Summary
Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.
Introduction
Tek molekül (SM) teknikleri büyük ölçüde geleneksel, toplu çözüm ölçümler 1-3 bazı sınırlamaları aşmanın ihtiyaca cevap verecek son otuz yılda geliştirdik. Tek bir biyolojik moleküllerin manipülasyon Biyopolimerlerin 4 mekanik özelliklerini ölçmek ve protein-protein 5 ve protein-DNA etkileşimleri 6,7 mekanik parametrelerini kontrol etme fırsatı yaratmıştır. SM floresans saptama, diğer taraftan, lokalize ve nanometre hassasiyetle tek mölekülleri izleme olasılığına yol açan, in vitro ve in vivo olarak protein aktivitesini incelemek için son derece çok yönlü bir araç temsil eder. SM görüntü enstrüman nokta-yayılma-fonksiyonu takılması sayesinde, aslında, bir hassas sinyal-gürültü oranı (SNR) esas olarak ve yaklaşık bir nanometre 8,9 sınırı ulaşan lokalizasyon gerçekleştirebilirsiniz. Bu metodolojiler güçlü buluyorummotor proteinlerinin aktif halde dinamikleri çalışma uygulamaları yanı sıra, DNA-bağlama proteinleri hedef arama altında yatan difüzyon prosesleri. Hedef bir DNA dizisinin bir fonksiyonu bekleme süresi olarak difüzyon katsayılarının hesaplanmasına ve doğru bir tek boyutlu difüzyon olaylar sırasında incelenmiş DNA uzunluk ölçme özelliği, bir protein-DNA etkileşim dinamikleri çalışma ve araştırma için güçlü bir araç temsil eder Belirli hedef arama mekanizmaları.
Son zamanlarda, bu iki tekniğin bir kombinasyonu, örneğin (örneğin bir tel ya da aktin bir DNA molekülü) bir karşılıklı etkileşim eşinin enzimin ve bulma / lokalizasyonu biyolojik bir alt-tabakanın aynı anda işleme ortamı deney düzeneğinde, 10-14 yeni nesil (üretti miyozin ya da bir DNA-bağlama proteini). Bu tekniklerin avantajları başta böylece ena, tuzağa polimer üzerinde mekanik kontrol uygulamakla olasılığı dinlenmekuvvetleri veya momentleri karşı etkileşim dinamikleri çalışma bling. Ayrıca bu yöntem, klasik yöntemler SM, yani bir yüzey üzerinde çalışılan moleküllerin immobilizasyonu için ihtiyacı (cam slayt, ya da mikro-) ana sınırlamalarının kaçınarak yüzeyden uzak biyokimyasal reaksiyonları ölçülmesine imkan verir.
İki tekli moleküller tekniklerin kombinasyonu özellikle mekanik stabilite ve 15 (özellikle nm hassasiyet ile yerelleştirme gerektiren) yeterli SNR şartlarından doğan, çeşitli teknik zorlukların üstesinden gerektirir. Optik cımbız, gürültü azaltma ile SM floresens bağlanması ve bindirme kızılötesi lazer 16 ve biyolojik komplekslerinin düzeneği ve deneysel ölçümler 11 yapılması için biyokimyasal tamponların denetimi ışıkla Özellikle zaman, büyük önem taşımaktadır. İşte, başarılı performans için yöntemleri tarifBir çift hapsi / SM Floresans yerelleştirme kurulum ölçümleri. Metodoloji, spesifik LacI bağlayıcı dizileri (yani, operatörler) ihtiva eden laktoz represör proteini (Lacl) floresan (Atto532) ile etiketlenmiş ve (iki optik cımbız arasında sıkışan) bir DNA molekülüne bağlanan olarak algılanan bir örnekle gösterilmiştir. Bu hedef arama işleminin kontum boyunca DNA ve difüzyona LacI bağlayıcı tespit yönteminin etkinliğini göstermektedir. Bu yöntem, DNA dizisi, DNA bağlama proteini, herhangi bir kombinasyonu gibi başka sistemler (mikrotübüllerin veya aktin filamentler ve onlarla etkileşim motor proteinlerinin) için de geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nanometre Stabilite ile 1. Optik Cımbız Kur
Deney düzeneği% 1'in altına yakalama lazer nanometre seviyesi ve yoğunluğu dalgalanmalar istikrarı işaret iki optik cımbız sağlamalıdır. Bu koşulların kombinasyonu tipik gerilim altında dambıl nanometre istikrarı sağlayacaktır (1 pN - Birkaç pN onlarca), tuzak sertlik (0.1 pN / nm) ve ölçüm bant genişliği (görüntü elde etme oranı 20 sn -1). Deney düzeneği bir şema, Şekil 1 'de tasvir edilmiştir.
- Optik cımbız tasarım ve inşaat 15,17:
- Mekanik titreşimleri azaltmak için aktif izolatörleri bir optik masaya deney cihazları monte edin. Akustik gürültüyü ve mikroskop yapının mekanik rezonans absorbe elastomerik yalıtkanları mikroskop yapıya monte edin.
- R, lazer kaynağının yakınında, ayırma lazer yolunda bir optik izolatör kaydedinnedeniyle optik geribildirim rastgele genlik dalgalanmaları kent içi.
- Mümkün olduğu kadar yakalama lazerin yol uzunluğunu azaltmak ve hava akımları ve türbülansa bağlı bir lazer işaret dalgalanmalarını azaltmak için bir kapalı kutu içinde bütün yolu içine alın.
- Dik polarizasyonlarda iki kiriş içine: (YAG lazer, 1.064 nm dalga boyu Nd) tek bir yakın-kızılötesi lazer kaynağı bölerek çift optik cımbız oluşturun. Onlar gerilim 12 altında dambıl dalgalanmaya sebep nedeniyle zaman paylaşımlı tuzakları kullanmayın.
- (En az) bir tuzak ve DNA gerginlik hassas düzenlenmesi ince hareketlerini sağlamak için Doğrudan Dijital Synthesizers (DDSS) tarafından tahrik acousto-optik deflektörlerini (AODs) kullanın. DDSS gerilim kontrollü osilatörler (VCO'lar) daha iyi bir tuzak stabilite sağlar.
- Alt nm hassasiyetle tuzak boncukların pozisyonunu tespit etmek için kondansatörün tekrar odak düzleminde iki kadran detektörü fotodiyotlar (QDPs) takın.
- Bu yoğunluk f edinmikroskop girişinde yakalama lazerin luctuations görüntü elde oranından daha büyük bir bant genişliğine sahip bir fotodiyot kullanılarak% 1 altındadır.
- İki yakalama lazerlerin işaret istikrar Giriş:
- Fosfat tamponu içinde silika boncuk hazırlayın: silis boncuklar, 20 ul seyreltilmiş (1.54 um,% 10 katı) 1 ml aseton içine kısa bir süre, 30 saniye, vorteks sonikasyon ve santrifüj 2 dakika 19,000 x g'de. 1 ml aseton ve tekrar yıkama süspanse edin. 50 mM fosfat, 1 ml tampon içinde yeniden süspanse 2 kez yıkanır ve son olarak 50 mM fosfat tamponu, 100 ul süspansiyon haline getirin.
- Silis boncuklar ile optik cımbız kalibre: (yaklaşık 60 mikron kalınlığında) çift yapışkan bant kullanılarak bir mikroskop lamı bir coverslip takarak bir akış hücresi hazırlamak. 1 mg / ml BSA, akış ve 3 dakika bekleyin. Silis taneleri fosfat tamponu içinde 1/1000 seyreltilmiş Akış ve silikon gres ile akış odasını sızdırmaz. Tuzak her biri tuzağına boncuk ve güç spektrumu yöntemi 18 kullanarak tuzakları kalibre. Pentil asetat ve nitro selüloz silika boncuk hazırlayın: silis boncuklar, 20 ul seyreltilmiş (1.54 um,% 10 katı) 1 ml aseton içine kısa bir süre, 30 saniye, vorteks sonikasyon ve santrifüj 2 dakika 19,000 x g'de. 1 ml aseton ve tekrar yıkama süspanse edin. Ve pentil asetat, 1 ml içinde süspanse 2 kez yıkayın. Son olarak pentil asetat içinde çözülmüş,% 0.1 ile nitroselüloz pentil asetat bunları tekrar süspansiyon.
- İkinci bir örtücü cam (60 x 24 mm) kullanılarak, bir lamel (24 x 24 mm) yüzeyi üzerine pentil asetat +% 0.1, nitroselüloz içinde çözülmüş 1,54 mikron çaplı silis boncuklar 2 ul yayıldı. Bir akış hücre oluşturmak için çift taraflı bant, iki adet kullanarak bir mikroskop lamı lamel takın. 50 mM fosfat tampon maddesi ile akış-hücre doldurun ve silikon yağı ile kapağını kapatın.
- 2,000X büyütmede aydınlık görüntü mikroskopi bir silis boncuklar. Boncuk görüntü 190 p bir çapa sahip olacak şekilde görüş alanı, 768 x 576 piksel değerinde alınan 7 x 5 um olmalıdırixels. Ref. 17'sinde olarak, kırınım halkaları görüntü sentroidi ve z xy pozisyonlarını hesaplar ve nm-doğruluğu ya da daha iyi bir piezo sahne hareket sürükleniyor düzeltir, bir geri bildirim yazılımı ile termal sürükleniyor dengeleyin.
- Boncuk merkezi sol tuzağı orta örtü (QDP gelen xy sinyal seviyeleri kalibrasyon sırasında ölçülen aynı olması gerekir) ve pozisyon gürültü ve QDP onun standart sapmasının ölçülmesi. Doğru tuzak ölçümü tekrarlayın.
Nanometre Doğruluk 2. Tek Molekül Yerelleştirme
- Floresan mikroskopi tasarım ve inşaat 15,19
- Nanometre yerelleştirme doğruluğu için gerekli yüksek sinyal-gürültü oranları ulaşmak için yüksek kuantum verimliliği ve elektron-çarpılır CCD kullanın.
- Bir görüntü piksel boyutu ~ 80 nm almak için optik seçin (örneğin, 16 mikron kalınlığında bir kamera piksel boyutunda bir görüntü büyütme ~ 200X). Bu suffi olduğunupixelation 8 dolayı lokalizasyon hatası ihmal Ciently küçük, ama yeterince büyük piksel başına fotonların önemli sayıda toplamak.
- Uyarma kaynağı olarak ne olursa olsun, oryantasyonun bir tek kromoforların uyarılması üst düzeye çıkarmak için bir lazer (olmayan bir polarizasyon durumunu koruyan fiber optik vasıtası ile geçerek) olan ışığı polarize olmayan veya halka (bir λ / 4 dalga plakası içinden geçirilerek) polarize kullanır.
- Verimli kesme hem uyarma ve tuzakla lazer ışıkları emisyon band geçiren filtreler seçin. Not: Deneylerimizde Atto532 boya ile işaretlenmiş protein ve 100 nm bant 600 nm'de odaklanmış olan bant geçiş emisyon filtresi kullanılır.
3. Mikroakiskan
Tampon değişimi ve 'dambıl' montaj, yani, iki optik tuzağa mikroküreler arasında tek bir DNA molekülünün ankraj, bir ısmarlama laminer kanallı akış kesin bir kontrol elde etmeksistem geliştirilmelidir. Bu, bir akış odasının, bir basınç deposu ve bir basınç kontrol sistemi (Şekil 2) tarafından tutulur.
- Akış Hücre hazırlama
Not: bir protein-DNA etkileşim tek molekül deneyler için kullanılan akım odası 4 paralel tampon akımına izin vermek için fazla, tercihen 4 giriş ve çıkışa sahiptir 1, farklı deney için gerekli komponentlerden birini içeren her biri: boncuklar, DNA, protein ve görüntüleme tampon floresan etiketli. Akış kanallarında bileşenlerin ayrılması dambıl etkili düzeneğini sağlar. Ayrıca, görüntüleme kanal birkaç nanometre mertebesinde bir hassasiyette DNA bağlayıcı proteinin lokalizasyonu için gerekli olan yüksek sinyal-gürültü oranı difüzyon proteinlerden arka floresan önlemek ve elde etmek için faydalıdır.- 4 giriş ve bir çıkış oluşturmak için bir elmas uç ile mikroskop lamı (76 x 76 x 1 mm) olarak Matkap 1 mm çaplı delikler.
- Temiz inciE mikroskop etanol ile kayar ve sokulan O-ring ve erişim deliklerini çevreleyen slayt yapışkan halkası ile olan bağlantı noktası merkezi. Bu yapıştırma işlemi rahatsız olur parmak izi, önlemek için bu adımı sırasında eldiven giymek esastır.
- Sürgüye NanoPorts Kelepçe ve tam bağlantıya olanak vermek üzere 1 saat boyunca 180 ° C 'de ısıtılmış fırında yerleştirin.
- Bir kağıt parçası üzerinde akış hücresinin anahat desen çizin. Kanallar ~ 3 mm genişliğinde olmalı ve mikroskop lamı üzerine delikler konumunu eşleşmesi gerekir.
- Parafilmlerin iki parça üstüne çizim yerleştirin ve bir neşter ile çizilen taslak boyunca keskin ve sürekli kesim yapmak. Oluşan herhangi bir çıkıntı çıkarın. Sadece temiz bir destek sağlamak için kullanılan Parafilm ™ alt tabaka, atın.
- Ters metalik destek bağlı NanoPorts içeren bir mikroskop lamı yerleştirin.
- Dikkatle emin th yapma, delik Parafilm odası anahat hizayaparafilm de odasının giriş ve çıkış zorla kabul ettirmek değildir.
- Temizlenmiş bir mikroskop lamel (62 x 56 x 0,15 mm) ile kaplayın ve dikkatlice odayı saran aşırı Parafilm çıkarın.
- Üzerinde sürekli bir basınç uygulamak için akış hücresi üzerine, daha önce 120 ° C'de ısıtıldı, iki ısı blok, koyun. Parafilm yaklaşık 25 dakika boyunca erisin.
- Basınç rezervuar ve tampon kapları
Basınç deposu pleksiglas (veya benzeri) imal edilmiştir ve altı tampon kapların yerleşimini mümkün olmalıdır. En az iki fazladan bir tampon kap içeren olasılığı alet rahatlığını artırır. Hava kabarcığı o şeffaf kaplar ve önemli ölçüde akış sistemi kullanımına yardımcı tüpleri ve sorun giderme unutmayın. Dalma pistonları önceden kaldırılmış olan steril ve tek kullanımlık luer kilit ucu enjektörleri (2.5 mi), iyi bir tampon kapları ve boru girişi ile kolay bir bağlantı sağlar. Emin oluntoplam sıvı hacmi, basınç haznesi, düzgün ve kararlı bir akış elde etmek için gerekli bir şart içindeki hava hacmi ile karşılaştırıldığında küçüktür.- Deneyler sırasında açık veya kapalı tampon akışını dönüm için tampon konteynerlerin çıkışında kesme vanaları bağlayın.
- Mikroskop sahnede akış hücresi monte edin. Polietereterketon boru (iç çapı ~ 150 mikron) ve flangeless parçaları ile akış odası girişlerine kapatma vanalarını bağlayın. Boru ve akış hücresinin NanoPort takımları arasında bir bağlantı olarak flor ile birleştirilmiş etilen propilen boru ~ 3 cm (iç çap ~ 500 um) ekleyin. Bu adım, camdan akış hücresi veya NanoPort ayrılma kırılmasını önlemek için bölme girişinde tampon akışını azaltmak için çok önemlidir. Geniş iç çapı borunun kullanımı, tek başına, diğer taraftan, biyolojik örneklerin büyük miktarlar gerektirecektir.
- Atmosfer basıncında açık bir Falcon tüpüne akış gözü çıkışının bağlayın. Buboru akış odacığının dışına akan tampon için dizayn olarak hizmet vermektedir.
- Basınç kontrol sistemi
- Ince basınç rezervuarın içindeki hava basıncını ayarlayabilme yeteneğine sahip bir basınç kontrol sistemi kurmak. İki bilgisayar kontrollü manyetik valfler, biri 0,5 atm basınç kaynağına bağlı (kompresör) ve atmosfer basıncında, ikinci biri kullanılarak yapılabilir. Solenoid vanalar art arda artırmak veya arzu edilen bir değer ulaşana kadar hattı içindeki basıncı azaltmak için yaklaşık 7 milisaniye boyunca açılır. NOT: Bu yaklaşım Carlos Bustamante 20 uyarlanmıştır, ve bir kademeli motor şırınga pompası 21 ile daha düzgün bir akış elde edilir edildi.
- Basınç haznesi üzerinde uygulanan etkili bir baskı izlemek için özel yazılmış yazılımlar tarafından kontrol edilen bir basınç dönüştürücü ekleyin. Tipik çalışma basınçları dambıl toplanma ve akış sistemi bileşenlerinin yıkamak için 200 mBar'a için 20 mBar'a sırasına vardır.
Biyotinile deoksisitidin trifosfat 4. DNA Uzantısı (biyotin-dCTP)
DNA molekülü, en fazla 1 um tuzak boncuklara akışı ve ankraj altında genişlemeye yardımcı olmalıdır. Ayrıca, uzun bir DNA, DNA bağlama proteini aydınlatılması kızılötesi ışık yakalama önleyecektir. Bunun nedeni IR ışık emilimini artırır photobleaching bir heyecan kromofor sonuçlarından özel öneme sahiptir. NOT: Bu çalışmada, DNA molekülü, 3.7 um uzundu. Molekül, birincil operatör O1 üç kopya ve iki yardımcı operatörler, O2 ve O3 her birinin bir kopyasını ihtiva etmiştir. Bu diziler, bu şekilde yakalanan boncuklar ve IR lazer ışınları yaklaşık olarak eşit mesafede edilen, molekülün ortasına yerleştirilmiştir.
- Biyotin-14-dCTP, 60 pmol, 5x terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT), tampon 4 ul (1 M potasyum Ca doğrusal DNA 3'-uçlarının 1 pmol karıştırıncodylate, 125 mM Tris,% 0.05 (h / h) Triton X-100, 5 mM CoCl2 20 ul bir toplam hacim) ve 1.5 ul TdT ve GKD 2 O (25 ° C'de pH = 7.2). 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe karışımı. Bu DNA, ekstremite başına en fazla 60 olan nükleotidlerin eklenmesi ile sonuçlanır. 3'-çıkmalar gömme veya küt uçlar daha yüksek verimlilik ile kuyruklu olduğunu DNA unutmayın.
- TdT reaksiyon tamponundaki CoCl2 kaldırmak kolonlanyla veya fenol / kloroform ile ekstraksiyon ve etanol ile presipitasyondan sonra uçlu DNA ile saflaştınlır.
- Saflaştırmadan sonra, DNA, bir kaç hafta veya daha uzun süreler için -20 ° C de 4 ° C'de saklanır tekrarlanan erimesi ve tekrar soğutulmasından önlemek olabilir.
5. Etiketleme protein tiol grupları ile ATTO532
Sistein kalıntılarının modifikasyonu yoluyla Etiketleme protein aktivitesini değiştirmemesi gerekir. Bu sorunu aşmak için, bir LacI mutant LacIQ231C, yüklenebileceğini els, protein stabilitesi 22 ile karışmaz gösterilmiştir pozisyonda 231. Bu mutant pozisyonda 231 yabani tip ve kimyasal modifikasyonlar ile aynı özellikleri koruyan bir monomer başına yalnızca bir sistein taşır. NOT: Biz ATTO532 maleimidi ile protein etiketlenmiş.
- Protein 7,0-7,5 ve 2 'den 10 mg / ml arasında değişen bir konsantrasyonda kadar değişen bir pH değerine sahip bir tampon içinde çözülmüş olduğundan emin olun. Not: Bu deneylerde, Lacl potasyum fosfat, 0.3 M,% 5 glukoz, pH 7.5 (tampon A) içinde eritildi.
- Çözündürülür Tris (2-karboksietil) H2O içinde 100 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar fosfin hidroklorür (TCEP); TCEP çözüm kullanmak için önce taze hazırlanmış olmalıdır.
- Dikkatli bir şekilde 3 ul TCEP ve vorteks ile proteinin 100 ul karıştırın.
- Düşük ışık koşullarında çalışan, 10 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar N, N-dimetilformamid (DMF) içerisinde boya çözülür. Vortex kadar tamamen eriyene.
- Tepki miX: dikkatlice protein + TCEP ve vorteks boyanın 33 ul ekle. Hızlı eğirme mümkün olduğu kadar fazla çözelti toplamak.
- 20 ° C'de bir çalkalayıcı (8.000 rpm) 2 saat boyunca reaksiyon karışımı inkübe (ya da 4 ° CO / G), ışıktan koruyarak.
- L-glutatyon H2O içinde 100 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyona (GSH) çözülür Reaksiyon karışımı 3 ul ve 15 dakika boyunca 8,000 rpm'de çalkalayıcı içinde inkübe edilir. GSH tiyol gruplarının bloke reaktivitesi ile reaksiyonu durdurulur.
- Standart jel filtrasyon sütunları, diyaliz veya sıkma konsantratörü kullanarak etiketli proteini arındırın. NOT: Bu deneylerde, etiketli Lacl 10 kDa kesme konsantratörleri sıkma kullanılarak saflaştırıldı.
- 8,000 xg, 1 saat, 4 ° C 'de, tampon A en fazla 12 ml tepkime karışımı seyreltik yoğunlaştırıcı cihaza uygulamak ve santrifüjlenir. LacI etiketli, böylece, yaklaşık 500 ul bir son hacme kadar konsantre edildi ve fazla boya flo membran iletirw-ile. Flow-through ve adımı tekrarlayın 5.8.1 en az üç kez atın.
- -80 ° C'de küçük parçalar ve deposuna etiketlenmiş bir protein bölün. Tekrarlanan donma ve çözülme kaçının.
6. Kombine Optik Yakalama ve Tek-molekül Floresans Görüntüleme Deneyler
- Tampon kaplara tampon A içinde 1 ml ilave edilir ve bağlantı boruları yıkama ve akış hücresinin 200 mbar'lık basınç altında uygulanır. DNA, burada ve aşağıdaki adımlardan in bağlayıcı proteinin difüzyonunu maksimize etmek için, A, düşük iyonik güçlü tamponla ikame edilebilir tampon. Not: Bu deneylerde, TBE 0.5x ikinci.
- Akış düzgünlüğü kesebileceği hava kabarcıklarının varlığı, kontrol edin. Çıkış borusu üzerinde nazik bir fiske kalan kabarcıklarını çıkarmak için yardımcı olacaktır.
- 20 mBar'a basıncı azaltmak ve tüm kanallar ve tüpler hava kabarcıkları açık ve tampon tüm kanallarda benzer hızlarla akar doğrulayın.
- 300 ul son hacim olması için numunelerin hazırlanması: streptavidin kaplı polistiren taneleri 1.87 um; Bölüm 4 uyarınca her iki ekstremitelerde biyotinikasyon lineer DNA, 20UM; LacI tetramer 300 pM bölüm 5'e göre ATTO532 etiketlenmiştir.
- Aşağıdaki sırayla şırınga kapların biri her numune ekleyin: boncuk görüntüleme tampon tek (tampon A + oksijen tutucu sistemi) ve dördüncü kanal etiketli protein ile ikinci, üçüncü kanal birinci kanalın, DNA'da konumlanmıştır.
- 3 dakika için 200 mbar'da akışını açın numuneler bir akış kanalı içine gelmesi izin vermek. Ardından 20 mBar'a basıncı azaltmak.
- Parlak bir alan aydınlatma altında ilk kanalını görüntüleme iken, iki optik cımbız açmak ve her tuzak içinde bir polistiren boncuk yakalamak.
- Diğer boncuklar tuzaklarına düşmek önlemek için ikinci kanala hızlı hareket ettirin. DNA kanal varış boncuk akışının sonuna kolayca fark olduğuna dikkat edin.
- O kullanmaNE AOD iki optik tuzak halkalar arasında akış uzatılmış DNA bağlanmasına olanak sağlamak için ileri ve geri diğer kordonun yakınında bir tuzak (boncuk) hareket eder. Bir DNA dambıl oluşturulduğunda, statik boncuk etkin ileri-geri hareket ettirildiği tuzak kordonun hareketini takip başlar.
- Tampon kanala hızlı hareket ve tampon akışını kapatın. Tek bir DNA molekülünün varlığını doğrulamak üzere bir kuvvet-uzama eğrisi analizi 4,23-25 gerçekleştirin. Birden fazla molekülün mevcut olmadığı takdirde, ve adım atmak dambıl 6,7 yeniden başlar (örneğin, kuvvet-uzama eğrisinin faz yükselterek entalpi, DNA kontur uzunluğundan daha kısa bir uzunlukta oluşur).
- Tek bir DNA dambıl elde edildikten sonra tekrar akışını açın ve protein kanala dumbbell taşıyın. DNA ile etiketlenmiş-LacI'daki etkileşimini izlemek için geniş alan floresan mikroskobu geçin. Akışını kapatın ve satın alma başlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı bir deneyde, tek bir (veya daha fazla) etiketli proteinler, DNA molekülü (Şekil 3A) boyunca / Unbinding ve / veya difüzyon bağlama monodimensional tabi tutulur. DNA molekülü boyunca protein lokalizasyonu DNA dizisinin bir fonksiyonu olarak kinetik parametrelerin ölçümü sağlar. 1D difüzyon neden tampon koşulları uygulandığında, bu difüzyon katsayısı D 1D örneğin protein yörüngeleri takip ve tespit etmek mümkündür.
Tek bir nokta hassas pozisyon, her karede, bir daha hızlı, son yayınlanan algoritması ile, büyük bir veri seti tutarken (alternatif, Radyal'ı bir iki boyutlu Gauss fonksiyonu ile Noktası yayılma fonksiyonu (PSF) uydurma veya belirlenebilir Simetri Merkezi, RSC) 26,27. İkinci yöntem, Gauss montaj tipik olarak karşılaştırılabilir bir hassasiyet elde lokalizasyon, görüntünün maksimum radyal simetri noktasını belirler. Boinci durumlarda, izleme serbestçe 27 ulaşılabilir MATLAB rutinleri ile elde edilebilir.
Şekil 3A, DNA molekülünün merkezinde yer alan başka bir molekülün spesifik olarak Lacl bir operatör bağlıyken, tek bir molekül, Lacl spesifik olmayan DNA dizileri boyunca diffüzyonu Tipik bir deneyde, bir kymogram göstermektedir. Şekil 3B, iki konumunu göstermektedir LacI molekülleri, zamanın bir fonksiyonu olarak, her iki trans (x) 'nin orta noktası bağlantı doğrultusu boyunca (RSC kullanılarak elde edilmiştir). DNA molekülü boyunca difüzyon molekülün pozisyondan, aşağıdaki eşitliğe uygun olarak farklı zaman aralıklarında ortalama kare Hacmi (MSD), hesaplanan analiz:
(1)
N'dir, konumların toplam sayısı ölçülür ve n ölçüm göstergesi olacak f N rom 1. Saf tek boyutlu difüzyon Brown durumunda, MSD ile doğru orantılıdır n, Dt iki difüzyon katsayısına eşit bir eğimi olan, (Dt birbirini takip eden iki çerçeve, deneylerde 100 milisaniye arasındaki zaman aralığıdır) (MSD (N, N) = 2D 1 nΔt). 4 DNA boyunca difüzyon molekülü için MSD nΔt vs grafiğini göstermektedir. Proteinin difüzyon katsayısı kolayca MSD nΔt karşı grafiğinin doğrusal bir uyum elde edilebilir. Bu kadar n artar, Denk MSD hesaplamak için puan sayısını not edin. 1 dolayısıyla azalır. MSD değerlendirilmesinde hata Böylece n ile artar. Bu nedenle, n = N / 4 'analizimizi sınırlamak seçtik. Bu yine birçok laboratuvar tarafından kullanılan N / 10 ile karşılaştırıldığında, oldukça büyük bir değerdir.
tp_upload / 51446 / 51446fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Halojen lamba (H), kondansatör (C), numune (S), piezo çevirmenler (xy ve z), nesnel (O), düşük büyütme kamera (CCD 200X) ve yüksek: Şekil 1. deney düzeneği oluşur -magnification kamera (BS 50:50 ışın bölücü küp) nm-istikrar geribildirim için kullanılır (CCD 2,000X). Çift optik cımbız yerleştirilen ve çift aynalar (D2 ve D3) ve üzerinden mikroskop optik eksen ayıklanır Nd: ihtiva ışın ayırıcı küpleri (PBS), acousto-optik deflektörlerini (ATH), 1.064 nm interferansiyel filtreleri (F1 ve F2) kutuplaştırıcı, / 2 dalga düzlemlerinin, YAG lazer (1.064 nm), optik izolatör (OI) λ, kadran dedektörü fotodiyotları (QDP). QDPs gelen sinyalleri bir analog-dijital dönüştürücü (ADC) aracılığıyla edinilen ve bir FPGA ile irdelenmiştir. İki ısmarlama doğrudan dijital synthesizer'ların (DDS) kapanlar 'konumunu kontrol etmek AODs sürdü. Bir dijital giriş-çıkış kartı (DIO) kontrollüsırasıyla, bir kompresöre (0,5 atm) ve ortam basıncında (0 atm) bağlı iki solenoid valf (V1 ve V2) bir açıklığı göstermektedir. Bir Labview yazılımı bir basınç ölçer (PM) aracılığıyla basınç rezervuar (C1) içindeki basıncı izlenir ve otomatik olarak istenilen basınç seviyesine ulaşmak için iki vana birini açtı. Floresan uyarım bir çoğaltılamaz Nd tarafından sağlanan: YAG lazer (532 nm) ve bir elektron yansıtılan görüntü kamera (EMCCD) çarpılır. M hareketli bir ayna, F3 bir emisyon filtresi. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. (A) akış sistemi şeması. Basınç kontrol sistemi V1 ve V2 bağlamak bir basınç ölçer (PM) ve iki selenoid vana tarafından oluşur0,5 atm (PRS), ve sırasıyla çevre basıncı (ATM), bir kompresör ed. X1 ve X2, 3-yollu konektörlerini temsil etmektedir. Valf açıklığı ince 4 tampon kaplarla basınç deposu C1 istenen basıncına ulaşmak için ayarlanır. Her bir giriş borusu kanallı akış odasının girişinde açma / kapama valfi bir bağımsız içerir. Çıkış borusu, ortam basıncında yerleştirilen atık kabı C2 bağlanır. Çizimler ölçekli değildir. (B) kanallı akış odasının şematik. Dört Laminer akımlar ayrı ayrı işlevselleşmiş polistiren boncuklar, DNA moleküllerini, görüntüleme tampon ve etiketli proteinlerin transloke. İki çift boncuk optik cımbız ile yakalanır ve bir DNA aralarında tutma izin vermek üzere DNA kanala taşınır. Bir DNA kuvvet-uzama analizi, sadece daha sonra, DNA, protein kanal inkübe edilir, tek bir DNA molekülünün varlığını doğrulamak üzere tampon kanal icra edilmektedir. Içerlek bir MAGNI gösterirson moleküler yapının Zehirsizleştirilmesi, tampon kanal tek-molekül görüntüleme için hazır. Çizimler ölçekli değildir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Uzatılmış bir DNA molekülü ile etkileşim tek Lacl moleküllerin Şekil 3. lokalizasyonu (A). Kymogram dikey ekseni, yatay eksen zamanı (100 milisaniye elde etme süresi) ise, DNA molekülü paralel x koordinatına. (B temsil eder LacI-zaman molekül) X konumu. Moleküllerin konumu RSC tarafından belirlenmiştir. Görüntüler 100 milisaniye pozlama süresi ve 1.25 x 10 -2 W cm satın alındı -2 excilama lazer yoğunluğu. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil gerilen bir DNA molekülü boyunca difüzyon tek bir Laci molekülün zaman vs MSD 4. Arsa. MSD Şekil 3B (kırmızı) temsil pozisyon kaydı hesaplanır. Şekilde gösterilen verilerin lineer regresyon analiziyle elde difüzyon katsayısı D 1D, 0.030 ± 0.002 mikron 2 sn-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son on yılda, tek bir molekül manipülasyon ve görüntüleme teknikleri mekansal ve zamansal çözünürlük açısından büyük bir ilerleme gördük. Manipülasyon ve görüntüleme teknikleri kombinasyonu artık örneğin DNA, RNA ya da hücre iskeleti lifleri gibi tek bir canlı polimerin mekanik koşulların kontrolünü sağlayan güçlü araçlar tabanı ve aynı polimer ile etkileşen proteinlerin tek devamlı yer olduğunu . Tuzak polimerin mekanik koşullarını kontrol özellikle tercih edilir. Aslında, canlı hücreler içinde, nükleik asitler sürekli enzimler ve proteinler etkileşim kaynaklanan mekanik stres geçiyor; Benzer şekilde, etkileşim protein ve moleküler motorlar karmaşık bir ağ sitosköletal lifler üzerinde gerginlik modüle. Öte yandan, olasılık tespit etmek ve tam nükleik asitlerle etkileşen proteinleri yerleştirmek üzere, kendi po bir fonksiyonu olarak moleküler etkileşimlerin ölçümüne izin verirDNA ya da RNA dizisi boyunca olduğunda Pozisyon.
Tek-molekül manipülasyon ve görüntüleme tekniklerini birleştiren deneysel kurulum ve biyolojik yapıları dikkatli bir tasarım gerektirmektedir. Optik tuzakları askıya polimerin nm düzeyinde istikrarın sağlanması, istikrarlı bir destek sağlaması gerekir. Bu tür bir denge, mekanik gürültü Farklı kaynaklardan Deney düzeneğinin dikkat izolasyon yoluyla ve lazer işaretleme ve genlik dalgalanmaları en aza indirerek ulaşılabilir. Optik tuzakları hassas (alt-nm) hareketleri DDSS tarafından tahrik AODs kullanılarak elde edilir. Burada, optimize ve nm düzeyinde optik cımbız 'istikrarı kontrol etmek için bir adım-adım protokolü resimli.
Bir EMCCD kameraya bağlanmış basit geniş bir alan epi-floresan mikroskobu süspanse polimerle etkileşim tek kromoforları lokalize etmek için kullanılır. Bizim deneysel tahlil, bir hacimsel olarak ayrılması bahsi sağlanması amacıyla uzun, DNA ya da RNA molekülleri (≥6 kbp) ile sınırlıdıryakalama lazer ışını ve floresan prob kavuştu. Kromofor uyarılmış duruma 16 iken Aslında, görünür uyarım lazer ile yakın kızıl ötesi lazer yakalama üst üste binmesi nedeniyle yakın kızıl ötesi ışığın emilmesine kromoforların gelişmiş ışıkla ağartma sebep olur. Dumbbell düzeneği daha ayrıntılı bir açıklama bir mesafede olan çok kanallı bir akış hücresi kullanılarak elde edilen başka bir zor bir işlemdir. Biz tampon akışını ve nasıl aksi ciddiye deneyler tehlikeye düşürebilecek hava kabarcıklarını önlemek için nasıl optimize edileceğini belirtti. Protein etiketleme için streptavidin kaplı boncuklar kullanılarak dambıl montaj için gerekli olan biotin, ve protokoller ile DNA ekstremitelerde etiketlenmesi için protokolleri nitelendirdi. Son olarak, gerilmiş bir DNA molekülü üzerinde tek bir laktoz baskılayıcı molekülün bağlanması ve difüzyon miktarı edildiği deneyler gerçekleştirmek için adım adım işlemleri göstermiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz numune hazırlama ile yardım için Mikroakiskan ve Alessia Tempestini yardım için Gijs wuite, Erwin JG Peterman, ve Peter Gross teşekkür ederiz. Bu araştırma n 284.464 ° ve Ricerca 2013 RBFR13V4M2 Eğitim, Üniversite ve Araştırma FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro için İtalyan Bakanlığı ve çerçevesinde hibe sözleşmesi kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7 / 2007-2013) tarafından finanse edildi Flagship Proje Nanomax.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies |
| Optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | |
| Nd:YAG laser, 1,064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | |
| Acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | ||
| Quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | |
| Electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | |
| Silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | |
| Pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapor (No 1272/2008) |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) |
| Heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120 °C |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | |
| Polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | |
| Home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | |||
| Luer lock-tip syringes 2.5 ml | Terumo | SS 02LZ1 | |
| Shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | |
| Flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | |
| Fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | |
| Two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | |
| Pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | |
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption. Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | |
| Streptavidin-coated polystyrene beads 1.87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 |
References
- Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
- Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
- Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
- Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
- Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
- van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).
- Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
- Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
- Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
- Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
- van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
- Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
- Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).
