Summary
מודל עכבר של שיקום בסיס גולגולת אנדוסקופית האנושי פותח שיוצר ממשק semipermeable בין המוח והאף באמצעות שתלי רירית האף. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד מסירה למערכת העצבים המרכזית של הרפוי משקל מולקולרי גבוהה שאינם נכללים אחרת על ידי מחסום דם המוח, כאשר באופן מערכתי.
Abstract
משלוח של תרופות לתוך המוח היא הקשתה על ידי הנוכחות של מחסום דם המוח (BBB) המגביל את המעבר של תרכובות במשקל מולקולריות קוטביות וגבוהות ממחזור הדם ולתוך רקמת המוח. הצלחה מסוימת משלוח ישירה בבני האדם הושגה באמצעות השתלה של צנתרים transcranial; עם זאת שיטה זו היא פולשני מאוד וקשור לסיבוכים רבים. אלטרנטיבה פחות פולשנית תהיה מינון המוח דרך קרום מושתל בניתוח, semipermeable כגון רירית האף המשמש לתיקון פגמים בסיס גולגולת לאחר ניתוח אנדוסקופי transnasal גידול ההסרה בבני אדם. העברת תרופות אם כי קרום זה הייתי בצורה יעילה לעקוף את BBB ולפזר ישירות לתוך המוח ונוזל השדרה. בהשראת גישה זו, גישה ניתוחית בעכברים פותחה המשתמשת בקרום הרירי במחיצה בין תורם engrafted על פגם BBB כירורגית extracranial. מודל זה הוכח ביעילותלאפשר המעבר של תרכובות במשקל מולקולריות גבוהות לתוך המוח. מאז לתרופות רבות אינן מסוגלות לחצות את BBB, מודל זה הוא בעל ערך לביצוע בדיקה קליני של טיפולים חדשניים למחלות נוירולוגיות ופסיכיאטריות.
Introduction
הטיפול במחל נוירולוגיות ופסיכיאטריות מתעכבת קשות על ידי הנוכחות של מחסום דם המוח (BBB) המונע על 95% מכלל סוכני התרופות הפוטנציאליים מלהגיע למערכת העצבים המרכזית 1-3. לדוגמא, גליה נגזר neurotrophic פקטור (GDNF) הוכח כיעיל בטיפול במחלת פרקינסון כאשר הוא מוזרק ישירות לתוך המוח, עם זאת הוא לא יעיל כאשר נמסרו מערכתי, כי זה לא יכול לחדור 4-6 BBB.
רב פנו פותחו כדי לנסות לעקוף את הבעיה הזו. שיפור במשלוח מערכתי של neurotheraputics הודגם באמצעות conjugates תרופה המכיל נוגדנים סלקטיבית לחלבוני תחבורה ממוקמים על האנדותל נימים במוח; עם זאת שיטה זו לא הוכח כישימה למגוון רחב של תרופות 7,8. בנוסף, פתיחה האוסמוטי של BBB נעשתה שימוש במרפאתברית, אולם בשיטה זו סובלת ממינון תרופה מערכתי בניגוד למשלוח ישיר יותר לאזור במוח של עניין 9. מאמץ ניכר כבר הכניס לתוך ייעול משלוח transnasal בתקווה ישירות מיקוד המוח 10-12. למרות הצלחה מסוימת הושגה, תוצאות חד משמעיות שרק התקבלו לתרופות שיש להם קולטנים אנדוגני, כגון 13,14 אינסולין. יתר על כן המנגנון של משלוח transnasal היה שנוי במחלוקת עם ראיות המצביעות על כניסה עקיפה אל המוח דרך עצב ספיגת ריח או באמצעות 11 זרם הדם. משלוח ישיר, transcranial באמצעות צנתרים מושתלים הושג, עם זאת הליך זה הוא פולשני מאוד וקשור עם מספר רב של סיבוכי 15,16. נכון להיום, לא קיימת שיטה כללית, פולשנית כדי לספק תרכובות במשקל מולקולריות גבוהות לתוך המוח.
המוצג כאן הוא הליך כירורגי עכברישיוצר ממשק semipermeable עם המוח. המטרה זו מושגת על ידי engrafting explant קרום הרירי 17 על פגם craniotomy כירורגית בעכבר. באמצעות הליך זה זה כבר הראה כי תרכובות מסיסים עד 500 kDa יכולות להיות מועברות למערכת העצבים המרכזית (ישירות לתוך parenchyma המוח, כמו גם לנוזל השדרה) בשני זמן ואופנה תלויה במשקל מולקולרי 18. שיטה זו של עקיפת BBB היא מודל לתיקוני פגם בסיס גולגולת בבני אדם אשר עושה שימוש בשתלים ברירית vascularized כדי לתקן חורים בגולגולת בעקבות ניתוח אנדוסקופי transnasal 19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
לפני הניתוח לוודא שכל הנהלים להיעשות מאושרים על ידי IACUC וכל רשויות אתיות או משפטיות נוספות ולהשתמש בשיטות טיפול בבעלי החיים אנושיות. זה כולל שימוש בתנאים סטריליים ניתוח, הרדמת העכבר באמצעות IACUC אישר שיטה, סיכה עיני עכברים עם משחה וטרינר במהלך ניתוח, ומתן טיפול לאחר ניתוח. לא להמשיך עם ניתוח אם יש כל שאלה אם היבטים של הליך אישורם. כל ההליכים שבוצעו במסמך זה אושרו על ידי ועדת אוניברסיטה מוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש בבוסטון.
1. הכנת בעלי חיים וציוד כירורגי
- החיטוי כל כלי הניתוח שישמשו במהלך הניתוח.
- ודא שכל הטכניקות שאינן להתבצע מאושרות על ידי הרשויות רגולטוריות בבעלי החיים.
2. קציר של השתל הרירי
- בחר עכבר זהה מבחינה גנטית בגיל דומה כמוהעכבר הניסיוני ולהרדים אותו בשיטה שאושרה IACUC (כאן: מחנק isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם).
- בעזרת מספריים כירורגית, להסיר את העור מסביב לאזור האף של ראש העכבר לחשוף את הגולגולת.
- עם מקדחה, סימן פנאומטי עם שלוש שורות שניים מהם רוחבי לאגף את אזור האף ושלישי בקו אחד עם העיניים שמחברות את שני הקווים בניצב.
- להסתעף ventrally כדי להפריד את מחיצת האף מהרקמות שמסביב. נתיב רחב יותר יהיה למנוע נזק להממברנה הרירית עם זאת זה יהיה גם להפוך אותו ליותר קשה לבודד את הממברנה. חתך צר יותר קרוב לקו האמצע מומלץ.
- השתמש במספריים כדי לחתוך את המחיצה חופשית מכל רקמה דבקה בו ולאחסן אותו בתמיסת מלח סטרילית. בשלב זה את השתל ניתן לנקות להסיר את כל רקמה מחוברת. המצב האידיאלי הוא שיש קרומים הריריים ניזוק חשוף משני צידי מחיצת הסחוס. גרם אחדומאחור יכול לספק קרום לשני עכברים סיפקו את שטח הפנים של הקרום הוא מספיק כדי לכסות את אתרי פתיחת הגולגולת. מומלץ שהשתל משמש במהירות אפשרית והחוקר ממשיך לשלב 3 ברגע שהשתל הוא מבודד.
3. השתלה כירורגית של שתל הרירי
- באמצעות נהלים סטנדרטיים, אספטיים עכבריים ניתוחיים, להרדים והר עכבר במסגרת stereological. השתמש isoflurane כ -2% בחמצן טהור באמצעות מכונה הרדמה מכרסם.
- לשתק את העכבר במנגנון stereotaxic עם ברים אוזן ומחזיק את האף. החל המשחה עיניים לעיניים ולשפשף את הקרקפת עם בטאדין ו75% אתנול לשלושה סיבובים. או באמצעות מספריים או גוזם שיער, להסיר את הפרווה על הראש. לחשוף את הגולגולת עם סכין גילוח ואת רמת הראש. לבצע פתיחת גולגולת מעל המיקום במוח שיהיה במינון. לדוגמא, כאשר מיקוד הסטריאטום לחתוך 1.25 מ"מחור עגול בקוטר בגולגולת (מרוכזת ב AP: 1.00 מ"מ; ML: 0.88 מ"מ) באמצעות פטיש אוויר. להרטיב את האזור שנקדח עם מי מלח סטריליים ולהשתמש בסכין גילוח כדי להסיר את הגולגולת.
- מוציא בזהירות את הדורה באמצעות קצה מחט. בנוסף, זה יכול להתבצע על ידי מריחת כמות מינימאלית של דבק רקמות אל פני השטח dural הלח. ברגע ששכבה זו יש קשוח, תנועה לרוחב עם קצה סכין גילוח יכולה לשמש כדי להסיר את הקרום.
- מניחים את הקרום הרירי מעל פני המוח דואגים קיצוני כדי לשמור בצד אפיתל מול מן הפצע. זה נעשה הכי טוב על ידי העברת כל המחיצה על פני השטח של הגולגולת הסמוכה לאתר craniotomy עם פינצטה. באמצעות הקצה של זוג מספריים כירורגיות, למשוך את הקרום משל הסחוס ועל גבי משטח הגולגולת והמוח. אל תתנו את הקרום להתייבש או לגעת בו עם כל חומר סופג. השתל צריך בנדיבות חופף כל קצוות הגרמיים של של פתיחת הגולגולתITE.
- מכסה את השתל עם חתיכת nitrile סטרילי. זה פועל על מנת למנוע הידבקות של העור לשתל במהלך ריפוי. Nitrile צריך להיות גדול מספיק כדי לכסות את כל הקרום הרירי. לקצץ קרום מוגזם במידת צורך. הימנע מכל תנועה של nitrile פעם אחת בא במגע עם השתל.
- סגור את העור עם תפר סטרילי ריצת 5-0 ולתת לעכבר להתאושש במשך 3-7 ימים לפני שתמשיך לשלב הבא. יש להיזהר שלא להפריע את מחסום nitrile או השתל הרירי במהלך סגירת עור.
4. מינהל מינון הפתרון
- לאחר הבטחת העכבר הרדים במסגרת stereotaxic, לחתוך את התפר עם מספריים ולהסיר עודפי עור סביב הגולגולת.
- הסרת מכשול nitrile ולנקות את פני השטח של הגולגולת. השתמש במטליות מלוחה והכותנה סטרילי כדי לנקות את האזור עד שהשתל נראה לעין. ייתכן שיהיה צורך לחתוך את השתל בסכין גילוח אם גדל גדול יותר מאשר דesired שטח פנים.
- אם הניסוי יהיה יותר מכמה ימים, זה חכם להשתיל לפחות שני ברגים בגולגולת כדי לחזק את שתל הראש.
- הנח את הרבה מעל השתל, כך שהקצוות נמצאים בקשר עם הגולגולת. החל דבק cyanoacrylate בצומת שבין טוב והגולגולת. מלא היטב עם תמיסת מלח סטרילית ולבדוק כדי לוודא שאין נזילות. ולס עשויים ממחטי מזרק לחתוך.
- החל מלט עצם בגולגולת כדי לאבטח היטב במקום.
- הסר מלוח מהבאר עם טפטפת. לשטוף היטב כמה פעמים כדי לאמת את הדבק שלא דלף פנימה מוסיף את הפתרון הרצוי; במקרה זה 50 μl של dextran הניאון משמש. צפוי כי תרכובות מסיסים במים של קוטביות דומה תתנהג כמו dextran. משלוח של תרכובות או השעיות הידרופובי לא נחקר בשיטה זו.
- מכסה את החלק העליון של כן באמצעות פיסה עגולה של nitrile מאובטחתהעליון באמצעות דבק cyanoacrylate. ודא שהדבק אינו בא במגע עם התוכן טוב.
5. ניתוח של משלוח transmucosal
- לאחר את הכמות הרצויה של זמן עבר, להרדים את העכבר ולהחליף את התוכן גם עם תמיסה של הצבע הכחול של אוון. צבע זה משמש כדי לוודא שהשתל היה שלם.
- לאחר 30 דקות, להרדים את העכבר בכבדות, להסיר את פתרון הצבע, ולהרדים באמצעות עריפת הראש.
- הסרה ידנית של השתל ולהסיר את המוח באמצעות מספריים כירורגיות. הקפד לשמור את השתל במקום.
- לאחר הוצאתו, פלאש להקפיא את המוח בתמיסה של בוטן מקורר באמבט קרח יבש.
- שבץ המוח בטמפרטורה אופטימלית חיתוך פתרון (אוקטובר) ופרוסה ב50 מיקרומטר.
- מניחים את הפרוסות הרצויות ישירות על שקופיות מיקרוסקופ.
- תמונה הפרוסה באמצעות מיקרוסקופ בתפרחת בהקדם פתרון אוקטובר התייבש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קבלת explant מחיצה גדולה מספיק באף חיונית לשלבים הבאים. ניתן להשיג זאת על ידי קידוח במיקום על הגולגולת של עכבר התורם שמוצגת באיור 1 א. חיתוך בדרך זו יפיק explant של מספיק הגודל כפי שמוצג באיור 1b. אם עומק הקידוח הוא לא עמוק מספיק, השתל יהיה קטוע וזה יהיה קשה להשיג מספיק קרום גדול כדי לכסות את פני השטח במוח. קידוח יותר רוחבי מהתוואי שהציע לא מומלץ משום שיותר רקמה תישאר על מחיצת האף, והשלב הבא יהיה קשה יותר. לפני ההעברה של הקרום הרירי, את פני השטח של מחיצת האף צריך לנקות מכל רקמת החיבור העודפת. ברגע שזה נעשה, הקרום הרירי צריך להיות גלוי על פני השטח של הסחוס. תרשים 1C מראה מה הרקמה נראית כמו אחרי הניקוי.
לפני העברת membRANE, פתיחת גולגולת וdurotomy צריכה להתבצע על מנת לחשוף את פני השטח במוח. רק לאחר הדימום שלאחר durotomy-הפסיק יכול הקרום יועבר. איור 2a מראה מה אתר הניתוח אמור להיראות לפני שתמשיך לשלב הבא. העברת הקרום הרירי מהסחוס על גבי משטח המוח היא הצעד הכי מאתגר מבחינה טכנית של ההליך הכירורגי כולו וצריך להיעשות בזהירות. אם המחיצה שנקטפו היא גדולה מספיק, את פני השטח של השתל הרירי צריך להיות גדול מספיק כדי לכסות את פני השטח במוח. הועבר פעם אחת, את אזור הניתוח צריך נראה דומה לזה שבאיור 2b. חשוב לוודא כי בצד של הקרום שנמצא במגע עם הסחוס הוא אותו אחד שהוא במגע עם משטח המוח. אם הקרום מקבל התהפך או מקופל מעל עצמו, זה צריך להיות מושלך ואמור לשמש עוד אחד. לאחר שלב זה יושלם, ניתן נתפרה הקרקפתכך העכבר יכול לשחזר והשתל יכול לרפא. על מנת למנוע כל תופעות לוואי מהשתל הבא במגע עם פני השטח הפנימיים של הקרקפת, חתיכת nitrile מגן צריכה להיות ממוקמת מעל לאתר כירורגית. כפי שמוצג באיור 2 ג, החתיכה מוכנסת צריכה להיות גדולה מספיק כדי לכסות את הקרום אבל לא גדולה מספיק כדי לעכב תפירת העור סגור.
במהלך תקופת ההחלמה, רקמות משמעותיות בצמיחה מתרחשת בקרום העצם שמסביב אשר יש להסיר לפני מינון הממברנה. לאחר פתיחתו מחדש של הקרקפת, צמר גפן סטרילי ותמיסת מלח יצטרכו להשתמש בהם כדי לנקות את האתר עד שזה נראה דומה לזה שבאיור 3 א. יש לנו לא נצפה שום תגובה חיסונית משמעותית; אולם זו לא אושרה בהיסטולוגיה. השתל ייתכן שיהיה הצורך לחתוך בסכין גילוח אם זה גדל על פני השטח של הגולגולת. בשלב זה גם שיכיל את solu המינוןtion צריך להיות מושתל מעל לשתל. ניתן לשים ברגי גולגולת כמה בשלב זה אם יציבות מכאנית לטווח הארוך של השתל היא דאגה. ודא היטב מוקם כך שזה לא נוגע בשתל. פעם אחת במקום, דבק cyanoacrylate ניתן להחיל להדביק אותו לגולגולת. כדי למנוע ההדבקה מלבוא במגע עם השתל זה צריך להיות מיושם על פני השטח של הבאר ודחף כלפי מטה כדי לאטום את הפער. ברגע שגם הוא בטוח, זה צריך להיות מלא באופן זמני עם מי מלח לשתי מימה השתל ולבדוק אם קיים דליפה. גם דבקו צריך להיראות ככה ב3 ב איור ו פתרון צריך להיות ברור המצביע על כך שהוא אינו מכיל כל דבק. כל הדלפות תהיה ברורות כי רמת הנוזל ובתרד. אם הדלפות נמצאות שהם צריכים להיות קבועים עם יותר דבקים. גם לאחר מכן חיזק עם מלט עצם. בשלב זה מי מלח ובניתן להסיר עם טפטפת והוחלף בפתרון המינון הרצוי. כאשר מכסה היטב עם חתיכת טיפול nitrile יש לנקוט כדי לוודא את הדבק לא לפנות לפתרון בבאר. בסופו של ההליך כולו, ראש העכבר צריך להיראות ככה באיור 3c. מלט העצם הוא מעט שקוף ולכן אם התוכן גם הוא רגיש לאור, צבע או דיו ניתן להוסיף אל פני השטח של הבטון המיובש או לתערובת הבטון כדי למנוע photodegradation של התוכן טוב.
לאחר תקופה הרצויה של זמן המתנה, המוח צריך להיות מנותח כדי לגלות את ההשפעות של המינון. יש להתייחס אליהם במוח בצורה שונה בהתאם למה שנבחן. אם מטרתו של הנוהל היא לנתח את נוכחותו של כל חומר כימי הוסיף לטוב, (כאמור בסעיף הפרוטוקול לעיל) אז מומלץ לעשות הקפאת הבזק של המוח לשמר את התרכובות המנוהלות. איור 4 > מציג תוצאות נציג של שימוש בגישה זו. מינון עם פולימר 40 kDa ניאון (dextran מצומדות tetramethyrhodamine) ל24 שעות תערוכות דיפוזיה הבולטת לתוך רקמת המוח. התוצאות הקודמות שלנו עם דיפוזיה מופע dextran לתוך רקמת המוח היא זמן והן במשקל מולקולרי תלויה 18. מולקולות קטנות יותר מפוזרות לתוך המוח parenchyma במידה רבה יותר מאשר אלה גדולים יותר, ותוצאות גדולות יותר מינון פעם בכמות גדולה יותר של דיפוזיה לכל משקלים המולקולריים שנבדקנו. אם הבזק הקפאה נעשה חשוב לעגן את השקופיות לאחר חתך ולא לחשוף אותם לכל פתרון. כל נוזל יהיה solubilize המתחם מנוהל ולפזר אותו על פני שטח הפנים של פרוסת המוח. אם אימונוהיסטוכימיה היא שיש לבצע על המוח אז מומלץ לינקב בעכבר כדי לתקן את רקמת המוח.
"Src =" iles/ftp_upload/51452/51452fig1highres.jpg / files/ftp_upload/51452/51452fig1.jpg "/>
איור 1. תמונות של הליך קצירת מחיצת האף. א) מיקומו של אתר הקידוח בגולגולת של עכבר מורדמים. הקווים מקווקווים מציינים את ההיקף לקדוח. B) מחיצת האף מייד לאחר הסרה כירורגית. C) מחיצת האף לאחר הסרת רקמה עודפת. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. תמונות כירורגי של תהליך engrafting. א) האתר כירורגית בעקבות פתיחת גולגולת וdurotomy. התמונה היא נציג של מה שהגולגולת צריכה להיראות כמו לפני הצבת השתל עליו. B) מיקום של שתל הרירית לאתר craniotomy. הקו המקווקו מציין את ההיקף של השתל. התמונה מראה את פני שטח הרצוי של השתל. C) ההשרשה של מחסום nitrile מגן. גודלו של החומר כפי שמוצג הוא גדול מספיק כדי לכסות את השתל, אך לא גדול מספיק כדי להפריע לתפירה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. תמונות כירורגי של תהליך מינון תרופה. א) דוגמא למה שהשתל הרירי רפא נראה כמו לאחר ניקוי קפדני של האתר כירורגית. ב ') תמונה של מחובר היטב לגולגולת. הממשק של הגולגולת וגם הוא מאובטחעם דבק cyanoacrylate וגם מלא בתמיסת מלח סטרילית. רמת פתרון סטאבילה מציינת שאין דליפות מהבאר ואת הבהירות של הפתרון מציינת שאין זיהום של הפתרון עם הדבק. C) התמונה של הניתוח הושלם. גם מכיל את פתרון המינון והוא הכתיר באופן מאובטח עם מחסום nitrile. מלט עצם הוא במקום rigidify השתל היטב. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של פרוסת מוח העכבר הבאה מינון transmucosal עם 40 dextran מצומדת tetramethylrhodamine kDa ל24 שעות. פרוסה צולמה ב-1.06 גבחת מ"מ בעובי של 501; מ '. השתל הרירי גלוי על פני השטח של המוח. בר = 1 מ"מ. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצעד הקשה ביותר של ההליך המתואר במסמך זה הוא ההעברה המוצלחת של קרום הרירי בגודל מתאים על גבי משטח המוח. צעד זה נעשה קל יותר באופן משמעותי, אם מחיצת האף שנקטפו היא גדולה מספיק וניקה היטב. אם החלק הגחוני של מחיצת האף נחתך, יש לקבל שתל חדש. זווית הקידוח צריכה להיות בניצב לראש העכבר כדי להבטיח כי הקרום הרירי אינו פגום על ידי המקדחה. אם נתיב קידוח יותר ממומלץ רחב יותר הוא לקח את זה יהיה הרבה יותר קשה כדי להסיר רקמה נוספת המחובר למחץ. כל חתיכות גדולות של רקמת חיבור יש להסיר עם קיצוצים במספריים חדים ולא מנסה למשוך אותם רופף. חתיכות קטנות של רקמה ניתן להסיר על ידי גירוד עם הטיפים של המספריים הניתנים הרקמות אינה מחוברות לקרום הרירי. בסופו של תהליך הניקוי, משטח הסחוס עם הקרום עדיין מחובר צריך להיות חשוף. לפעמים אפילוsionally הסחוס במחיצה עלול להיות מנותק מהעצם שהוא מחובר בקצה הגב. אם זה יקרה זה עדיין אפשר להשתמש בו בשלב הבא אבל זה מאתגר יותר משתי סיבות. העצם הוא ידית נוחה להחזיק explant בעת הניקוי והעברתו. הוסר לאחר, קשה יותר לתמרן את גיליון הסחוס עדין יותר. שנית, צומת סחוס עצם המקום שבו הקרום הרירי הוא עבה ביותר והקל ביותר להשיג בעת הסרתו מהסחוס. אם העצם נותק מסחוס חלק זה של קרום הולך לאיבוד.
ברגע שהשתל במחיצה נוקה ופתיחת הגולגולת וdurotomy כבר בוצעו, הקרום הרירי יכול להיות ממוקם על פני המוח החשוף. המטרה זו מושגת על ידי מיטב מיצוב explant הסמוך לאתר craniotomy. הקרום אז יכול להיות משך מהסחוס, על הגולגולת, ועל המוח. דברים רבים יכולים להשתבש במהלך זה process. הקרום יכול להתייבש, לקבל קרוע, לקפל על גבי עצמו, או חבורה. גם הקרום המכסה הצד השני של המחיצה האחר יכול להיפגע ממתחכך הגולגולת. ייתכן גם כי בניסיון להסיר את הקרום הרירי פונה כלפי מעלה, אחד מסיר את הקרום משני הצדדים באותו הזמן. כדי למנוע את כל הבעיות האלה שלו הוא חיוני כדי להעביר את הקרום לאט ותמיד לבחון את שני הצדדים של מחיצת האף. האסטרטגיה הטובה ביותר היא להשתמש בעצות של המספריים כדי לסלק את הקרום מגיליון הסחוס לפני שאתה מנסה להחליק אותו. אם כל חלק של הקרום נשאר מחובר, זה אפשרי, כי האלסטיות של הרקמות תהיה לסגת לאחר שהפילה עליו. על ידי שימוש בתנועות קטנות, מושכות את הקרום יכול להיות מנותק מן מחצה. רק אז יהיה זה בקלות להחליק ולנפול. הקרום הוא דק מדי כדי להיות מסוגל לטפל בם בפינצטה; זה יכול להיות משך רק ממשטח אחד למשנו. אם זה נעשה התהפך או מקופל מעל עצמו, זהצריך להיות מושלך ויש לקבל עוד אחד.
אם השתל מכסה את כל פני השטח של המוח החשוף, התהליך היה מוצלח והקרקפת ניתן נתפרה כך שאתר הניתוח יכול לרפא. מחסום nitrile יש לשים במקום, כך שהעור לא בא במגע עם הקרום. יש להקפיד כל כך בלחץ כי הוא לא הפעיל על nitrile כאשר התפירה אחרת עמדת השתל יכולה לזוז. כמו כן לדאוג שלא תפר לnitrile. הדרך הטובה ביותר לוודא את החומר מציית היא לשמור אותו לח עם תמיסת מלח ולוודא שהוא נשאר שטוח לאורך כל התפירה.
ברגע שהשתל הגליד (3-7 ימים) המכיל גם פתרון המינון יכול להיות מחובר לגולגולת מעל לשתל. זה יכול להיות קבוע באופן זמני לגולגולת דבקה ואופן קבוע עם מלט עצם. ברגע שמלט העצם מוחל, זה לא יהיה אפשרי לעשות כל תיקונים לtherefo העמדה גםמחדש כל אופטימיזציה יש לעשות לפני יישומה. ברגע שגם הוא בתפקיד ונערך במקום עם דבק cyanoacrylate, זה צריך להיות מלא עם תמיסת מלח סטרילית. אם ההליך נעשה בהצלחה רמת הנוזל לא תשתנה והפתרון יהיה ברור. אם יש דליפה, רמת תרד ומיקום שבו המים ברחו צריך להיות גלוי. לאחר החלת יותר דבק באתר הדליפה, יותר מלוח יש להוסיף כדי לאמת את הדליפה נאטמה. אם הדבק מזהם את הפתרון טוב, סרט שקוף יהיה גלוי בחלק העליון של מפלס הנוזל. במקרה זה גם יש לשטוף מספר פעמים עם מי מלח עד הפתרון הוא ברור. בנוסף, החלפת כותנה יכולה לשמש כדי להסיר את הסרט על ידי נגיעה בו אל פני השטח הנוזלי. רק כאשר הפתרון גם הוא יציב וברור צריך להיות מיושם המלט. כאשר הבטון יבש, המלוחים מהבאר ניתן להסיר ולהחליפו בפתרון המינון. יש להקפיד ללא יפגע בקרום כאשר pipetting לתוך ומחוץ לבאר. ברגע שמולא, ראש גם צריך להיות אטום עם חתיכת nitrile באמצעות דבק cyanoacrylate. חשוב שהשטח שנותר בין פני השטח של הפתרון והחלק העליון של הבאר. זה יבטיח כי הדבק לא נוגע בפתרון כאשר לשים על מחסום nitrile.
ברגע שזה זמן לנתח את ההשפעה של הליך המינון, המוח יש להסיר וצלם. אם אימונוהיסטוכימיה היא שיש לבצע, ניתן לעשות מכתים זלוף ונוגדנים סטנדרטי. אם מיקומו של המתחם במינון הוא שיקבע, מומלץ לבזק להקפיא את המוח בתמיסת קרח / בוטן יבשה. זה יבטיח כי מיקומו של המתחם בפרוסות המוח הוא אותו הדבר כמו שהיה ערב להמתת חסד.
הפרוטוקול המתואר במסמך זה מתאר שיטה לבדיקת משלוח סמים למוח העכבר באמצעות ניתוחמורכבים קרום הרירי semipermeable 18. זה דומה לתוצאה של ניתוח להסרת גידול transnasal בבני אדם שבו פגמים בסיס גולגולת הם תוקנו עם קרום הרירי באף vascularized 19,20. שימוש במודל עכבר זה, ניתן כיום ללמוד איך שתלים ברירית אלה מסוגלים לעקוף את BBB ומאפשר משלוח ישיר משקל מולקולרי גבוה תרופה למוח. עכשיו יש לנו לבצע הליך זה מעל 100 פעמים. חיוני להליך זה הוא הקציר המוצלח של שתל מחיצת האף מעכבר תורם וההעברה של הקרום הרירי מהשתל על גבי עכבר המבחן. הליך זה, בפעם הראשונה, מאפשר בדיקה קליני של תרופות משקל מולקולריות גבוהות עבור מגוון רחב של הפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
בנימין ס בלייר MD הוא ממציא ראשי של שיטות כיסוי פטנט זמניות של אספקת סמים למערכת העצבים המרכזית.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי קרן Mcihael ג'יי פוקס לשנת 2011 מחקר החידושים Rapid Response פרקינסון תכנית פרסים. היו הממנים שום תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Taconic | C57BL/6 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | ||
| Student fine scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Pneumatic drill | MTI Dental | 333-CB | |
| Drill bit | |||
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| 0.9% Sodium chloride injection USP | Abbott Laboratories | 4925 | |
| Polystyrene Petri dish | Fisher | 08-757-12 | for temporarily storing graft |
| Bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Oxygen/Isoflurane System | SurgiVet | V720100 | |
| Temperature Control System | Physitemp | TCAT-2LV | |
| Small animal stereotaxic instrument | KOPF | Model 940 | |
| Eye ointment | |||
| Electric shaver | |||
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 23-400-106 | |
| 7.5% Providone iodine | Betadine surgical scrub | ||
| 70% Ethanol | |||
| Surgical blade stainless | Feather | 2976#10 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 3% Hydogen peroxide | for cleaning the skull | ||
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Needles | Becton, Dickinson and Company | 305176 | needle tip cut off and used as well |
| Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309597 | |
| Nitrile gloves | Denville Scientific Inc | G4162 | for well closure and protection of graft |
| 5-0 Nylon suture thread | |||
| Student Halsey needle holder | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Cyanoacrylate adhesive | commecially available super glue | ||
| Dental cement kit, 1 lb, pink opaque | Stoelting | 51458 | |
| Isobutane (2-methylbutane) | Aldrich | M32631 | for dry ice bath |
| Dry ice |
References
- Cardoso, F. L., et al. Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).
- Pardridge, W. M.
- Chen, Y., Liu, L. Modern methods for delivery of drugs across the blood-brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 640-665 (2012).
- Cheng, F. -C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced neurotoxicity in C57BL/6 mice. Neurosci. Lett. 252, 87-90 (1998).
- Grondin, R., et al. controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys. Brain. 125, 2191-2201 (2002).
- Kirik, D., et al. Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat. Neurosci. 7, 105-110 (2004).
- Pardridge, W. M. Drug and gene targeting to the brain with molecular trojan horses. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 131-139 (2002).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery of protein and non-viral gene therapeutics with molecular Trojan horses. J. Control. Release. 122, 345-348 (2007).
- Bellavance, M. -A., et al. Recent advances in blood-brain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 10, 166-177 (2008).
- Merkus, F. H. M., Berg, M. Can nasal drug delivery bypass the blood-brain barrier. Drugs R. D. 8, 133-144 (2007).
- Dhuria, S. V., et al. Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations. J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).
- Illum, L. Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions. J. Control. Release. 87, 187-198 (2003).
- Craft, S., et al. Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial. Arch. Neurol. 69, 29-38 (2012).
- Freiherr, J., et al. Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's Disease: A review of basic research and clinical evidence. CNS Drugs. 27, 505-514 (2013).
- Gill, S. S., et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nat. Med. 9, 589-595 (2003).
- Love, S., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain. Nat. Med. 11, 703-704 (2005).
- Antunes, M. B., et al. Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures. BioTechniques. 43, 195-204 (2007).
- Bleier, B. S., et al. Permeabilization of the blood-brain barrier via mucosal engrafting: implications for drug delivery to the brain. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bernal-Sprekelsen, M., et al. Closure of cerebrospinal fluid leaks prevents ascending bacterial meningitis. Rhinology. 43, 277-281 (2005).
- Bleier, B. S., et al. Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility. Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).
