Hier beschrijven we de instrumenten en werkwijzen voor het detecteren enkele fluorescentie-gemerkt eiwitmoleculen interactie met een enkel DNA-molecuul opgehangen tussen twee optisch gevangen microsferen.
The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.
Enkel molecuul (SM)-technieken zijn sterk ontwikkeld in de afgelopen dertig jaar te spelen op de behoefte van het overwinnen van een aantal van de beperkingen van de traditionele, buikoplossing metingen 1-3. De manipulatie van enkele biologische moleculen heeft de mogelijkheid om de mechanische eigenschappen van biopolymeren 4 meten en controleren van de mechanische parameters van eiwit-eiwit 5 en eiwit-DNA interacties 6,7 gemaakt. SM fluorescentiedetectie, anderzijds, vertegenwoordigt een enorm veelzijdig hulpmiddel om eiwitactiviteit in vitro en in vivo, waardoor de mogelijkheid van het lokaliseren en volgen enkele moleculen nanometerprecisie. Door montage van het instrument point spread-functie beeld SM, in feite, kan lokalisatie bereiken met een precisie hoofdzakelijk afhankelijk signaal-ruisverhouding (SNR) en tot een maximum van ongeveer een nanometer 8,9. Deze methodieken vind krachtigtoepassingen in de studie van de dynamica van motorische eiwitten, alsmede de diffusie processen die doelzoek- in DNA-bindende eiwitten. Het vermogen van het bepalen diffusieconstanten als functie van de DNA-sequentie, verblijftijd op het substraat en nauwkeurig meten van de DNA lengte onderzocht tijdens eendimensionale diffusie events, vormen een krachtig hulpmiddel voor de studie van proteïne-DNA-interactie dynamiek en het onderzoek van de mechanismen van de specifieke doelgroep zoeken.
Onlangs is de combinatie van deze twee technieken een nieuwe generatie meetopstellingen 10-14 die gelijktijdige manipulatie van een biologisch substraat (bijvoorbeeld een actine filament of een DNA-molecuul) en detectie / lokalisatie van een interactie partner enzym (bijvoorbeeld geproduceerd myosine of een DNA bindend eiwit). De voordelen van deze technieken voornamelijk berusten op de mogelijkheid oefenen mechanische controle over de gevangen polymeer, waardoor enabling de studie van de interactie tussen de dynamiek versus krachten of koppels. Ook de methode maakt metingen van biochemische reacties ver van het oppervlak voorkomen een van de belangrijkste beperkingen van klassieke SM methoden, namelijk de noodzaak van immobilisatie van de moleculen onder studie op een oppervlak (glasplaatje of microbolletjes).
De combinatie van twee enkelvoudige moleculen technieken vereist het overwinnen van enkele technische problemen, vooral als gevolg van de eisen van de mechanische stabiliteit en voldoende SNR (vooral wanneer die lokalisatie met nm precisie) 15. In het bijzonder wanneer SM fluorescentie detectie koppeling met een optisch pincet, de vermindering van het lawaai en fotobleken van de trapping infrarode lasers 16 en de controle van biochemische buffers voor de montage van de biologische complexen en de prestaties van de experimentele metingen 11 van het allergrootste belang. Hier beschrijven we de werkwijzen voor succesvolle uitvoeringmetingen in een dual trapping / SM Fluorescentie lokalisatie setup. De methodiek wordt geïllustreerd met het voorbeeld van lactose repressor eiwit (LacI) fluorescent gelabelde (met Atto532) en gedetecteerd als het bindt aan een DNA-molecuul (opgesloten tussen twee optische pincetten) met specifieke LacI bindingssequenties (dwz operators). We tonen de doeltreffendheid van de werkwijze het detecteren van binding van LacI aan DNA en diffusie langs de contour in het doel zoekproces. De methode is van toepassing op elke combinatie van DNA-sequentie en DNA-bindende eiwit, en andere systemen (microtubuli en actine filamenten en de motor eiwitten interactie met hen).
In de afgelopen tien jaar hebben enkel molecuul manipulatie en beeldvormende technieken een grote vooruitgang op het gebied van ruimtelijke en temporele resolutie te zien. De combinatie van manipulatie en beeldvormingstechnieken aan de basis van krachtige instrumenten die nu toelaten de controle van de mechanische condities van een biologisch polymeer, zoals DNA, RNA of cytoskelet filamenten en de gelijktijdige lokalisatie van afzonderlijke eiwitten die interageren met hetzelfde polymeer . Beheersing van de mechanische …
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Gijs Wuite, Erwin JG Peterman, en Peter Gross voor hulp bij de microfluidics en Alessia Tempestini voor hulp bij de monstervoorbereiding. Dit onderzoek werd gefinancierd door de Europese Unie Zevende Kaderprogramma (KP7 / 2007-2013) onder subsidieovereenkomst n ° 284464 en van het Italiaanse ministerie van Onderwijs, Universiteit en Research FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro in Ricerca 2013 RBFR13V4M2, en in het kader van de Flagship Project NANOMAX.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | Web Address |
elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies | http://www.newport.com |
optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | http://www.ofr.com | |
Nd:YAG laser, 1064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | http://www.newport.com/ | |
acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | http://www.aaoptoelectronic.com/ | |
Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | http://www.analog.com/ | ||
quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | http://www.osioptoelectronics.com | |
DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | http://www.ni.com | |
Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | http://www.schott.com | |
Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | http://www.olympus-global.com/en/ | |
Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | http://www.nikoninstruments.com | |
532 nm laser | Coherent | Sapphire | http://www.coherent.com | |
CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | http://www.hamamatsu.com | |
electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | http://www.hamamatsu.com/ | |
piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | http://www.physikinstrumente.com/ | |
Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | http://www.chroma.com | |
silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | http://www.bangslabs.com/ | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapour (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120° C | http://www.mpminstruments.com |
NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | http://www.upchurch.com/ | |
polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | http://www.upchurch.com/ | |
home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | ||||
luer lock-tip syringes 2.5 mL | Terumo | SS 02LZ1 | http://www.terumomedical.com | |
shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | http://www.upchurch.com/ | |
flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | http://www.upchurch.com/ | |
fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | http://www.upchurch.com/ | |
two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | http://www.clippard.com | |
pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | ||
biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | http://www.lifetechnologies.com/ | |
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | http://www.thermoscientificbio.com/ | |
ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption., Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | http://www.merckmillipore.it/ | |
streptavidin-coated polystyrene beads 1,87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 | http://www.spherotech.com/ |