Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.
The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.
Tek molekül (SM) teknikleri büyük ölçüde geleneksel, toplu çözüm ölçümler 1-3 bazı sınırlamaları aşmanın ihtiyaca cevap verecek son otuz yılda geliştirdik. Tek bir biyolojik moleküllerin manipülasyon Biyopolimerlerin 4 mekanik özelliklerini ölçmek ve protein-protein 5 ve protein-DNA etkileşimleri 6,7 mekanik parametrelerini kontrol etme fırsatı yaratmıştır. SM floresans saptama, diğer taraftan, lokalize ve nanometre hassasiyetle tek mölekülleri izleme olasılığına yol açan, in vitro ve in vivo olarak protein aktivitesini incelemek için son derece çok yönlü bir araç temsil eder. SM görüntü enstrüman nokta-yayılma-fonksiyonu takılması sayesinde, aslında, bir hassas sinyal-gürültü oranı (SNR) esas olarak ve yaklaşık bir nanometre 8,9 sınırı ulaşan lokalizasyon gerçekleştirebilirsiniz. Bu metodolojiler güçlü buluyorummotor proteinlerinin aktif halde dinamikleri çalışma uygulamaları yanı sıra, DNA-bağlama proteinleri hedef arama altında yatan difüzyon prosesleri. Hedef bir DNA dizisinin bir fonksiyonu bekleme süresi olarak difüzyon katsayılarının hesaplanmasına ve doğru bir tek boyutlu difüzyon olaylar sırasında incelenmiş DNA uzunluk ölçme özelliği, bir protein-DNA etkileşim dinamikleri çalışma ve araştırma için güçlü bir araç temsil eder Belirli hedef arama mekanizmaları.
Son zamanlarda, bu iki tekniğin bir kombinasyonu, örneğin (örneğin bir tel ya da aktin bir DNA molekülü) bir karşılıklı etkileşim eşinin enzimin ve bulma / lokalizasyonu biyolojik bir alt-tabakanın aynı anda işleme ortamı deney düzeneğinde, 10-14 yeni nesil (üretti miyozin ya da bir DNA-bağlama proteini). Bu tekniklerin avantajları başta böylece ena, tuzağa polimer üzerinde mekanik kontrol uygulamakla olasılığı dinlenmekuvvetleri veya momentleri karşı etkileşim dinamikleri çalışma bling. Ayrıca bu yöntem, klasik yöntemler SM, yani bir yüzey üzerinde çalışılan moleküllerin immobilizasyonu için ihtiyacı (cam slayt, ya da mikro-) ana sınırlamalarının kaçınarak yüzeyden uzak biyokimyasal reaksiyonları ölçülmesine imkan verir.
İki tekli moleküller tekniklerin kombinasyonu özellikle mekanik stabilite ve 15 (özellikle nm hassasiyet ile yerelleştirme gerektiren) yeterli SNR şartlarından doğan, çeşitli teknik zorlukların üstesinden gerektirir. Optik cımbız, gürültü azaltma ile SM floresens bağlanması ve bindirme kızılötesi lazer 16 ve biyolojik komplekslerinin düzeneği ve deneysel ölçümler 11 yapılması için biyokimyasal tamponların denetimi ışıkla Özellikle zaman, büyük önem taşımaktadır. İşte, başarılı performans için yöntemleri tarifBir çift hapsi / SM Floresans yerelleştirme kurulum ölçümleri. Metodoloji, spesifik LacI bağlayıcı dizileri (yani, operatörler) ihtiva eden laktoz represör proteini (Lacl) floresan (Atto532) ile etiketlenmiş ve (iki optik cımbız arasında sıkışan) bir DNA molekülüne bağlanan olarak algılanan bir örnekle gösterilmiştir. Bu hedef arama işleminin kontum boyunca DNA ve difüzyona LacI bağlayıcı tespit yönteminin etkinliğini göstermektedir. Bu yöntem, DNA dizisi, DNA bağlama proteini, herhangi bir kombinasyonu gibi başka sistemler (mikrotübüllerin veya aktin filamentler ve onlarla etkileşim motor proteinlerinin) için de geçerlidir.
Son on yılda, tek bir molekül manipülasyon ve görüntüleme teknikleri mekansal ve zamansal çözünürlük açısından büyük bir ilerleme gördük. Manipülasyon ve görüntüleme teknikleri kombinasyonu artık örneğin DNA, RNA ya da hücre iskeleti lifleri gibi tek bir canlı polimerin mekanik koşulların kontrolünü sağlayan güçlü araçlar tabanı ve aynı polimer ile etkileşen proteinlerin tek devamlı yer olduğunu . Tuzak polimerin mekanik koşullarını kontrol özellikle tercih edilir. Aslında, …
The authors have nothing to disclose.
Biz numune hazırlama ile yardım için Mikroakiskan ve Alessia Tempestini yardım için Gijs wuite, Erwin JG Peterman, ve Peter Gross teşekkür ederiz. Bu araştırma n 284.464 ° ve Ricerca 2013 RBFR13V4M2 Eğitim, Üniversite ve Araştırma FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro için İtalyan Bakanlığı ve çerçevesinde hibe sözleşmesi kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7 / 2007-2013) tarafından finanse edildi Flagship Proje Nanomax.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | Web Address |
elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies | http://www.newport.com |
optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | http://www.ofr.com | |
Nd:YAG laser, 1064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | http://www.newport.com/ | |
acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | http://www.aaoptoelectronic.com/ | |
Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | http://www.analog.com/ | ||
quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | http://www.osioptoelectronics.com | |
DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | http://www.ni.com | |
Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | http://www.schott.com | |
Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | http://www.olympus-global.com/en/ | |
Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | http://www.nikoninstruments.com | |
532 nm laser | Coherent | Sapphire | http://www.coherent.com | |
CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | http://www.hamamatsu.com | |
electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | http://www.hamamatsu.com/ | |
piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | http://www.physikinstrumente.com/ | |
Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | http://www.chroma.com | |
silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | http://www.bangslabs.com/ | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapour (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120° C | http://www.mpminstruments.com |
NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | http://www.upchurch.com/ | |
polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | http://www.upchurch.com/ | |
home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | ||||
luer lock-tip syringes 2.5 mL | Terumo | SS 02LZ1 | http://www.terumomedical.com | |
shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | http://www.upchurch.com/ | |
flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | http://www.upchurch.com/ | |
fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | http://www.upchurch.com/ | |
two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | http://www.clippard.com | |
pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | ||
biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | http://www.lifetechnologies.com/ | |
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | http://www.thermoscientificbio.com/ | |
ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption., Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | http://www.merckmillipore.it/ | |
streptavidin-coated polystyrene beads 1,87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 | http://www.spherotech.com/ |