Heterotope Mucosal-Transplantationsverfahren für Direkt Drug Delivery zum Gehirn bei Mäusen

Summary

Ein Maus-Modell der menschlichen endoskopische Schädelbasis Wiederaufbau entwickelt worden, das eine halbdurchlässige Schnittstelle zwischen Gehirn und Nase mit Nasenschleimhauttransplantate schafft. Dieses Verfahren ermöglicht es den Forschern, die Lieferung an das zentrale Nervensystem von hohem Molekulargewicht Therapeutika, die sonst durch die Blut-Hirn-Schranke ausgeschlossen sind, wenn sie systemisch verabreicht zu studieren.

Abstract

Abgabe von Therapeutika in das Gehirn durch die Gegenwart von Blut-Hirn-Schranke (BBB), die den Durchtritt von polaren und hochmolekulare Verbindungen aus dem Blut und in Hirngewebe beschränkt behindert. Einige direkte Lieferung Erfolg bei den Menschen wurde durch Implantation von Kathetern transkranielle erreicht worden; jedoch ist dieses Verfahren hochinvasiv und mit zahlreichen Komplikationen verbunden. Eine weniger invasive Alternative wäre das Gehirn durch eine chirurgisch implantiert, semipermeable Membran, wie die Nasenschleimhaut, die verwendet wird, um Defekte zu reparieren Schädelbasis folgende endoskopische transnasale Tumorentfernung Operation beim Menschen zu dosieren. Arzneimittelübertragungs wenn diese Membran würde effektiv umgehen die BBB und diffundieren direkt in das Gehirn und in der cerebrospinalen Flüssigkeit. Inspiriert von diesem Ansatz wurde ein chirurgischer Ansatz bei Mäusen entwickelt, die ein Spender Septum-Schleimhaut über eine extrakranielle chirurgischen BBB Defekt eingepflanzt verwendet. Dieses Modell hat sich gezeigt, effektivden Durchgang von hochmolekularen Verbindungen in das Gehirn. Da zahlreiche Wirkstoff-Kandidaten nicht in der Lage über den BBB sind, ist dieses Modell für die Durchführung wertvolle präklinische Prüfung von neuen Therapien für neurologische und psychiatrische Erkrankungen.

Introduction

Die Behandlung von neurologischen und psychiatrischen Krankheiten ist durch das Vorhandensein der Blut-Hirn-Schranke (BBB), die mehr als 95% aller potentiellen pharmazeutischen Wirkstoffen vom Erreichen des zentralen Nervensystems verhindert ^1-3 behindert. Beispielsweise Gliazellen stammenden neurotrophen Faktor (GDNF) gezeigt wurde, wirksam bei der Behandlung der Parkinson-Krankheit, wenn sie direkt in das Gehirn injiziert wird, ist jedoch unwirksam, wenn sie systemisch zugeführt, weil es die BBB ^4-6 nicht durchdringen kann.

Zahlreiche fahren wurden entwickelt, um zu versuchen, dieses Problem zu umgehen. Verbesserung der systemischen Verabreichung von neurotheraputics wurde durch die Verwendung Wirkstoff-Konjugate Antikörper selektiv für Transportproteine ​​auf das Gehirn Kapillarendothels befindet haltigen nachgewiesen worden; aber diese Methode ist nicht gezeigt worden anwendbar für eine breite Palette von Arzneimitteln ^7,8 sein. Zusätzlich osmotische Öffnung der BHS ist verwendet worden, KlinikVerbündeter, aber diese Verfahren leidet systemische Medikamentendosierung im Gegensatz zu einer direkten Lieferung an den Hirnregion von Interesse ^9. Große Sorgfalt wurde in die Optimierung transnasalen Lieferung in der Hoffnung, sich direkt auf das Gehirn ^{10 bis 12} gesetzt. Obgleich ein gewisser Erfolg erzielt worden ist, sind aussagekräftige Ergebnisse nur für Medikamente, die endogene Rezeptoren wie Insulin ^13,14 aufweisen, erhalten wurde. Außerdem ist der Mechanismus der transnasalen Lieferung ist umstritten, Anhaltspunkte dafür, mit indirekter Einführung in das Gehirn über olfaktorische Neuron-Aufnahme oder über die Blutbahn ^11. Direkte Zustellung mit transcranial implantierbaren Kathetern erreicht wurde, jedoch ist dieses Verfahren hochinvasiv und mit zahlreichen Komplikationen ^15,16 verbunden. Bis heute gibt es keine allgemeine, minimal invasiven Verfahren zu hochmolekularen Verbindungen in das Gehirn zu liefern.

Hierin präsentierten ein muriner chirurgische Verfahrendas erzeugt eine halbdurchlässige Grenzfläche mit dem Gehirn. Dies wird durch eine Schleimhaut-Transplantations Explantat ¹⁷ über eine chirurgische Schädeldefekt in einer Maus durchgeführt. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde gezeigt, daß lösliche Verbindungen bis zu 500 kDa in das zentrale Nervensystem (direkt in Gehirnparenchym als auch in Liquor) sowohl in einer Zeit und einem Molekulargewicht abhängigen Weise ¹⁸ geliefert werden. Diese Methode der Umgehung des BBB ist ein Modell für Schädelbasisdefekt Reparaturen in den Menschen, die gefäßSchleimhautTransplantationen verwendet, um Löcher in den Schädel zu reparieren folgenden transnasalen endoskopische Chirurgie ^19,20.

Protocol

Vor der Operation sicherzustellen, dass alle Verfahren, die getan werden durch IACUC und alle zusätzlichen ethischen oder rechtlichen Behörden und benutzen humane Tierbehandlungspraktiken. Dies schließt mit sterilen Operationsbedingungen, betäuben die Maus mit IACUC zugelassenen Methode, Schmier Mäuse Augen mit Salbe Tierarzt während der Operation und die Bereitstellung postoperativen Versorgung. Sie nicht mit der Operation fortzufahren, wenn es irgendeine Frage, ob Aspekte des Verfahrens werden genehmigt. Alle Verfahren durchgeführt, hier wurden von der Boston University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Vorbereitung der Tiere und Surgical Supplies

1. Autoklav alle chirurgischen Instruments, die während der Operation verwendet wird.
2. Sicherstellen, daß alle Techniken, die durchgeführt werden sollen, werden von den Zulassungsbehörden zugelassenen Tier.

2. Ernten der Schleimhauttransplantat

1. Wählen Sie einen genetisch identischen Maus von ähnlichen Alter wiedie experimentelle Maus und einschläfern es in einer IACUC zugelassenen Methode (hier: Isofluran Ersticken durch Genickbruch folgte).
2. Mit chirurgische Scheren, entfernen Sie die Haut um die Nasenregion von Maus-Kopf Aussetzen des Schädels.
3. Mit einem Presslufthammer, Filter mit drei Leitungen, von denen zwei seitlich flankieren den Nasenbereich und eine dritte im Einklang mit den Augen, die senkrecht die beiden Leitungen verbindet.
4. Drill-down ventral um die Nasenscheidewand aus dem umgebenden Gewebe zu trennen. Ein breiterer Weg wird eine Beschädigung der Schleimhaut zu verhindern, jedoch wird es auch erschwert, um die Membran zu isolieren. Ein schmaler Schnitt näher an der Mittellinie wird empfohlen.
5. Mit einer Schere, um das Septum frei von Gewebe, um es halten schneiden und speichern sie in einer sterilen Kochsalzlösung. Zu diesem Zeitpunkt kann das Transplantat bis gereinigt werden, um angeschlossene Gewebe zu entfernen. Die ideale Situation besteht darin, dass unbeschädigte Schleimhautmembranen auf beiden Seiten des Knorpels Septum ausgesetzt. Ein grachtern Membran kann für zwei Mäuse zuzuführen die Oberfläche der Membran ausreichend ist, um die Kraniotomie Gebiete umfassen. Es wird empfohlen, dass das Implantat so schnell wie möglich verwendet und die Forscher geht, sobald das Transplantat isoliert Schritt 3 fort.

3. Chirurgische Implantation von Schleimhauttransplantat

1. Mit Standard-, aseptische murinen chirurgischen Verfahren, betäuben und montieren eine Maus in der stereo Rahmen. Verwenden Sie etwa 2% Isofluran in reinem Sauerstoff mit einem Nagetier Anästhesiegerät.
2. Immobilisieren die Maus in einem stereotaktischen Apparat mit Ohr Bars und ein Nasenhalter. Bewerben Augensalbe auf die Augen und reiben Sie die Kopfhaut mit betadine und 75% Ethanol für drei Runden. Entweder mit einer Schere oder einem Haarschneider, entfernen Sie das Fell auf dem Kopf. Expose den Schädel mit einer Rasierklinge und ebnen den Kopf. Führen Sie eine Kraniotomie oberhalb der Stelle des Gehirns, die dosiert werden. Zum Beispiel, wenn gezielt den Striatum schnitt ein 1,25 mmDurchmesser kreisrundes Loch in den Schädel (bei AP zentriert: 1.00 mm, ML: 0,88 mm) mit einem Presslufthammer. Befeuchten Sie die gebohrt Bereich mit steriler Kochsalzlösung und mit einer Rasierklinge, um den Schädel zu entfernen.
3. Entfernen Sie vorsichtig die Dura mit der Spitze einer Nadel. Darüber hinaus kann dies durch Auftragen einer minimalen Menge an Gewebekleber auf das feuchte duralen Oberfläche erzielt werden. Sobald diese Schicht ausgehärtet ist, kann eine seitliche Bewegung mit einer Rasierklinge Spitze verwendet werden, um die Membran zu entfernen.
4. Legen Sie die Schleimhaut über der Hirnoberfläche unter äußerster Vorsicht, um die Seite zu halten Epithel abgewandten aus der Wunde. Dies wird am besten durch die Übertragung der gesamten Scheidewand an der Oberfläche des Schädels benachbart zu der Kraniotomie Seite mit einer Pinzette durchgeführt. Mit der Spitze eines chirurgische Schere, ziehen die Membran aus der Knorpel und auf den Schädel und Hirnoberfläche. Lassen Sie sich nicht die Membran austrocknen oder berühren sie mit jedem Material aufnehmen. Das Transplantat sollte großzügig überlappen alle knöchernen Rändern der Schädel site.
5. Decken Sie das Transplantat mit einer sterilen Stück Nitril. Dies dient dazu, die Haftung der Haut während der Heilung des Transplantats zu verhindern. Das Nitril muss groß genug sein, um die gesamte Schleimhaut abzudecken. Trim übermäßige Membran, wenn nötig. Vermeiden Bewegung des Nitrils, sobald es in Kontakt mit dem Transplantat zu kommen.
6. Schließen Sie die Haut mit einer Lauf 5-0 steriles Naht und lassen Sie die Maus wieder für 3-7 Tage, bevor Sie zum nächsten Schritt. Achten Sie darauf, die Nitril-Schranke oder die Schleimhaut-Transplantat bei Hautverschluss stören.

4. Administration of Dosing Lösung

1. Nach dem Befestigen des narkotisierten Maus in der stereotaktischen Rahmen, schneiden Sie den Faden mit Schere und entfernen überschüssige Haut um den Schädel.
2. Entfernen Sie die Nitril-Schranke und reinigen Sie die Oberfläche des Schädels. Verwenden steriler Kochsalzlösung und Wattestäbchen zu reinigen Sie den Bereich, bis das Transplantat sichtbar ist. Es kann notwendig sein, um das Transplantat mit einer Rasierklinge geschnitten hat, wenn größer als der d gewachsenesired Oberfläche.
3. Wenn das Experiment länger als ein paar Tage zu sein, ist es ratsam, mindestens zwei Schrauben Schädel implantieren, um den Kopf Implantat zu verstärken.
4. Zeigen die weit über dem Transplantat so dass die Kanten in Kontakt mit dem Schädel. Gelten Cyanacrylat-Klebstoff an der Verbindungsstelle zwischen der Wanne und dem Schädel. Füllen Sie die gut mit steriler Kochsalzlösung und stellen Sie sicher, dass keine Leckagen. Wells von Spritzennadeln Schnitt gemacht.
5. Bewerben Knochenzement auf dem Schädel, die gut zu befestigen.
6. Entfernen Sie die Kochsalzlösung aus der gut mit einer Pipette. Die mehrmals gut waschen, um zu überprüfen, dass Klebstoff nicht einge durchgesickert Fügen Sie die gewünschte Lösung; in diesem Fall 50 ul fluoreszierenden Dextran verwendet. Es wird erwartet, dass die wasserlöslichen Verbindungen von ähnlicher Polarität die gleiche wie Dextran verhalten. Lieferung von hydrophoben Verbindungen oder Suspensionen ist mit diesem Verfahren nicht untersucht worden.
7. Verschließen Sie die Oberseite der auch durch die Verwendung eines kreisförmiges Stück aus Nitril auf die gesicherttop mit Cyanacrylatklebstoff. Sicherzustellen, dass der Klebstoff nicht in Kontakt mit den Wells kommen.

5. Analyse Transmucosale Liefer

1. Nachdem die gewünschte Menge Zeit vergangen ist, betäuben die Maus und die Inhalte auch mit einer Lösung von Evans-Blau-Farbstoff auszutauschen. Dieser Farbstoff wird verwendet, um zu überprüfen, dass das Transplantat war intakt.
2. Nach 30 min, betäuben die Maus stark, entfernen Sie die Farbstofflösung und einschläfern über Enthauptung.
3. Manuelles Entfernen des Implantats und entfernen Sie das Gehirn mit chirurgischen Schere. Seien Sie vorsichtig, um das Transplantat an Ort und Stelle zu halten.
4. Einmal entfernt, Flash-einfrieren das Gehirn in einer Lösung von Isobutan gekühlt in einem Trockeneis-Bad.
5. Betten Sie das Gehirn in Optimale Schneidtemperatur (OCT)-Lösung und Scheibe bei 50 um.
6. Zeigen die gewünschten Scheiben direkt auf einem Objektträger.
7. Bild der Scheibe mit einem Fluoreszenz-Mikroskop, sobald der Oktober-Lösung getrocknet ist.

Representative Results

Erhalten einer ausreichend großen Nasenscheidewand-Explantat ist entscheidend für die weiteren Schritte. Dies kann durch Bohren an der Stelle der in Fig. 1a gezeigten Spendermaus Schädel durchgeführt werden. Schneiden entlang diesem Weg wird ein Explantat von ausreichender Größe zu erzeugen, wie in Fig. 1b gezeigt. Wenn die Bohrtiefe ist nicht tief genug ist, wird das Transplantat abgeschnitten sein, und es wird schwer sein, eine ausreichend große Membran, um die Gehirnoberfläche abdecken zu erhalten. Bohren mehr seitlich als der vorgeschlagene Weg ist nicht ratsam, da mehr Gewebe werden auf der Nasenscheidewand zu bleiben, und der nächste Schritt wird es schwieriger. Vor der Übertragung der Schleimhaut, die Oberfläche der Trennwand muss alles überschüssige Bindegewebe gereinigt werden. Sobald dies geschehen ist, sollte die Schleimhaut sichtbar auf der Oberfläche des Knorpels. Fig. 1c zeigt, wie das Gewebe sieht nach der Reinigung.

Vor der Übertragung der membrane, eine Kraniotomie und Durotomie müssen durchgeführt, um die Gehirnoberfläche freizulegen. Erst nach dem Post-Durotomie Blutung aufgehört hat kann die Membran übertragen werden. 2a zeigt, was die Operationsstelle sollte wie, bevor Sie zum nächsten Schritt zu suchen. Übertragen der Schleimhaut vom Knorpel auf der Gehirnoberfläche ist das technisch anspruchs Schritt des gesamten chirurgischen Eingriffs und sollte sorgfältig durchgeführt werden. Wenn das geerntete Septum groß genug ist, sollte die Oberfläche der Schleimhauttransplantat groß genug, um die Gehirnoberfläche abzudecken. Einmal übertragen, sollte das Operationsgebiet sieht in 2b ähnlich zu. Es ist wichtig, sicherzustellen, daß die Seite der Membran, die in Kontakt mit dem Knorpel ist die gleiche, die in Kontakt mit der Hirnoberfläche. Wenn die Membran umgedreht wird oder über sich selbst gefaltet ist, sollte sie verworfen werden, und ein anderes verwendet werden soll. Sobald dieser Schritt abgeschlossen ist, kann die Kopfhaut vernähtso dass die Maus zu erholen und das Transplantat heilen kann. Um alle nachteiligen Reaktionen des Transplantat in Kontakt mit der inneren Oberfläche der Kopfhaut zu verhindern, sollte ein Stück Schutz Nitril oben zur Operationsstelle angeordnet werden. Wie in Fig. 2c gezeigt, sollte die eingesetzte Teil groß genug ist, um die Membran zu bedecken, aber nicht groß genug, um zu verhindern Vernähen der Haut verschlossen sein.

Während der Erholungsphase, erhebliche Wachstum eines Gewebes auftritt des umgebenden Knochenhaut, die vor der Dosierung an die Membran entfernt werden muß. Nach der Wiedereröffnung der Kopfhaut, wird sterile Wattestäbchen und Kochsalzlösung müssen verwendet werden, um die Website zu reinigen, bis es ähnlich wie in 3a sieht werden. Wir haben nicht beobachtet keine wesentliche Immunantwort; aber das hat nicht histologisch bestätigt. Das Transplantat muss möglicherweise mit einer Rasierklinge geschnitten, wenn es über die Oberfläche des Schädels gezüchtet werden. In diesem Stadium der Brunnen, die die Dosierung Lösung enthalten wirdtion sollte über dem Transplantat implantiert werden. Mehrere Schädel Schrauben in bei diesem Schritt gesetzt werden, wenn langfristige mechanische Stabilität des Implantates ein Anliegen ist. Sicherstellen, dass die Vertiefung wird so positioniert, dass sie nicht das Transplantat berühren. Einmal vorhanden, können Cyanacrylatklebstoff angewendet werden, um es auf den Schädel kleben. Um den Kleber in Kontakt kommen mit dem Transplantat sollte auf die Oberfläche der Vertiefung aufgebracht und nach unten gedrückt, um den Spalt abzudichten verhindern. Sobald die auch sicher ist, sollte es vorübergehend mit Kochsalzlösung, um sowohl das Transplantat Hydrat befüllt und auf Dichtheit überprüfen. Das sollte auch eingehalten wie in Abbildung 3b zu schauen und die Lösung sollte klar sein, die anzeigt, dass er keinen Klebstoff enthalten. Jede undichte wird offensichtlich, weil der Flüssigkeitsstand im Brunnen sinkt. Wenn Leckagen festgestellt, die sie benötigen, um mit mehr Klebstoff fixiert werden. Die Vertiefung wird dann mit Knochenzement verstärkt. An diesem Punkt der Salzlösung in der Vertiefung kann mit einer Pipette entfernt undmit der gewünschten Dosierungslösung ersetzt. Bei der Berichterstattung über die gut mit einem Stück Nitril darauf zu achten, um sicherzustellen, dass der Kleber nicht in Kontakt mit der Lösung in der gut werden. Am Ende des gesamten Verfahrens sollte die Maus Kopf wie in Fig. 3c zu suchen. Der Knochenzement ist daher leicht durchscheinend, wenn der Inhalt des Schachtes sind lichtempfindliche, Farbstoff oder Tinte auf die Oberfläche der getrockneten Zement oder der Zementmischung zugegeben werden, um den Photoabbau und Inhalte zu verhindern.

Nach der gewünschten Zeit zu warten, sollte das Gehirn analysiert werden, um die Wirkungen der Verabreichung zu entdecken. Das Gehirn ist unterschiedlich, je nachdem, was untersucht wird behandelt werden. Wenn der Zweck des Verfahrens ist es, das Vorhandensein einer Chemikalie in die Vertiefung gegeben, (wie im Protokollabschnitt oben beschrieben) analysiert dann ist es empfehlenswert, ein Schockgefrieren des Gehirns zu tun, um die Verbindungen zu erhalten, verabreicht. Fig. 4 > Zeigt ein repräsentatives Ergebnis der Verwendung dieses Ansatzes. Dosierung mit einer 40 kDa fluoreszierenden Polymer (tetramethyrhodamine konjugiertem Dextran) für 24 Stunden zeigt merkliche Diffusion in das Hirngewebe. Unsere bisherigen Ergebnisse zeigen, mit Dextran Diffusion in das Hirngewebe ist Zeit und Molekulargewicht abhängig ^18. Kleinere Moleküle diffundieren in das Hirnparenchym in einem größeren Ausmaß als größere und eine größere Dosierung Zeit zu einer größeren Menge an Streuung für alle Molekulargewichte, die wir getestet. Wenn Flash Einfrieren geschehen ist, ist es wichtig, die Folien nach Schnitt montieren und sie zu jeder Lösung aussetzen. Jede Flüssigkeit löslich verabreichten Verbindung und diffundieren sie über die Oberfläche des Hirnschnitt. Wenn Immunhistochemie ist auf das Gehirn durchgeführt werden, dann ist es empfehlenswert, die Maus durchströmen, um das Gehirngewebe zu fixieren.

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Fig. 1 ist. Bilder der Nasenscheidewand Ernteverfahren. A) Die Lage der Bohrstelle auf dem Schädel eines eingeschläfert Maus. Die gestrichelten Linien zeigen den Umfang an. B) Die Nasenscheidewand direkt nach der chirurgischen Entfernung. C) der Nasenscheidewand nach Entfernung von überschüssigem Gewebe bohren. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 2. Chirurgische Bilder des Transplantationsprozesses. A) Die Operationsstelle nach Kraniotomie und Durotomie. Das Bild von dem, was Vertreter der Schädel sollte wie vor dem Einsetzen des Transplantats auf sie schauen ist. B) Platzierung der Schleimhaut Transplantat auf die Kraniotomie Ort. Die gepunktete Linie zeigt den Umfang des Transplantats. Das Bild zeigt den gewünschten Oberflächenbereich des Transplantats. C) Implantation der Schutzbarriere Nitril. Die Größe des Materials, wie gezeigt, ist groß genug, um das Transplantat zu decken, aber nicht groß genug, um mit Nähen stören. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 3. Chirurgische Bilder der Medikamentendosierung Prozess. A) Ein Beispiel, was die geheilt Schleimhauttransplantat sieht aus wie nach strengen Reinigung der Operationsstelle. B) Bild von gut auf den Schädel befestigt. Die Schnittstelle des Schädels und gut gesichertmit Sekundenkleber und der Brunnen ist mit steriler Kochsalzlösung gefüllt. Die stabile Lösung Pegel zeigt keine Lecks aus dem Brunnen und die Klarheit der Lösung zeigt keine Verunreinigung der Lösung mit Kleber. C) Das Bild der Chirurgie abgeschlossen. Der Brunnen enthält die Dosierungslösung und ist sicher mit einem Nitril Barriere begrenzt. Knochenzement ist in Ort, um das Implantat gut versteifen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 4. Fluoreszenzmikroskop Bild einer Maus Hirnschnitt folgenden transmucosalen Dosierung mit 40 kDa Dextran konjugiert tetramethylrhodamine für 24 Stunden. Die Scheibe wurde bei -1,06 mm Bregma mit einer Dicke von 50 aufgenommen1, m. Die Schleimhauttransplantat ist auf der Oberfläche des Gehirns sichtbar ist. Bar = 1 mm. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Discussion

Der schwierigste Schritt der hier beschriebenen Verfahren ist der erfolgreiche Transfer von einer genügend großen, Schleimhaut auf der Hirnoberfläche. Dieser Schritt wird wesentlich erleichtert, wenn die geerntet Nasenscheidewand ist groß genug und gut gereinigt. Wenn der ventralen Abschnitt der Scheidewand abgeschnitten wird, sollte eine neue Transplantat erhalten werden. Der Bohrwinkel sollte senkrecht zu der Maus Kopf sein, um sicherzustellen, dass die Schleimhautmembran nicht durch den Bohrer beschädigt wird. Wenn ein breiter als empfohlen Bohren Weg beschritten wird es viel schwieriger, das zusätzliche Gewebe, die mit dem Septum verbunden ist, zu entfernen. Jede große Stücke von Bindegewebe sollte mit scharfen Scherenschnitt, anstatt zu versuchen, sie zu verlieren ziehen entfernt werden. Kleiner Gewebestücke können durch Abschaben mit den Spitzen der Schere vorgesehen ist das Gewebe nicht an der Schleimhautmembran verbunden entfernt werden. Am Ende des Reinigungsvorgangs sollte der Knorpeloberfläche mit der Membran noch angebracht ausgesetzt werden. Occagentlich die Septumknorpels lösen kann vom Knochen, die es auf der dorsalen Kante verbunden ist. Wenn dies geschieht, ist es immer noch möglich, es in der nächsten Stufe zu verwenden ist es jedoch schwieriger aus zwei Gründen. Der Knochen ist ein bequemer Griff, um die Explantation zu halten, wenn die Reinigung und Überführen. Einmal entfernt, ist es schwieriger, die zarter Knorpelblatt manövrieren. Zweitens ist die Knorpel-Knochen-Kreuzung, wo die Schleimhaut am dicksten und am einfachsten, wenn sie aus dem Knorpel entfernen zu erhalten. Wenn der Knochen vom Knorpel getrennt dieser Teil der Membran verloren.

Sobald das Septum Transplantat wurde gereinigt und die Kraniotomie und Durotomie geführt worden sind, kann die Schleimhaut über dem freiliegenden Hirnoberfläche platziert werden. Dies wird am besten durch die Positionierung des Explantat neben dem Schädelstelle erreicht. Die Membran kann dann aus dem Knorpel gezogen werden, auf den Schädel und das Gehirn über. Viele Dinge können während dieser Verarbeitung schief gehens. Die Membran kann austrocknen, bekommen gerissen, falten auf sich selbst oder einen Haufen legen. Auch die Membran, die die andere Seite der Trennwand kann durch Reiben gegen den Schädel beschädigt werden. Es ist auch möglich, daß in dem Versuch, die nach oben weisende Schleimhautmembran zu entfernen, die Membranen von beiden Seiten zur gleichen Zeit entfernt ein. Um all diese Probleme zu verhindern, ist es von entscheidender Bedeutung, um die Membran langsam und immer bewegen, beobachten beide Seiten der Scheidewand. Die beste Strategie ist, um die Spitzen der Schere verwenden, um die Membran aus dem Knorpelblatt, bevor Sie sie abrutschen zu entfernen. Wenn ein Teil der Membran befestigt bleibt, ist es möglich, dass die Elastizität des Gewebes wird nach dem Ziehen auf sie zurückzuziehen. Durch die Verwendung von kleinen und zog Bewegungen kann die Membran von der Scheidewand gelöst werden. Nur dann wird es leicht abrutschen. Die Membran zu dünn ist, um mit Pinzetten gehandhabt werden kann; es kann nur von einer Oberfläche zur anderen gezogen werden. Wenn es umgedreht wird oder über sich selbst gefaltet, esverworfen werden sollte und eine weitere erhalten werden sollte.

Wenn das Transplantat bedeckt die gesamte Oberfläche der freiliegenden Gehirn, der Prozess erfolgreich war, und die Kopfhaut vernäht, so daß der Operationsstelle zu heilen kann. Ein Nitril-Barriere müssen geschaffen, so dass die Haut nicht in Kontakt mit der Membran kommen werden. Darauf zu achten, so dass der Druck nicht auf dem Nitril ausgeübt wird, wenn das Transplantat vernäht sonst Position zu bewegen. Achten Sie auch darauf, nicht in die Nitril vernähen. Der beste Weg, um sicherzustellen, dass das Material gehorcht ist es feucht mit Kochsalzlösung zu halten und sicherzustellen, dass es flach bleibt während des Nähens.

Sobald das Transplantat (3-7 Tage) heilte die gut mit der Dosierungslösung auf den Schädel über dem Transplantat befestigt werden. Es kann vorübergehend auf den Schädel mit Klebstoff Klebstoff mit Knochenzement fixiert werden und dauerhaft. Sobald der Knochenzement aufgetragen wird, wird es nicht möglich sein, irgendwelche Korrekturen an der Position und erhält deshalb machenre all Optimierung muss vor der Anwendung durchgeführt werden. Sobald das Bohrloch in Position geschwenkt und durch Cyanacrylat-Klebstoff gehalten wird, sollte es mit einer sterilen Kochsalzlösung gefüllt werden. Wenn die Prozedur erfolgreich getan das Flüssigkeitsniveau wird sich nicht ändern, und die Lösung wird klar sein. Wenn ein Leck vorhanden ist, wird das Niveau fallen und die Lage, wo das Wasser entkommen sichtbar sein soll. Nach dem Aufbringen mehr Klebstoff auf der Leckstelle, sollte mehr Kochsalzlösung gegeben werden, um das Leck zu überprüfen wurde verschlossen. Wenn der Klebstoff verunreinigt die gut Lösung wird eine transluzente Folie sichtbar an der Oberseite des Flüssigkeitspegels ist. Wenn dies der Fall ist und die sollte mehrmals mit Kochsalzlösung gewaschen, bis die Lösung klar ist. Zusätzlich kann ein Tupfer verwendet werden, um die Folie durch Berührung an der Oberfläche der Flüssigkeit zu entfernen. Nur wenn die Lösung ist auch stabil und klar sollte der Zement aufgetragen werden. Wenn der Zement trocken ist, kann die Kochsalzlösung aus dem Bohrloch entfernt und mit der Dosierungslösung ersetzt werden. Sorgfalt sollte getroffen werdendie Membran nicht beschädigt beim Pipettieren in und aus dem Brunnen. Nach dem Befüllen muss die Oberseite der Vertiefung mit einem Stück Nitril mit Cyanacrylatkleber verschlossen werden. Es ist wichtig, dass der Raum zwischen der Oberfläche der Lösung und der Oberseite der Vertiefung belassen. Dadurch wird sichergestellt, dass der Klebstoff nicht die Lösung berühren beim Anziehen des Nitril-Schranke.

Sobald es Zeit ist, den Effekt des Dosiervorgangs zu analysieren, muss das Gehirn entfernt und abgebildet werden. Wenn Immunhistochemie durchgeführt werden soll, können Standarddurchblutung und Antikörperfärbung durchgeführt werden. Wenn der Ort der Verbindung dosiert zu bestimmen ist, ist es empfehlenswert zu blinken gefrier das Gehirn in einem Trockeneis / Isobutan Lösung. Dadurch wird sichergestellt, dass die Lage der Verbindung in den Gehirnschnitten ist die gleiche, wie es unmittelbar vor der Euthanasie.

Das hierin beschriebene Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Arzneimittelabgabe an das Gehirn der Maus durch eine chirurgisch untersuchengepfropft semipermeable Schleimhaut ^18. Dies ist analog zu dem Ergebnis transnasale Tumorentfernung Operation beim Menschen, in der Schädelbasisdefekten mit einem vaskularisierten Nasenschleimhautmembran ^19,20 repariert. Mit Hilfe dieses Mausmodells ist es nun möglich, zu untersuchen, wie diese Schleimhauttransplantationen sind in der Lage, unter Umgehung der BBB und damit für direkte hochmolekulare Medikamentenabgabe an das Gehirn. Wir haben nun dieses Verfahren mehr als 100-mal durchgeführt. Entscheidend für dieses Verfahren ist die erfolgreiche Ernte der Nasenscheide Transplantat von einem Spender-Maus und die Übertragung der Schleimhaut aus dem Transplantat auf den Testmaus. Dieses Verfahren, das zum ersten Mal ermöglicht präklinischen Prüfung von hohem Molekulargewicht Therapeutika für eine Vielzahl von neurologischen und psychiatrischen Störungen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Taconic	C57BL/6
Isoflurane	Piramal Healthcare
Student fine scissors	Fine Science Tools	91461-11
Pneumatic drill	MTI Dental	333-CB
Drill bit
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP	Abbott Laboratories	4925
Polystyrene Petri dish	Fisher	08-757-12	for temporarily storing graft
Bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Oxygen/Isoflurane System	SurgiVet	V720100
Temperature Control System	Physitemp	TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument	KOPF	Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators	Fisher	23-400-106
7.5% Providone iodine			Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless	Feather	2976#10
Scalpel handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
3% Hydogen peroxide			for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Needles	Becton, Dickinson and Company	305176	needle tip cut off and used as well
Syringes	Becton, Dickinson and Company	309597
Nitrile gloves	Denville Scientific Inc	G4162	for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder	Fine Science Tools	91201-13
Cyanoacrylate adhesive			commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque	Stoelting	51458
Isobutane (2-methylbutane)	Aldrich	M32631	for dry ice bath
Dry ice