfört med luftvolymen inuti reservoartrycket, ett tillstånd nödvändigt för att erhålla jämn och stabilt flöde.- Anslut avstängningsventiler vid utloppet av buffertbehållare för att vrida buffertflödet på eller av under experimenten.
- Montera flödescell på mikroskop scenen. Anslut avstängningsventilerna till de flödeskammar vikar med polyetereterketon slang (innerdiameter ~ 150 nm) och flänslösa beslag. Lägg ~ 3 cm av fluorerad etylenpropylen-slang (innerdiameter ~ 500 ^ m) som en koppling mellan slangen och de NanoPort sammansättningar av flödescellen. Detta steg är nödvändigt för att reducera buffertflöde vid kammarens ingång för att undvika brott av cellflödet eller NanoPort lossnar från glaset. Användningen av stora slanginnerdiameter ensam, å andra sidan, skulle kräva stora volymer av biologiska prover.
- Anslut flödeskammarutloppet till en öppen Falcon-rör vid atmosfärstryck. Dettaröret fungerar som avyttring för bufferten som strömmar ut ur flödet kammaren.
- Tryck styrsystem
- Bygg en tryckregleringssystem med förmåga att fint reglera lufttrycket inuti reservoartrycket. Detta kan göras genom användning av två datorstyrda magnetventiler, en förbunden med en 0,5 atm tryckkälla (kompressor) och den andra en till atmosfärstryck. Magnetventiler upprepade gånger öppnas för cirka 7 msek för att öka eller minska trycket i ledningen tills önskat värde uppnås. OBS: detta tillvägagångssätt anpassades från Carlos Bustamante 20, och det ger en jämnare flöde än att använda en stegmotor sprutpump 21.
- Lägg till en tryckomvandlare som styrs av en beställnings-skriven mjukvara för att övervaka det effektiva tryck som utövas på reservoartrycket. Typiska arbetstryck är i storleksordningen 20 mBar för hantel montering och 200 mBar för att tvätta flödessystemets komponenter.
4 DNA Tailing med Biotinylated deoxicytidintrifosfat (biotin-dCTP)
DNA-molekylen ska vara längre än 1 pm för att underlätta dess förlängning enligt flöde och förankring till de instängda pärlorna. Dessutom kommer ett långt DNA förhindra IR infångnings ljus från belysning av DNA-bindande protein. Detta är av särskild betydelse, eftersom absorption av IR-ljus från en exciterad kromofora resulterar i ökad fotoblekning. OBS: I den aktuella studien, DNA-molekylen var 3,7 um lång. Molekylen innehöll tre exemplar av den primära operatören O1 och ett exemplar av var och en av de två hjälp operatörerna, O2 och O3. Dessa sekvenser har satts in i mitten av molekylen, vilket leder ungefär lika långt från de fångade pärlor och IR-laserstrålar.
- Blanda 1 pmol av linjära DNA 3'-ändar med 60 pmol biotin-14-dCTP, 4 pl 5x Terminal deoxinukleotidyltransferas (TdT) buffert (1 M kalium cacodylate, 125 mM Tris, 0,05% (volym / volym) Triton X-100, 5 mM CoCl2 (pH 7,2 vid 25 ° C)) och 1,5 ^ il TdT och DDH 2 O till en total volym av 20 | il. Inkubera blandningen vid 37 ° C under 15 min. Detta kommer att resultera i tillägg av upp till 60 nukleotider per DNA extremitet. Observera att DNA 3'-överhäng tailed med högre verkningsgrad än försänkta eller trubbiga ändar.
- Rena tailed DNA med spinnkolonner eller fenol / kloroform extraktion och efterföljande etanolprecipitation att ta bort CoCl2 från reaktionsbuffert TdT.
- Efter rening kan DNA förvaras vid 4 ° C under flera veckor eller vid -20 ° C under längre perioder, men undvik upprepad upptining och omfrysning.
5. Märkning Protein tiolgrupperna med ATTO532
Märkning genom ändring av cysteinrester får inte förändra proteinets aktivitet. För att lösa detta problem, använde vi en Lacl mutant, LacIQ231C, which bär bara en cystein per monomer vid position 231. Denna mutant bevarar samma egenskaper hos vildtypen och kemiska modifieringar vid position 231 har visat sig inte störa proteinstabilitet 22. OBS: Vi märkt proteinet med ATTO532 maleimid.
- Säkerställ att proteinet löses i en buffert med ett pH i intervallet från 7,0 till 7,5 och med en koncentration som sträcker sig från 2 till 10 mg / ml. OBS: I dessa experiment LacI löst i kaliumfosfat 0,3 M, 5% glukos, pH 7,5 (buffert A).
- Lös Tris (2-karboxietyl) fosfin hydroklorid (TCEP) till en slutlig koncentration av 100 mg / ml i H2O TCEP lösning måste beredas på nytt före användning.
- Blanda 100 pl av proteinet med 3 pl TCEP och skaka försiktigt.
- Lös färgämnet i N, N-dimetylformamid (DMF) till en slutlig koncentration av 10 mg / ml som arbetar vid svagt ljus. Vortex tills allt löst sig.
- Reaktions mix: Lägg 33 l av färgämne till protein + TCEP och skaka försiktigt. Snabb spinn för att samla in så mycket lösning som möjligt.
- Inkubera reaktionsblandningen under 2 timmar i en shaker (8000 rpm) vid 20 ° C (eller vid 4 ° CO / N), skyddad mot ljus.
- Lös L-Glutation reducerad (GSH) till en slutlig koncentration av 100 mg / ml i H2O Lägg 3 pl till reaktionsblandningen och inkubera på skak vid 8000 rpm under 15 min. GSH kommer att stoppa reaktionen genom att blockera reaktiviteten hos tiolgrupper.
- Rena märkta proteinet med hjälp av standard gelfiltreringskolonner, dialys eller spinn koncentratorer. OBS: I dessa experiment märktes LacI renas med hjälp av 10 kDa cutoff spin koncentratorer.
- Späd reaktionsblandningen med upp till 12 ml buffert A, applicera den till anrikningsanordning, och centrifugera den vid 8000 xg, 1 h, 4 ° C. Den märkta Lacl således koncentreras till en slutlig volym av ca 500 ul och överskottet av färgämnet passerar membranet i flow-genom. Kassera genomströmning och upprepa steg 5.8.1 minst tre gånger.
- Dela upp det märkta proteinet i små portioner och förvara vid -80 ° C. Undvik upprepad frysning och upptining.
6 Kombinerad optisk Trapping och enda molekyl fluorescens avbildning Experiment
- Tillsätt 1 ml buffert A till buffertbehållare och tillämpa 200 mbar tryck för att tvätta anslutningsrören och flödescell. För att maximera diffusionen av det bindande proteinet på DNA, här och i de följande stegen, buffert A kan ersättas med en buffert med låg jonstyrka. OBS: I dessa försök använde vi TBE 0.5x.
- Kontrollera med avseende på närvaron av luftbubblor, som skulle kunna störa flödet jämnhet. En mild flick på utloppsröret hjälper till att undanröja eventuella återstående bubblor.
- Minska trycket till 20 mbar och kontrollera att alla kanaler och rör är tydligt av luftbubblor och bufferten flöden med liknande hastigheter i alla kanaler.
- Förbered proverna till en slutlig volym av 300 | il: streptavidinbelagda polystyrenpärlor 1,87 ^ m; 20 pM av linjärt DNA, biotinylerad på båda extremiteterna enligt punkt 4; 300 pM av Lacl tetramer märkt med ATTO532 enlighet med punkt 5.
- Lägg varje prov till en av sprutans behållare i följande ordning: pärlor i den första kanalen, DNA i andra, tredje kanal med bildbufferten enbart (buffert A + syrefångare systemet) och det märkta proteinet i den fjärde kanalen.
- Vrid flödes på vid 200 mBar under 3 min för att låta proverna anländer inuti flödeskanalen. Då minskar trycket till 20 mbar.
- Medan avbildning den första kanalen i ljusa fält belysning, slå på de två optiska pincetten och fånga en polystyrenpärla i varje fälla.
- Flytta snabbt till den andra kanalen för att undvika att andra pärlor falla i fällorna. Observera att ankomst i DNA-kanalen är lätt märkbar vid utgången av vulsten flödet.
- Använda one AOD, flytta en fälla (kula) och tillbaka i närheten av den andra pärla för att göra det möjligt för fastsättning av flödes utökad DNA i mellan de två optiskt fångade pärlor. När en DNA-hantel bildas, startar den statiska vulsten följande rörelsen av vulst som aktivt förflyttas fram och tillbaka genom fällan.
- Flytta snabbt till buffertkanalen och stäng av buffertflödet. Utför en kraft-förlängningskurva analys 4,23-25 för att verifiera närvaron av en enda DNA-molekyl. Om mer än en molekyl är närvarande (dvs enthalpic, höja fasen av kraft-förlängningskurvan sker vid en längd kortare än DNA konturen längd), kassera hantel och börja om från steg 6.7.
- När en enda DNA hantel erhålls, slå på strömmen igen och flytta hantel till proteinkanalen. Växla till bredfälts fluorescensmikroskopi för att övervaka växelverkan mellan den märkta-Lacl med DNA. Stäng av strömmen och starta förvärvet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I ett lyckat experiment, genomgår en (eller flera) märkta proteiner bindande / ej bindande och / eller monodimensional diffusion längs DNA-molekylen (Figur 3A). Lokalisering av proteiner längs DNA-molekylen möjliggör kvantifiering av kinetiska parametrar som en funktion av DNA-sekvensen. När buffertförhållanden orsakar 1D diffusion tillämpas, är det möjligt att följa protein banor, och bestämmer till exempel diffusionskoefficienten D 1D.
Den exakta positionen för en enda fläck, i varje ram, kan bestämmas genom att montera Point Spread Function (PSF) med en tvådimensionell Gaussfunktion eller alternativt vid hantering av en stor datamängd, med en snabbare, nyligen publicerad algoritm (Radial Symmetri Center, RSC) 26,27. Den senare metoden bestämmer den punkt maximal radiell symmetri i bilden, uppnå en lokalisering precision som är typiskt jämförbar med Gauss montering. I both fall kan spårning uppnås genom MATLAB rutiner som kan nås fritt 27.
Figur 3A visar en kymogram av ett typiskt experiment där en enda Lacl molekyl diffunderar längs icke-specifika DNA-sekvenser medan en annan Lacl molekylen är specifikt bundet till en operatör, som ligger i centrum av DNA-molekylen. Figur 3B visar läget för de två LACI-molekyler (erhållen med användning av RSC) längs riktningen som förbinder centra hos de två fällor (x), som en funktion av tiden. Från positionen av molekylen diffunderar längs DNA-molekylen, vi beräknat Mean Square Displacement (MSD) vid olika tidsintervall enligt följande ekvation:
(1)
där N är det totala antalet positioner mäts och n är måttet index går f rom 1 till N. Vid ren endimensionell Brownsk diffusion, är MSD direkt proportionell mot n At (At är tidsintervallet mellan två på varandra följande ramar, 100 ms i våra experiment), med en lutning som är dubbelt diffusionskoefficienten (MSD (n, N) = 2D 1 nAt). Figur 4 visar MSD vs nAt tomt för molekylen diffunderar längs DNA. Diffusionskoefficienten för proteinet kan lätt erhållas från en linjär anpassning av MSD vs nAt tomt. Observera att när n ökar, antalet poäng för beräkning MSD från Eq. 1 minskar följaktligen. Felet i utvärderingen av MSD ökar således med n. Av denna anledning valde vi att begränsa vår analys till n = N / 4. Detta är ändå en ganska stora värde jämfört med N / 10 används av många laboratorier.
tp_upload / 51446 / 51446fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1 Den experimentuppställning består av: halogenlampa (H), kondensor (C), prov (S), piezo översättare (xy och z), mål (O), en låg förstoringskamera (CCD 200X) och en hög -magnification kamera (CCD 2,000X) används för nm-stabiliserings återkoppling (BS är en 50:50 stråldelare kub). Dubbla optisk pincett infogas och extraheras från den optiska axeln för mikroskopet genom dikroiska speglar (D2 och D3) och innefatta: Nd: YAG-laser (1064 nm), optisk isolator (OI), λ / 2 waveplates, polarisationsstrålsplittraren kuber (PBS), akustooptiska deflektorer (AOD), 1064 nm interferensfilter (F1 och F2), kvadrantdetektorn fotodioder (QDP). Signaler från QDPs förvärvades via en analog-till-digital-omvandlare (ADC) och utarbetade med en FPGA styrelse. Två specialbyggda direkta digitala syntar (DDS) körde AODs att kontrollera fällor ställning. En digital ingång-utgångskort (DIO) kontrolleradeöppning av två magnetventiler (V1 och V2) som är anslutna till en kompressor (0,5 atm) och omgivningstryck (0 atm), respektive. En Labview programvara övervakas trycket i tryckbehållaren (C1) via en tryckmätare (PM) och automatiskt öppnade en av de två ventilerna för att nå den önskade trycknivån. Fluorescensexcitation tillhandahölls av en dupliceras Nd: YAG-laser (532 nm) och bilden projiceras på en elektron multipliceras kamera (EMCCD). M är en rörlig spegel, F3 ett emissionsfilter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 (A) Flödessystemdiagram. Det tryck kontrollsystemet består av en tryckmätare (PM) och två magnetventiler V1 och V2 anslutered till en kompressor på 0,5 atm (PRS) och omgivningstryck (ATM), respektive. X1 och X2 representerar 3-vägs kontakter. Öppningen av ventilerna är finjusteras för att nå det önskade trycket i tryckreservoaren C1 med 4 buffertbehållare. Varje inloppsröret innefattar en oberoende på / av-ventil vid ingången av det flerkanaliga strömningskammare. Utloppet slangen är ansluten till avfallsbehållaren C2 placeras vid omgivningstryck. Ritningarna är inte skalenliga. (B) Schematisk representation av den flerkanaliga strömningskammare. Fyra laminära flöden separat translocate funktion polystyrenkulor, DNA-molekyler, bildbuffert och märkta proteiner. Två kulor fångas med dubbla optisk pincett och flyttade till DNA-kanalen för att möjliggöra DNA förankring mellan dem. En DNA-kraft-förlängningsanalys utförs i buffertkanalen för att kontrollera närvaron av en enda DNA-molekyl och, bara efteråt sätts DNA inkuberades i proteinkanal. Den infällda bilden visar en magnifiering av slut molekylära konstruktionen, redo för enda molekyl avbildning i buffertkanalen. Ritningar är inte skalenliga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 Lokalisering av enkel LACI molekyler som interagerar med ett sträckt DNA-molekyl. (A) Den vertikala axeln i kymogram representerar x-koordinaten, parallellt med DNA-molekylen, medan den horisontella axeln är tiden (100 msek uppsugningstid). (B ) X-position för Lacl molekylen vs tid. Positionen för de molekyler bestämdes genom RSC. Bilder förvärvades till 100 ms exponeringstid och 1,25 x 10 -2 W cm -2 EXCIförandet laserintensitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 Plot av MSD vs tid för en enda Lacl molekyl som diffunderar längs ett sträckt DNA-molekyl. MSD beräknas från positionen register representeras i figur 3B (rött). Diffusionskoefficienten D 1D, erhållen från linjär regression av data som visas i figuren, är 0,030 ± 0,002 um 2 sek -1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under det senaste decenniet har enstaka molekyl manipulation och avbildningstekniker sett stora framsteg i fråga om tidsmässiga och geografiska. Kombinationen av manipulation och avbildningstekniker är vid basen av kraftfulla instrument som nu går att kontrollera de mekaniska betingelserna för en enda biologisk polymer, såsom DNA, RNA eller cytoskelettala filament, och den samtidiga lokalisering av enstaka proteiner som interagerar med samma polymer . Styrning av de mekaniska förhållandena i instängd polymeren är av särskilt intresse. I själva verket, i levande celler, nukleinsyror kontinuerligt undergår mekanisk påkänning orsakad genom interaktion enzymer och proteiner; på liknande sätt, modulerar ett komplext nätverk av samverkande proteiner och molekylära motorer spänning på cytoskelettala filament. Å andra sidan, möjligheten att detektera och exakt lokalisera proteiner som växelverkar med nukleinsyror, medger mätning av molekylära interaktioner som en funktion av deras posättningen längs DNA eller RNA-sekvens.
Kombinera enda molekyl manipulation och avbildningstekniker kräver noggrann utformning av experimentuppställning och de biologiska konstruktioner. Optiska fällor måste ge ett stabilt stöd, säkerställa nm-nivå stabiliteten i suspenderade polymeren. En sådan stabilitet kan nås genom noggrann isolering av den experimentella apparaten från de många källor för mekaniskt buller och genom att minimera laser pekar och amplitud svängningar. Exakta (sub-nm) rörelser optiska fällor uppnås med hjälp AODs drivs av DDSS. Här illustreras vi en steg-för-steg-protokoll för att optimera och kontrollera optisk pincett "stabilitet på nm-nivå.
Enkel brett fält epi-fluorescensmikroskop kopplad till en EMCCD kamera används för att lokalisera enskilda kromoforer som interagerar med den suspenderade polymeren. Vår experimentella analysen är begränsad till långa DNA eller RNA-molekyler (≥6 kbp) för att säkerställa en rumslig separation satsninglan infångningslaserstrålen och den fluorescerande sonden. I själva verket skulle överlagring av det nära infraröda svällning laser med synlig excitation laser leda till förbättrad fotoblekning av de kromoforer grund av absorption av nära-infrarött ljus medan kromoforen är i exciterat tillstånd 16. Hantel församling är en annan knepig procedur som är bättre erhålls med hjälp av en flerkanalig flödescell, som vi gav en detaljerad beskrivning. Vi visade hur man kan optimera buffertflödet och hur man undviker luftbubblor, som annars kan allvarligt äventyra experimenten. Vi beskrev protokoll för märkning av DNA extremiteter med biotin, vilket krävs för hantel montering med streptavidinbelagda pärlor och protokoll för proteinmärkning. Slutligen illustreras vi steg-för-steg-operationer för att utföra experiment där bindningen och spridningen av en enda laktosrepressom molekyl på en sträckt DNA-molekyl kvantifieras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Gijs wuite, Erwin JG Peterman, och Peter Gross för hjälp med mikrofluidik och Alessia Tempestini för hjälp med provberedning. Denna forskning har finansierats av Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7 / 2007-2013) enligt bidragsavtal n ° 284.464 och från det italienska ministeriet för utbildning, universitet och forskning FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro i Ricerca 2013 RBFR13V4M2, och inom ramen för Flagship Project Nanomax.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies |
| Optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | |
| Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | |
| Acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | ||
| Quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | |
| Electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | |
| Silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | |
| Pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapor (No 1272/2008) |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) |
| Heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120 °C |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | |
| Polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | |
| Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | |||
| Luer lock-tip syringes 2.5 ml | Terumo | SS 02LZ1 | |
| Shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | |
| Flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | |
| Fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | |
| Two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | |
| Pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | |
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | |
| Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 |
References
- Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
- Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
- Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
- Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
- Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
- van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).
- Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
- Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
- Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
- Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
- van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
- Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
- Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).
