Summary
Her beskriver vi instrumentering og fremgangsmåter for påvisning av enkelt fluorescensmerket-merkede proteinmolekylene vekselvirker med et enkelt DNA-molekyl opphengt mellom to optisk fangede mikrosfærer.
Introduction
Enkelt molekyl (SM) teknikker har i stor grad utviklet seg over de siste tretti årene til å svare på behovet for å overvinne noen av de tradisjonelle begrensningene, bulk løsningsmålinger 1-3. Manipulering av enkelt biologiske molekyler har skapt muligheten for å måle mekaniske egenskaper av biopolymerer 4 og styre de mekaniske parametre for protein-protein 5 og protein-DNA-interaksjoner 6,7. SM fluorescensdeteksjon, på den annen side, representerer en meget allsidig verktøy for å studere protein-aktivitet in vitro og in vivo, noe som fører til muligheten for å lokalisere og spore enkle molekyler med nanometerpresisjon. Ved montering av instrumentet punkt-spredning-funksjon til SM-bilde, i Faktisk kan man oppnå lokalisering med en nøyaktighet avhengig hovedsakelig av signal-til-støy-forhold (SNR) og nådde en grense på omtrent en 8,9 nanometer. Disse metoder finne kraftiganvendelser innen studiet av dynamikken i motorproteiner, så vel som av de diffusjonsprosesser liggende søk target i DNA-bindende proteiner. Evnen til å bestemme diffusjon konstanter som en funksjon av DNA-sekvensen, oppholdstid på målet og nøyaktig måling av DNA-lengde undersøkt i løpet av en-dimensjonale diffusjon hendelser, representerer et kraftig verktøy for studium av protein-DNA interaksjon dynamikk og for undersøkelsen av mekanismene for bestemt mål søk.
Nylig har en kombinasjon av disse to teknikkene ga en ny generasjon av forsøksoppsett 10 til 14 slik at den samtidige bruk av et biologisk substrat (for eksempel et aktin filament eller et DNA-molekyl), og deteksjon / lokalisering av et samspill partner enzym (f.eks myosin eller et DNA-bindende protein). Fordelene med disse teknikkene hovedsakelig hvile på muligheten for å utøve mekanisk kontroll over fanget polymer, således enabling studiet av interaksjons dynamikk versus styrker eller momentene. Dessuten lar den metodikk måling av biokjemiske reaksjoner langt fra overflaten, å unngå en av de viktigste begrensninger av klassiske SM metoder, dvs. behovet for immobilisering av molekyler som ble studert på et underlag (glass-slide eller mikrokuler).
Kombinasjonen av to enkle molekyler teknikker krever overvinne flere tekniske vanskeligheter, først og fremst som følge av kravene til mekanisk stabilitet og tilstrekkelig SNR (spesielt når krever lokalisering med presisjon nm) 15. Spesielt når du kombinerer SM fluorescensdeteksjon med optiske pinsetter, reduksjon av støy og fotobleking fra fangst infrarøde lasere 16 og kontroll av biokjemiske buffere for montering av de biologiske komplekser og ytelsen til de eksperimentelle målingene 11 er av avgjørende betydning. Her beskriver vi metoder for å utføre vellykkedemålinger i en dobbel fangst / SM Fluorescence lokalisering oppsett. Metodikken er illustrert med eksempel på laktose repressor protein (Laci) fluorescensmerkede (med Atto532) og oppdaget da det binder seg til et DNA-molekyl (fanget mellom to optiske pinsett) inneholder spesifikke Laci bindende sekvenser (dvs. operatører). Vi viser effektiviteten av fremgangsmåten for å påvise binding av laci til DNA og diffusjon langs sin kontur i målet søkeprosessen. Fremgangsmåten er anvendbar til en hvilken som helst kombinasjon av DNA-sekvensen og DNA-bindende proteiner, så vel som til andre systemer (mikrotubuli eller actin filamenter, og motoren proteiner som vekselvirker med dem).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optisk pinsett oppsett med Nanometer Stabilitet
Den eksperimentelle oppsettet må gi to optiske pinsetter med å peke stabilitet på nanonivå og intensitet svingninger i fangst laser under 1%. Kombinasjonen av disse forholdene vil forsikre nanometer stabilitet av dumbbell under typiske spenning (1 pn - noen titalls pn), felle stivhet (0,1 PN / nm) og målebåndbredde (image oppkjøpet sats 20 sek -1). En ordning av det eksperimentelle oppsettet er vist på figur 1.
- Optisk pinsett design og konstruksjon 15,17:
- Monter eksperimentelle apparater på et optisk bord med aktive isolatorer til å redusere mekaniske vibrasjoner. Monter mikroskop struktur på elastiske isolatorer for å absorbere akustisk støy og mekaniske resonanser av mikroskopet struktur.
- Sett en optisk isolator i banen til laser-trapping, i nærheten av laserkilden, for å reduce tilfeldige amplitudesvingninger grunn optisk tilbakemeldinger.
- Reduser lengden av banen for overtrykk laser så mye som mulig, og omslutter hele banen i en forseglet boks for å redusere laserpeke svingninger på grunn av luftstrømmer og turbulens.
- Lag dobbel optisk pinsett ved å dele en enkelt nær-infrarød laser kilde (Nd: YAG laser, 1064 nm bølgelengde) i to bjelker med ortogonale polarizations. Ikke bruk tid delt feller fordi de forårsake svingninger på dumbbell under spenning 12.
- Bruk akustooptiske deflektorer (AODs) drevet av direkte digital synthesizere (DDSS) for å tillate gode bevegelser av (minst) en felle og presis regulering av DNA spenning. DDSS tillate en bedre felle stabilitet enn spenningsstyrt oscillatorer (VCOs).
- Sett to detektorkvadrant-fotodioder (QDPs) i baksiden fokalplanet av kondensatoren for å detektere posisjonen til de fangede perler med sub-nm nøyaktighet.
- Sjekk at intensiteten fluctuations av overlappings laser på mikroskopet inngang er under 1% ved hjelp av en fotodiode med en båndbredde som er større enn frekvensen av bildeopptak.
- Sjekk peker stabilitet av de to fangst lasere:
- Forbered silikaperler i fosfatbuffer: Fortynn 20 pl av silikaperler (1,54 um, 10% faste stoffer) i 1 ml aceton, sonicate 30 sek, vortex kort, og sentrifuge i 2 min ved 19 000 x g. Resuspender i 1 ml aceton og gjenta vask. Resuspender i 1 ml av 50 mM fosfatbuffer, vaskes to ganger, og til slutt resuspender i 100 pl av 50 mM fosfatbuffer.
- Kalibrere optiske pinsett med silika perler: utarbeide en flyt celle ved å feste en dekkglass til et objektglass med dobbeltsidig tape (ca 60 mikrometer tykk). Strømnings 1 mg / ml BSA og vente 3 min. Strømningssilikaperler fortynnet 1/1000 i fosfatbuffer og forsegle strømningskammeret med silikonfett. Felle en perle i hver felle og kalibrere feller med effektspekteret metode 18. Forbered silikaperler i pentyl-acetat og nitrocellulose: Fortynn 20 pl av silikaperler (1,54 um, 10% faste stoffer) i 1 ml aceton, sonicate 30 sek, vortex kort, og sentrifuge i 2 min ved 19 000 x g. Resuspender i 1 ml aceton og gjenta vask. Resuspender i 1 ml av pentyl-acetat og vaskes med 2 ganger. Endelig resuspendere dem i pentyl acetat med 0,1% nitrocellulose oppløst i pentyl acetat.
- Spre 2 pl av 1,54 mikrometer diameter silikaperler oppløst i pentyl acetat + 0,1% nitrocellulose på overflaten av et dekkglass (24 x 24 mm) ved hjelp av en andre dekkglass (24 x 60 mm). Fest dekkglass til et objektglass ved hjelp av to stykker av dobbeltsidig tape for å lage en strømningscelle. Fyll flow-celle med 50 mM fosfatbuffer, og forsegle den med silikonfett.
- Bildet ett silika perle i lysfelt mikroskopi ved 2,000X forstørrelse. Synsfeltet bør være 7 x 5 xm ervervet på 768 x 576 piksler, slik at vulsten bildet har en diameter på 190 psuper-bildeelementer. Kompensere termiske driver med tilbakemeldinger programvare som, som i ref. 17, beregner xy posisjon fra bildet Tyngdepunktet og z fra diffraksjon ringer og korrigerer fonner bevegelige en piezo scenen med nm-nøyaktighet eller bedre.
- Overlapping midten av venstre felle med vulsten senteret (xy signalnivåene fra den QDP må være den samme målt under kalibrering) og måle posisjonen støy og dens standardavvik fra den QDP. Gjenta målingen for retten felle.
2. enkelt molekyl lokalisering med Nanometer Nøyaktighet
- Fluorescens mikros design og konstruksjon 15,19
- Bruk høy kvantumutbytte og elektron-multiplisert CCD å nå de høye signal-til-støy-forhold som er nødvendige for nanometer lokaliseringsnøyaktighet.
- Velg optikk for å få et bilde pikselstørrelse ~ 80 nm (for eksempel en bildeforstørrelse ~ 200X med et kamera pikselstørrelse på 16 mikrometer). Dette er tilstrekkestrekkelig lite å forsømme lokalisering feilen skyldes piksele 8, men stor nok til å samle inn et betydelig antall fotoner pr piksel.
- Som eksitasjon kilde, bruker laserlys som er upolarisert (ved å passere gjennom en ikke-polarise-å opprettholde optisk fiber) eller sirkulært polarisert (ved å passere gjennom en λ / 4 waveplate) for å maksimere eksitasjon av enkelt kromoforer, uansett deres orientering.
- Velg utslipp båndpassfiltre som effektivt cut-off både eksitasjon og fangst laser lys. Merk: I våre eksperimenter merket vi vår protein med Atto532 fargestoff og brukte en båndpass utslipp filter sentrert ved 600 nm med 100 nm båndbredde.
3. Microfluidics
For å oppnå en presis kontroll av buffer utveksling og "dumbbell 'montering, dvs. forankringen av en enkelt DNA molekyl mellom to optisk fanget sfærer, en spesialbygd Laminar flerkanals flytsystem må utvikles. Dette er sammensatt av en strømnings-kammeret, et trykk-reservoar og et trykkreguleringssystem (figur 2).
- Flow celleforberedelsen
MERK: Strømningskammeret anvendes for enkelt-molekyl eksperimenter på protein-DNA interaksjon har fortrinnsvis fire innløp og ett utløp, slik at opp til fire parallelle kantstrømmer, hver og en inneholdende en av de forskjellige komponenter som er nødvendige for forsøket: perler, DNA, fluorescently-merket protein, og bildebuffer. Separering av komponentene i strømningskanalene tillater effektiv montering av dumbbell. Videre er bildekanalen nyttig å unngå bakgrunnsfluorescens fra proteiner Diffusorelementene og oppnå den høye signal-til-støy-forhold som kreves for lokalisering av den DNA-bindende protein med en nøyaktighet av størrelsesorden på noen få nanometer.- Bor 1 mm diameter hull i objektglass (76 x 76 x 1 mm) med en diamant-spiss, for å lage fire innløp og ett utløp.
- Clean the objektglass med etanol og sentrere port med O-ring inn og limet ring i raset rundt tilgangshullene. Det er grunnleggende å bruke hansker under dette trinnet for å unngå fingeravtrykk, noe som ville forstyrre liming prosessen.
- Klemme NanoPorts til raset, og plasser den i ovn forvarmet ved 180 ° C i 1 time for å tillate komplett vedlegg.
- Tegne omrisset mønster av strømningscellen på et stykke papir. Kanalene skal være ~ 3 mm bred og matche hullene posisjon på objektglass.
- Plasser tegningen på toppen av to stykker av Parafilm, og med en skalpell lage skarpe og kontinuerlige kutt langs trukket disposisjon. Fjern eventuelle fremspring dannet. Kast den nedre Parafilm laget, som bare brukes til å garantere en ren støtte.
- Legg objektglass inneholdende de vedlagte NanoPorts opp-ned i den metalliske støtte.
- Rettes opp Parafilm kammer omrisset med hullene, noe som gjør at thpå parafilm ikke utgjøre en hindring innløpene og utløpet fra kammeret.
- Dekk med et renset mikroskop dekkglass (62 x 56 x 0,15 mm) og forsiktig fjerne overflødig Parafilm- rundt kammeret.
- Plasser to varmeblokker, som tidligere oppvarmet til 120 ° C, på toppen av strømningscellen for å anvende konstant trykk på den. La Parafilm smelte for ca 25 min.
- Trykk reservoaret og bufferbeholdere
Trykket reservoaret skal være laget av plexiglass (eller lignende) og la innkvartering av seks bufferbeholdere. Muligheten for å ha i det minste to ekstra bufferbeholdere forbedrer instrumentets fleksibilitet. Merk at gjennomsiktige beholdere og rør betydelig bistå i flow-system håndtering og feilsøking av luftbobler. Sterile og disponibel luerlås-spissen sprøyter (2,5 ml), fra hvilket stemplene har blitt fjernet tidligere, er gode bufferbeholdere, og tillate en enkel forbindelse med innløpsrøret. Pass på atdet totale væskevolumet er lite i forhold til luftvolumet inne i trykkbeholderen, en tilstand som nødvendig for å oppnå jevn og stabil strømning.- Koble stengeventiler ved utkjørselen av buffer beholdere for å snu buffer flyt av eller på under forsøkene.
- Monter strømningscellen på mikroskopet scenen. Koble stengeventiler til flyt kammer viker med polyetereterketon tubing (indre diameter ~ 150 mikrometer) og uflensede beslag. Legg ~ 3 cm av fluorert etylen-propylen-rør (indre diameter ~ 500 mikrometer) som en binding mellom røret og de NanoPort sammenstillinger av strømningscellen. Dette trinnet er nødvendig for å redusere bufferstrømmen ved inngangen til kammeret for å unngå brekkasje av strømningscellen eller NanoPort løsgjøring fra glasset. Bruken av store indre diameter slange alene, på den annen side, ville kreve enorme volumer av biologiske prøver.
- Koble strømningskammeret utløp til en åpen Falcon rør ved atmosfæretrykk. Detterøret tjener som disposisjon for bufferen som strømmer ut av strømningskammeret.
- Trykkontrollsystem
- Bygg et trykkreguleringssystem som kan av fint justering av lufttrykket inne i trykkbeholderen. Dette kan gjøres ved hjelp av to datamaskin-styrte magnetventiler, som er koblet til en 0,5 atm trykk kilde (kompressor) og den andre en til atmosfærisk trykk. Magnetventiler blir gjentatte ganger åpnet i omtrent 7 millisekunder for å øke eller redusere trykket i ledningen til den ønskede verdi er nådd. MERK: denne tilnærmingen var tilpasset fra Carlos Bustamante 20, og det gir en jevnere flyt enn å bruke en stepping motor sprøytepumpe 21.
- Legg til en trykktransduktor styres av en tilpasset skrevne programvare for å overvåke den effektive trykk som utøves på trykkbeholderen. Typiske arbeidstrykket er av størrelsesorden 20 mBar for dumbbell montering og 200 mBar for vask av strømningssystemkomponenter.
4. DNA Daling med Biotinylated deoksycytidintrifosfat (biotin-dCTP)
DNA-molekylet bør være lengre enn en mikrometer for å lette dens utvidelse under strømning og forankring til de fangede perler. Videre vil en lang DNA hindre IR overlapping lys fra belyse DNA-bindende protein. Dette er spesielt relevant fordi absorpsjon av IR lys fra en begeistret kromofor fører til økt fotobleking. MERK: I denne studien, DNA-molekylet var 3,7 mikrometer lang. Molekylet inneholdt tre kopier av den primære operatøren O1 og en kopi av hver av de to hjelpeoperatører, O2 og O3. Disse sekvenser er blitt satt inn i midten av molekylet, noe som resulterer omtrent like langt fra de fangede perler og IR-laserstråler.
- Bland 1 pmol av lineære DNA-3'-ender med 60 pmol av biotin-14-dCTP, 4 ul 5x Terminal Transferase deoksynukleotidyltransferase (TdT)-buffer (1 M kalium cacodylate, 125 mM Tris, 0,05% (v / v) Triton X-100, 5 mM CoCl 2 (pH 7,2 ved 25 ° C)), og 1,5 ul TdT og DDH 2 O i et totalt volum på 20 pl. Inkuber blandingen ved 37 ° C i 15 min. Dette vil resultere i at tilsetning av opp til 60 nukleotider pr DNA ekstremitet. Merk at DNA-3'-overheng er tailed med høyere effektivitet enn innfelte og butte endene.
- Rens tailed DNA med spinnkolonner eller fenol / kloroform ekstraksjon og etterfølgende etanolutfelling for å fjerne CoCl 2 fra TdT reaksjonsbuffer.
- Etter rensing, kan DNA bli lagret ved 4 ° C i flere uker eller ved -20 ° C i lengre perioder, men unngå gjentatt tining og gjenfrysing.
5. Merking Protein tiolgrupper med ATTO532
Merking gjennom modifisering av cysteinrester må ikke endre protein aktivitet. For å bøte på dette problemet, vi brukte en Laci mutant, LacIQ231C, hh bærer bare ett cystein per monomer i posisjon 231. Denne mutant bevarer de samme egenskapene til villtype og kjemiske modifikasjoner i posisjon 231 har vist seg å ikke interferere med proteinstabilitet 22.. MERK: Vi merket proteinet med ATTO532 maleimide.
- Påse at proteinet blir løst opp i en buffer med en pH som strekker seg 7,0 til 7,5 og med en konsentrasjon som varierer fra 2 til 10 mg / ml. Merk: I disse forsøk ble laci oppløst i 0,3 M kaliumfosfat, 5% glukose, pH 7,5 (buffer A).
- Oppløs Tris-(2-karboksyetyl) fosfin-hydroklorid (TCEP) til en endelig konsentrasjon på 100 mg / ml i H2O TCEP løsningen må være forberedt frisk før bruk.
- Bland 100 mL av protein med 3 mL TCEP og virvle nøye.
- Oppløs fargestoff i N, N-dimetylformamid (DMF) til en sluttkonsentrasjon på 10 mg / ml som arbeider ved lav lys tilstand. Vortex til det er helt oppløst.
- Reaksjons mix: Legg 33 mL av fargestoff til protein + TCEP og virvle nøye. Fast spin å samle så mye løsning som mulig.
- Inkuber reaksjonsblandingen i 2 timer på en rister (8000 rpm) ved 20 ° C (eller ved 4 ° CO / N), beskyttet mot lys.
- Overtone L-glutation redusert (GSH) til en endelig konsentrasjon på 100 mg / ml i H2O Tilsett 3 mL til reaksjonsblandingen og inkuberes på rister ved 8000 rpm i 15 min. GSH stopper reaksjonen ved å blokkere reaktiviteten til tiolgrupper.
- Rense merket protein ved hjelp av standard gelfiltreringsmetodene kolonner, dialyse eller spin konsentratorer. MERK: I disse eksperimentene, ble merket Laci renset ved hjelp av 10 kDa cutoff spin konsentratorer.
- Fortynn reaksjonsblandingen med opp til 12 ml med buffer A, bruke den til konsentrator-enheten, og den sentrifuger ved 8000 xg, 1 time, 4 ° C. Den merkede laci er således konsentrert til et sluttvolum på omtrent 500 pl, og det overskytende fargestoff passerer membranen i flow-through. Kast gjennomstrømning og gjenta trinn 5.8.1 minst tre ganger.
- Fordel merket protein i små porsjoner og oppbevar ved -80 ° C. Unngå gjentatt frysing og tining.
6. kombinert optisk fangst og enkelt-molekyl fluorescens bildebehandling eksperimenter
- Tilsett 1 ml med buffer A til buffer-beholderne og anvende 200 mbar trykk for å vaske de sammenkoblede rørene og strømningscelle. For å maksimere diffusjon av det bindende protein på DNA, her og i de følgende trinn, buffer A kan erstattes med en lav ionestyrke buffer. MERK: I disse forsøkene har vi brukt TBE 0.5x.
- Kontroller for tilstedeværelse av luftbobler, som kan forstyrre flyten glatthet. En mild flick på utløpsrøret vil bidra til å fjerne eventuelle gjenværende bobler.
- Reduser trykket til 20 mbar og kontroller at alle kanaler og rør er klart fra luftbobler og bufferen flyter med lignende hastigheter i alle kanaler.
- Forbered prøvene til en sluttvolum på 300 ul: streptavidin-belagt polystyren perler 1,87 um; 20 pM av lineære DNA, biotinylert på begge ekstremiteter i henhold til § 4; 300 pM av Laci tetramer merket med ATTO532 henhold til § 5.
- Legg hver prøve til en av sprøytebeholdere i følgende rekkefølge: perler i den første kanalen, DNA i den andre, tredje kanal med bildebufferen kun (buffer A + oksygenfjerner system), og det merkede protein i fjerde kanal.
- Drei vannmengde på 200 mBar i 3 min for å la prøvene kommer på innsiden av strømningskanalen. Deretter reduseres trykket til 20 mBar.
- Mens Imaging Den første kanalen under lyse feltet belysning, slå på de to optiske pinsetter og fange en isopor i hver felle.
- Bevege seg raskt til den andre kanalen for å unngå at andre perler falle i fellene. Legg merke til at ankomsten i DNA-kanalen er lett merkbart ved slutten av vulsten strømmen.
- Ved hjelp av one AOD, beveger en felle (bead) frem og tilbake i nærhet av den andre vulsten for å tillate festing av strømnings-forlenget DNA mellom de to optisk fanget perler. Når en DNA-dumbbell er dannet, starter den statiske vulsten følge bevegelsen av vulsten som er aktivt beveges frem og tilbake ved fellen.
- Bevege seg raskt til bufferen kanal og slå av bufferstrømmen. Utfør en forlengelseskraft-kurven 4,23-25 analyse for å bekrefte tilstedeværelsen av et enkelt DNA-molekyl. Hvis mer enn ett molekyl er til stede (dvs. entalpisk, heve fase av utvidelsen kraft-kurve oppstår til en lengde kortere enn DNA kontur lengde), forkaste dumbbell og starte på nytt fra trinn 6.7.
- Når en enkelt DNA dumbbell er oppnådd, slå på strømmen igjen og flytte dumbbell til protein kanal. Bytt til bredt felt fluorescens mikroskopi for å overvåke samspillet av merket-Laci med DNA. Slå av strømmen og begynne oppkjøpet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en vellykket eksperiment gjennomgår en (eller flere) merkede proteiner binding / uforpliktende og / eller monodimensional diffusjon langs DNA-molekylet (figur 3A). Lokalisering av proteiner langs DNA-molekylet tillater kvantifisering av kinetiske parametre som en funksjon av DNA-sekvensen. Når bufferbetingelser som forårsaker 1D diffusjon er anvendt, er det mulig å følge protein baner, og bestemme, for eksempel diffusjonskoeffisienten D 1D.
Den nøyaktige posisjonen til et enkelt sted, i hver ramme, kan bestemmes ved å montere punktspredefunksjon (PSF) med en todimensjonale Gaussian funksjon eller, alternativt, ved håndtering av et stort datasett, med en raskere, nylig publisert algoritme (Radial Symmetri Center, RSC) 26,27. Den sistnevnte metode bestemmer punktet for maksimal radial symmetri av bildet, å oppnå en lokaliseringspresisjon som vanligvis er sammenlignbare med Gaussisk montering. I Bøth tilfeller kan sporing oppnås gjennom MATLAB rutiner som kan nås fritt 27.
Figur 3A viser en kymogram av et typisk eksperiment hvor en enkelt laci molekyl diffunderer langs ikke-spesifikke DNA-sekvenser, mens en annen laci-molekylet er spesifikt bundet til en operatør, som ligger i sentrum av DNA-molekylet. Figur 3B viser posisjonen av de to laci-molekyler (oppnådd ved hjelp av RSC) langs retningen som forbinder sentrene for de to feller (x), som en funksjon av tiden. Fra stillingen av molekylet diffundere langs DNA-molekylet, beregnet vi Mean Square Vekt (MSD) ved forskjellige tidsintervaller i henhold til den følgende ligning:
(1)
hvor N er det totale antall posisjoner måles og n er måling indeksen går f ROM 1 til N. I tilfelle av ren unidimensional Brownsk diffusjon, er MSD direkte proporsjonal med n aT (DT er tidsintervallet mellom to etterfølgende rammer, 100 msek i våre eksperimenter), med en helling som tilsvarer det dobbelte av diffusjonskoeffisienten (MSD (N, N) = 2D en nΔt). Figur 4 viser MSD vs nΔt tomt for molekylet spre langs DNA. Den diffusjonskoeffisienten av proteinet lett kan oppnås fra en lineær tilpasning av MSD vs nΔt plottet. Legg merke til at etter hvert som n øker, antall poeng for beregning MSD fra Eq. 1 reduseres følgelig. Feilen i evalueringen av MSD øker dermed med n. Av denne grunn, valgte vi å begrense vår analyse til n = N / 4. Dette er likevel en ganske stor verdi i forhold til N / 10 brukes av mange laboratorier.
tp_upload / 51446 / 51446fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Den eksperimentelle oppsettet består av: halogenlampe (H), kondensator (C), sample (S), piezo oversettere (xy og z), objektiv (O), en lav-forstørrelse kamera (CCD 200X) og en høy -magnification kamera (CCD 2,000X) brukes for nm-stabilisering tilbakemeldinger (BS er en 50:50 beam splitter cube). er dobbel optisk pinsett satt inn og hentet fra den optiske aksen av mikroskopet gjennom dichroic speil (D2 og D3) og består av: Nd: YAG laser (1064 nm), optisk isolator (OI), λ / 2 waveplates, polariserende beam splitter kuber (PBS), akustooptiske deflektorer (AOD), 1064 nm interferential filtre (F1 og F2), kvadrant detektor fotodioder (QDP). Signaler fra QDPs ble ervervet via en analog-til-digital omformer (ADC) og utdypes med en FPGA bord. To spesialbygde direkte digitale synthesizere (DDS) kjørte AODs å kontrollere feller 'posisjon. En digital input-output board (DIO) kontrollerteapertur av to magnetventiler (V1 og V2) som er koblet til en kompressor (0,5 atm) og omgivende trykk (0 atm), henholdsvis. En Labview programvare overvåkes trykket inne i trykkbeholderen (C1) gjennom en trykkmåler (PM), og automatisk åpnes av en av de to ventiler for å oppnå det ønskede trykknivå. Fluorescenseksitasjon ble levert av en duplisert Nd: YAG laser (532 nm) og bildet projiseres på et elektron multiplisert kamera (EMCCD). M er en bevegelig speil, F3 en utslippsfilter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. (A) Flow system diagram. Den trykk-kontrollsystemet består av en trykkmåler (PM) og to magnetventiler V1 og V2 kobleed til en kompressor på 0,5 atm (PRS) og omgivelsestrykket (ATM), henholdsvis. X1 og X2 representerer 3-veis kontakter. Blenderåpningen av ventilene er finjusteres for å nå det ønskede trykk i trykkbeholderen med C1 4 bufferbeholdere. Hver innløpsrøret omfatter en uavhengig av / på-ventil på inngangen av multikanal strømningskammeret. Utløpsslangen er koplet til avfallsbeholderen C2 plassert ved omgivelsestrykk. Tegningene er ikke i målestokk. (B) Skjematisk fremstilling av flerkanals strømningskammeret. Fire laminære strømmer separat translocate funksjon polystyren-perler, DNA-molekyler, bildebuffer og merkede proteiner. To perler er fanget med to optiske pinsetter og flyttet til DNA-kanal for å tillate DNA forankring i mellom dem. En DNA forlengelseskraft-analyse utføres i bufferen kanalen for å verifisere tilstedeværelsen av et enkelt DNA-molekyl, og like etter, blir DNA inkubert i protein-kanalen. Det innfelte viser en Magnifiseringen av den endelige molekyl konstrukt, klar for enkelt-molekyl avbildning i bufferkanalen. Tegninger er ikke i målestokk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Lokalisering av enkelt laci-molekyler som vekselvirker med en strukket DNA-molekyl. (A) Den vertikale akse av kymogram representerer x-koordinaten, parallelt med DNA-molekylet, mens den horisontale akse er tid (100 msek registreringstid.) (B ) X-posisjonen av molekylet laci vs tid. Posisjonen av molekylene ble bestemt ved RSC. Bilder ble kjøpt til 100 msek eksponeringstid og 1,25 x 10 -2 W cm -2 exci. tering laser intensitet Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Plot av MSD kontra tid for et enkelt molekyl laci diffundere langs en strukket DNA-molekyl. MSD beregnes fra stillingen posten representert på figur 3B (rød). Den diffusjonskoeffisienten D 1D, oppnådd fra lineær regresjon av dataene som er avbildet i figuren, er 0,030 ± 0,002 mikrometer 2 sek -1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det siste tiåret, har enkelt molekyl manipulasjon og bildeteknikker sett stor fremgang når det gjelder romlig og tidsmessig oppløsning. Kombinasjonen av manipulasjon og avbildningsteknikker er på bunnen av kraftige instrumenter som nå tillater kontroll av de mekaniske betingelsene for en enkelt biologisk polymer, slik som DNA, RNA eller cytoskeletal filamenter, og den samtidige lokalisering av enkle proteiner i samspill med den samme polymeren . Styre de mekaniske betingelsene for den innfangede polymeren er av spesiell interesse. Faktisk, i levende celler, nukleinsyrer er kontinuerlig under mekanisk belastning forårsaket av interaksjon enzymer og proteiner; på samme måte, modulerer et komplekst nettverk av interagerende proteiner og molekylære motorer spenning på cytoskeletal filamenter. På den annen side, til muligheten for å oppdage og lokalisere nøyaktig proteiner som vekselvirker med nukleinsyrer, tillater måling av molekylære interaksjoner som en funksjon av deres posisjon langs DNA-eller RNA-sekvens.
Kombinere enkelt-molekyl manipulasjon og bildeteknikker krever forsiktig design av eksperimentelle oppsettet og de biologiske konstruksjoner. Optiske feller må gi en stabil støtte, noe som sikrer nm-nivå stabilitet av suspendert polymer. En slik stabilitet kan nås gjennom forsiktig isolering av det eksperimentelle enheter fra de mange kilder for mekanisk støy og ved å minimalisere laser peker og amplitude svingningene. Presise (sub-nm) bevegelser av optiske fellene er oppnådd ved hjelp av AODs drevet av DDSS. Her illustrert vi en steg-for-steg-protokollen for å optimalisere og sjekke optisk pinsett 'stabilitet på nm-nivå.
Enkel bredt felt epi-fluorescens mikros koblet til en EMCCD kameraet brukes til å lokalisere enkelt kromoforer samspill med den suspenderte polymer. Vår eksperimentelle metoden er begrenset til lang DNA eller RNA molekyler (≥6 kbp) som sikrer en romlig atskillelse betlom fangst laserstrålen og fluorescerende probe. Faktisk ville overlagring av den nær-infrarøde laser overlapping med synlig laser magnetisering føre til forbedret fotobleking av kromoforer som følge av absorpsjon av nær-infrarødt lys, mens kromofor er i spent tilstand 16. Dumbbell montering er en annen vanskelig prosedyre som er bedre oppnås ved hjelp av en flerkanals flow-celle, som vi ga en detaljert beskrivelse. Vi forklart hvordan vi kan optimalisere buffer flyt og hvordan du kan unngå luftbobler, som kan ellers seriøst kompromiss eksperimenter. Vi beskrev protokoller for merking av DNA ekstremiteter med biotin, som er nødvendig for manualsettet med streptavidin-belagt perler, og protokoller for protein merking. Til slutt illustreres vi trinnvise operasjoner for å utføre eksperimenter hvor den bindende og diffusjon av et enkelt laktose repressor molekyl på en strukket DNA-molekyl blir kvantifisert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Gijs wuite, Erwin JG Peterman, og Peter Gross etter hjelp med MicroFluidics og Alessia Tempestini for hjelp med prøveopparbeidelse. Denne forskningen ble finansiert av EU sjuende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) under tilskuddsavtalen n ° 284464 og fra det italienske departementet for utdanning, Universitetet og forsknings FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro i Ricerca 2013 RBFR13V4M2, og innenfor rammen av Flaggskip Prosjekt NANOMAX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies |
| Optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | |
| Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | |
| Acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | ||
| Quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | |
| Electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | |
| Silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | |
| Pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapor (No 1272/2008) |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) |
| Heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120 °C |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | |
| Polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | |
| Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | |||
| Luer lock-tip syringes 2.5 ml | Terumo | SS 02LZ1 | |
| Shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | |
| Flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | |
| Fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | |
| Two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | |
| Pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | |
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | |
| Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 |
References
- Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
- Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
- Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
- Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
- Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
- van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).
- Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
- Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
- Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
- Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
- van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
- Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
- Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).
