Summary
وقد تم تطوير نموذج الفأر من بالمنظار إعادة الإعمار قاعدة الجمجمة البشرية التي تخلق واجهة نصف نافذ بين الدماغ والأنف باستخدام الطعوم المخاطية الأنفية. يسمح هذا الأسلوب للباحثين لدراسة التسليم إلى النظام العصبي المركزي للعلاجات عالية الوزن الجزيئي التي تستبعد خلاف ذلك حاجز الدم في الدماغ عندما تدار بشكل منتظم.
Abstract
وأعاق إيصال العلاجات إلى الدماغ عن وجود حاجز الدم في الدماغ (BBB) الذي يقيد مرور مركبات الوزن الجزيئي القطبية وارتفاع من مجرى الدم وإلى أنسجة المخ. وقد تحقق بعض النجاح التسليم المباشر في البشر من خلال زرع القسطرة عبر الجمجمة؛ ولكن هذا الأسلوب هو الغازية للغاية ويترافق مع مضاعفات عديدة. وثمة بديل أقل الغازية لتكون جرعة الدماغ من خلال زرع جراحيا، غشاء نصف نفوذ مثل الغشاء المخاطي للأنف الذي يستخدم لإصلاح العيوب الجمجمة قاعدة التالية بالمنظار transnasal جراحة إزالة ورم في البشر. نقل المخدرات على الرغم من أن هذا الغشاء تجاوز بشكل فعال ومنتشر BBB مباشرة الى الدماغ والسائل المخي الشوكي. مستوحاة من هذا النهج، وقد وضعت نهجا الجراحية في الفئران التي تستخدم الأغشية المخاطية المغروسة المانحة الحاجز أكثر من خارج القحف الجراحية عيب BBB. وقد تبين هذا النموذج على نحو فعالتسمح بمرور المركبات عالية الوزن الجزيئي في الدماغ. منذ العديد من المرشحين المخدرات غير قادرين على عبور BBB، وهذا النموذج هو قيمة لأداء اختبار قبل السريرية لعلاجات جديدة للأمراض العصبية والنفسية.
Introduction
علاج الأمراض العصبية والنفسية وأعاقت بشدة من وجود حاجز الدم في الدماغ (BBB) الذي يمنع أكثر من 95٪ من جميع وكلاء الدوائية المحتملة من الوصول إلى الجهاز العصبي المركزي 1-3. على سبيل المثال، الدبقية مشتقة عصبية عامل (GDNF) وقد تبين أن تكون فعالة في علاج مرض باركنسون عند حقنه مباشرة في الدماغ، ولكن غير فعالة عند تسليمها بشكل منتظم لأنه لا يمكن اختراق BBB 4-6.
العديد من اقترب وضعت في محاولة للتحايل على هذه المشكلة. وقد أظهرت تحسنا في تسليم النظامية من neurotheraputics باستخدام تقارن المخدرات التي تحتوي على الأجسام المضادة للبروتينات النقل انتقائية تقع على البطانة الشعرية الدماغ؛ ومع ذلك لم يظهر هذا الأسلوب لتكون قابلة للتطبيق لمجموعة واسعة من المستحضرات الصيدلانية 7،8. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام افتتاح الاسموزي من BBB العيادةحليف، ومع ذلك تعاني هذه الطريقة من الجرعات النظامية المخدرات في مقابل تسليم أكثر مباشرة إلى منطقة الدماغ التي تهم 9. وقد بذلت جهود كبيرة في تحسين تسليم transnasal على أمل تستهدف الدماغ 10-12 مباشرة. على الرغم من تحقيق بعض النجاح، وفقط تم الحصول على نتائج قاطعة عن الأدوية التي تمتلك مستقبلات الذاتية، مثل الأنسولين 13،14. وعلاوة على ذلك كانت آلية التسليم transnasal مثيرة للجدل مع أدلة تشير إلى دخول غير مباشرة الى الدماغ عن طريق حاسة الشم امتصاص الخلايا العصبية أو من خلال مجرى الدم 11. وقد تحقق المباشر، والتسليم عبر الجمجمة باستخدام القسطرة زرع، ولكن هذا الإجراء هو الغازية للغاية ويرتبط مع العديد من المضاعفات 15،16. حتى الآن، لا يوجد، طريقة مينيملي العامة لتقديم مركبات عالية الوزن الجزيئي في الدماغ.
الواردة في هذه الوثيقة هو إجراء العمليات الجراحية الفئرانالذي يخلق واجهة نصف نافذ مع الدماغ. ويتم إنجاز ذلك عن طريق engrafting على الغشاء المخاطي ازدراع 17 على عيب حج القحف الجراحية في الماوس. باستخدام هذا الإجراء فقد تبين أن مركبات قابلة للذوبان تصل إلى 500 كيلو دالتون يمكن تسليمها في النظام العصبي المركزي (الدماغ مباشرة في حمة وكذلك في السائل النخاعي) في كل وقت والوزن الجزيئي تعتمد الأزياء 18. هذا الأسلوب من تجاوز BBB هو نموذج لإصلاح عيب قاعدة الجمجمة في البشر والذي يستخدم ترقيع الغشاء المخاطي أوعية دموية لإصلاح ثقوب في الجمجمة التالية transnasal الجراحة بالمنظار 19،20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
قبل الجراحة تأكد من الموافقة على جميع الإجراءات التي تتم عن طريق IACUC وأية سلطات أخلاقية أو قانونية إضافية واستخدام الممارسات علاج الحيوان إنسانية. وهذا يشمل استخدام الظروف الجراحة المعقمة، التخدير باستخدام الماوس وافق IACUC الأسلوب، التشحيم عيون الفئران مع مرهم الطبيب البيطري أثناء الجراحة، وتوفير الرعاية بعد الجراحة. لا المضي قدما في عملية جراحية إذا كان هناك أي سؤال حول ما إذا تمت الموافقة على جوانب الإجراء. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تؤدى في هذه الوثيقة من قبل لجنة جامعة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام بوسطن.
1. إعداد الحيوانات واللوازم الجراحية
- الأوتوكلاف كل أداة جراحية التي سيتم استخدامها أثناء الجراحة.
- تأكد من الموافقة على جميع التقنيات التي سيتم تنفيذها من قبل الهيئات التنظيمية الحيوان.
2. حصاد المخاطي الكسب غير المشروع
- اختار الماوس متطابقة وراثيا من العمر مماثلة لالماوس التجريبية والموت ببطء في طريقة IACUC المعتمدة (هنا: الاختناق isoflurane وتليها خلع عنق الرحم).
- باستخدام مقص جراحي، وإزالة الجلد حول منطقة الأنف من الرأس الماوس تعريض الجمجمة.
- مع هوائي الحفر، مع علامة ثلاثة خطوط اثنان منها الجناح أفقيا منطقة الأنف وثالثة تمشيا مع عيون الذي يربط بين خطين عموديا.
- انتقل لأسفل البطني من أجل فصل الحاجز الأنفي من الأنسجة المحيطة بها. وهناك مسار أوسع منع تلف الغشاء المخاطي لكنه سيجعل الأمر أكثر صعوبة أيضا لعزل الغشاء. ينصح قطع الضيق أقرب إلى خط الوسط.
- استخدام مقص لقطع الحاجز خالية من أي نوع من الأنسجة انضمت إليها وتخزينها في محلول ملحي معقم. في هذا الوقت يمكن تنظيفها الكسب غير المشروع حتى إزالة أي نوع من الأنسجة المتصلة. الوضع المثالي هو أن يكون الأغشية المخاطية التالفة تعرض على جانبي الحاجز الغضروف. واحد غرامالخلف ان نورد الغشاء لمدة الفئران وفرت المساحة السطحية للغشاء هي كافية لتغطية مواقع حج القحف. فمن المستحسن أن يستخدم الكسب غير المشروع في أسرع وقت ممكن والعائدات الباحث إلى الخطوة 3 حالما يتم عزل الكسب غير المشروع.
3. زرع الجراحي لالمخاطي الكسب غير المشروع
- باستخدام والإجراءات الجراحية الفئران العقيم القياسية، تخدير وجبل ماوس في إطار stereological. استخدام ما يقرب من 2٪ isoflurane والأكسجين النقي في استخدام آلة التخدير القوارض.
- لشل حركة الماوس في جهاز التجسيمي بقضبان الأذن والأنف حامل. تطبيق مرهم للعين للعيون وفرك فروة الرأس مع بتدين و 75٪ من الإيثانول لمدة ثلاث جولات. باستخدام مقص أو الانتهازي الشعر، إزالة الفراء على رأسه. فضح الجمجمة بشفرة حلاقة ومستوى الرأس. إجراء حج القحف فوق موقع الدماغ التي سيتم مداوي. على سبيل المثال، عند استهداف المخطط قطع 1.25 ملمقطر ثقب دائري في الجمجمة (تركزت في AP: 1.00 مم؛ ML: 0.88 مم) باستخدام الحفر بالهواء المضغوط. الرطب منطقة حفر مع ملحي معقم واستخدام شفرة حلاقة لإزالة الجمجمة.
- إزالة بعناية الجافية باستخدام غيض من إبرة. بالإضافة إلى ذلك، وهذا يمكن أن يتحقق من خلال تطبيق الحد الأدنى من الأنسجة لاصقة على سطح الجافية رطبة. مرة واحدة وشددت هذه الطبقة، الحركة الجانبية مع طرف شفرة حلاقة يمكن استخدامها لإزالة الغشاء.
- وضع الغشاء المخاطي فوق سطح الدماغ مع الحرص الشديد للحفاظ على الجانب الظهارية التي تواجه بعيدا عن الجرح. من الأفضل القيام بذلك عن طريق نقل الحاجز بأكمله على سطح الجمجمة المجاورة لموقع حج القحف مع ملاقط. استخدام غيض من زوج من مقص جراحي، وسحب الغشاء الخروج من الغضروف وعلى الجمجمة والدماغ السطح. لا تدع غشاء تجف أو لمسها مع أي مادة ماصة. الكسب غير المشروع يجب أن تتداخل بسخاء كل الحواف العظمية من ليالي حج القحفالفنار.
- تغطية الكسب غير المشروع مع قطعة معقمة من النتريل. هذا يعمل على منع التصاق الجلد إلى الكسب غير المشروع خلال الشفاء. والنتريل يحتاج إلى أن تكون كبيرة بما يكفي لتغطية الغشاء المخاطي بأكمله. تقليم الغشاء المفرطة إذا لزم الأمر. تجنب أي حركة النتريل مرة واحدة قد حان في اتصال مع الكسب غير المشروع.
- إغلاق الجلد مع تشغيل 5-0 خياطة العقيمة والسماح للماوس على التعافي لمدة 3-7 أيام قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. والحرص على عدم التشويش على حاجز النتريل أو الكسب غير المشروع المخاطية أثناء إغلاق الجلد.
4. إدارة الجرعات الحل
- بعد تأمين الماوس تخدير في إطار التجسيمي، وقطع مع مقص خياطة وإزالة الجلد الزائد حول الجمجمة.
- إزالة حاجز النتريل وتنظيف سطح الجمجمة. استخدام العقيمة المالحة والقطن مسحات لتنظيف المنطقة حتى الكسب غير المشروع مرئيا. قد يكون من الضروري لخفض الكسب غير المشروع بشفرة الحلاقة لو نمت أكبر من دesired مساحة السطح.
- إذا كانت التجربة سوف تكون أطول من بضعة أيام، وأنه من الحكمة لزرع ما لا يقل عن اثنين من مسامير الجمجمة لتعزيز عملية الزرع الرأس.
- وضع أعلى بكثير من الكسب غير المشروع بحيث حواف على اتصال مع الجمجمة. تطبيق لاصقة cyanoacrylate عند تقاطع بين البئر والجمجمة. ملء البئر مع ملحي معقم وتحقق للتأكد من عدم وجود تسرب. مصنوعة من الآبار الإبر قطع حقنة.
- تطبيق الأسمنت العظام في الجمجمة لتأمين البئر في المكان.
- إزالة الملوحة من البئر مع ماصة. يغسل عدة مرات للتحقق جيدا لم تسربت بأن لاصقة فيها إضافة إلى الحل المنشود؛ في هذه الحالة يتم استخدام 50 ميكرولتر من ديكستران الفلورسنت. ومن المتوقع أن المركبات القابلة للذوبان المياه من قطبية مماثلة سوف تتصرف نفس ديكستران. لم يتم استكشافها تسليم مركبات مسعور أو تعليق مع هذا الأسلوب.
- سقف أعلى البئر باستخدام قطعة دائرية من النتريل تأمين لأعلى باستخدام فورية الغراء اللاصق. تأكد من أن لاصق لا تأتي في اتصال مع محتويات جيدا.
5. تحليل Transmucosal التسليم
- بعد المبلغ المطلوب من الوقت قد انقضى، تخدير الماوس وتبادل محتويات جيدا بمحلول صبغة زرقاء ايفان. ويستخدم هذه الصبغة للتحقق من أن الكسب غير المشروع كان سليما.
- بعد 30 دقيقة، تخدير الماوس بشكل كبير، وإزالة محلول الصبغة، والموت ببطء عبر قطع الرأس.
- إزالة يدويا الزرع وإزالة المخ باستخدام مقص جراحي. توخي الحذر للحفاظ الكسب غير المشروع في المكان.
- إزالة مرة واحدة، وتبريد فلاش تجميد الدماغ في حل من الأيزوبيوتان في حمام الثلج الجاف.
- تضمين الدماغ في درجة الحرارة المثلى للقطع (أكتوبر) حل وشريحة في 50 ميكرون.
- وضع شرائح المطلوب مباشرة على شريحة المجهر.
- صورة شريحة باستخدام مجهر الإزهار في أقرب وقت الحل أكتوبر قد جفت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الحصول على كبيرة بما يكفي الأنف الحاجز ازدراع هو أمر حاسم لخطوات لاحقة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق حفر في الموقع على الجمجمة الماوس المانحة هو مبين في الشكل 1A. وقطع على طول هذا الطريق إنتاج النباتى من حجم كاف كما هو مبين في الشكل 1B. إذا كان عمق الحفر ليست عميقة بما فيه الكفاية، وسوف يكون مبتورا الكسب غير المشروع، وسوف يكون من الصعب الحصول على غشاء كبيرة بما يكفي لتغطية سطح الدماغ. حفر أكثر إبداعا من لا ينصح المسار المقترح لأن أكثر الأنسجة ستبقى على الحاجز الأنفي، وسوف تكون الخطوة التالية أكثر صعوبة. قبل نقل الغشاء المخاطي، سطح الحاجز يحتاج إلى تنظيفها من جميع الأنسجة الضامة الزائدة. حالما يتم ذلك، يجب أن يكون الغشاء المخاطي مرئية على سطح الغضروف. الشكل 1C يظهر ما يبدو الأنسجة مثل بعد التنظيف.
قبل نقل MEMBRANE، وهو حج القحف وdurotomy تحتاج إلى أن يؤديها لفضح سطح الدماغ. إلا بعد النزيف آخر durotomy-أوقفت يمكن نقل الغشاء. يبين الشكل 2A ما ينبغي أن ننظر موقع الجراحة مثل قبل المتابعة إلى الخطوة التالية. نقل الغشاء المخاطي من الغضروف على سطح الدماغ هي الخطوة الأكثر تحديا من الناحية التقنية من العملية الجراحية بأكملها وينبغي أن يتم بعناية. إذا كان الحاجز تحصد كبيرة بما فيه الكفاية، يجب أن تكون المساحة السطحية للالكسب غير المشروع المخاطية كبيرة بما يكفي لتغطية سطح الدماغ. مرة واحدة نقل، ينبغي أن تبدو منطقة العمليات الجراحية مماثلة لتلك التي في الشكل 2B. فمن المهم للتأكد من أن الجانب من الغشاء الذي هو على اتصال مع الغضروف هو نفسه واحد هو أن في اتصال مع سطح الدماغ. إذا كان يحصل انقلبت على الغشاء أو مطوية على نفسها، وينبغي التخلص منها ويجب أن تستخدم واحدة أخرى. مرة واحدة اكتمال هذه الخطوة، يمكن خياطة فروة الرأسبحيث يمكن استرداد الماوس والكسب غير المشروع يمكن أن يشفي. من أجل منع أي ردود فعل سلبية من الكسب غير المشروع القادمة في اتصال مع السطح الداخلي من فروة الرأس، وقطعة من النتريل اقية ينبغي أن توضع أعلاه إلى موقع الجراحية. كما هو مبين في الشكل 2C، يجب أن يكون قطعة إدراج كبيرة بما يكفي لتغطية الغشاء ولكن ليست كبيرة بما يكفي لعرقلة خياطة الجلد مغلقة.
خلال فترة النقاهة، يحدث الأنسجة كبيرة في نمو السمحاق المحيطة التي لابد من إزالتها قبل الجرعات الغشاء. بعد إعادة فتح فروة الرأس، ومسحات القطن المعقم ومحلول ملحي بحاجة إلى أن تستخدم لتنظيف الموقع حتى يبدو مماثلة لتلك التي في الشكل 3A. ونحن لم يلاحظ أي استجابة مناعية كبيرة؛ ولكن هذا لم يتأكد تشريحيا. قد تحتاج الكسب غير المشروع لا بد من تخفيض بشفرة الحلاقة لو نمت عبر سطح الجمجمة. في هذه المرحلة البئر التي سوف تحتوي على المحاليل الجرعاتوينبغي زرعها نشوئها فوق الكسب غير المشروع. عدة مسامير الجمجمة يمكن وضعها في في هذه الخطوة إذا الميكانيكية الاستقرار على المدى الطويل من عملية الزرع هو مصدر قلق. تأكد من وضع البئر بحيث لا تلمس الكسب غير المشروع. مرة واحدة في المكان، لاصقة cyanoacrylate يمكن تطبيقها على الغراء إلى الجمجمة. لمنع اللصق من القدوم على اتصال مع الكسب غير المشروع يجب أن يتم تطبيقها على سطح البئر ودفعت نحو الانخفاض لاغلاق الفجوة. مرة واحدة البئر آمنة، ينبغي أن تملأ مؤقتا مع المياه المالحة لكلا هيدرات الكسب غير المشروع وتحقق من وجود تسرب. وانضمت كذلك ينبغي أن ننظر من هذا القبيل في الشكل 3B و حل وينبغي أن تكون واضحة تشير إلى أن أنه لا يحتوي على أي مادة لاصقة. وسوف يكون واضحا أي تسرب لأن مستوى السوائل في البئر سينخفض. إذا تم العثور على التسريبات التي يحتاجونها لتكون ثابتة مع أكثر اصقة. ثم يتم عززت بشكل جيد مع الاسمنت العظام. عند هذه النقطة يمكن إزالة المياه المالحة في البئر مع ماصة واستبدال الحل الجرعات المطلوبة. عندما تغطي بشكل جيد مع قطعة من الرعاية النتريل ينبغي اتخاذها للتأكد من لاصق لا الاتصال الحل في البئر. في نهاية الإجراء بأكمله، ينبغي للرئيس أن الماوس تبدو وكأنها في الشكل 3C. الاسمنت العظام هو شفافة قليلا وبالتالي إذا كانت محتويات البئر هي الحساسة للضوء، صبغة الحبر أو يمكن أن تضاف إلى سطح الأسمنت المجففة أو إلى خليط الأسمنت لمنع التحلل الضوئي من محتويات جيدا.
بعد فترة من الوقت المطلوب الانتظار، ينبغي تحليل الدماغ لاكتشاف آثار الجرعات. ينبغي أن يعامل الدماغ بشكل مختلف اعتمادا على ما يجري فحصها. إذا كان الغرض من هذا الإجراء هو لتحليل وجود أي مادة كيميائية تضاف إلى البئر، (مثل الموضحة في قسم البروتوكول أعلاه) ثم فمن المستحسن أن تفعل تجميد فلاش من الدماغ للحفاظ على مركبات تدار الشكل 4 > يظهر نتيجة ممثل باستخدام هذا النهج. الجرعات مع الفلورسنت البوليمر 40 كيلو دالتون (ديكستران مترافق tetramethyrhodamine) لمدة 24 ساعة ويظهر انتشار ملحوظ في أنسجة المخ. نتائجنا السابقة مع ديكستران المعرض نشر في أنسجة المخ هو الوقت والوزن الجزيئي تعتمد 18. جزيئات أصغر منتشر في لحمة الدماغ إلى حد أكبر من أكبر منها، وأكبر النتائج في الوقت الجرعات كمية أكبر من نشرها لجميع الأوزان الجزيئية التي اختبرناها. إذا تم تجميد فلاش من المهم لتركيب الشرائح بعد باجتزاء ولا يعرضهم لأي حل. وسوف أي سائل ذوبان مجمع تدار ونشر ذلك عبر المساحة السطحية للشريحة الدماغ. إذا المناعية التي يتعين القيام بها على الدماغ ثم فمن المستحسن أن يروي الماوس لإصلاح أنسجة المخ.
iles/ftp_upload/51452/51452fig1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51452/51452fig1.jpg "/>
الرقم 1. صور من الحاجز الأنفي الداخلي الحصاد. أ) موقع موقع الحفر على الجمجمة من الماوس الموت الرحيم. الخطوط المنقطة تشير إلى محيط لحفر. B) والحاجز الأنفي مباشرة بعد الاستئصال الجراحي. C) والحاجز الأنفي بعد إزالة الأنسجة الزائدة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. الصور الجراحي لعملية engrafting. أ) موقع الجراحية التالية حج القحف وdurotomy. الصورة هو ممثل ما الجمجمة يجب أن تبدو قبل وضع الكسب غير المشروع عليهاباء) التنسيب من الكسب غير المشروع الغشاء المخاطي إلى موقع حج القحف. خط منقط يشير إلى محيط الكسب غير المشروع. يظهر الصورة مساحة السطح المطلوب من الكسب غير المشروع. C) زرع حاجز النتريل واقية. حجم المواد كما هو مبين كبيرة بما يكفي لتغطية الكسب غير المشروع ولكن ليست كبيرة بما فيه الكفاية لتتداخل مع خياطة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. الصور الجراحي لعملية الجرعات المخدرات. أ) مثال على ما يبدو الكسب غير المشروع المخاطية مثل تلتئم بعد تنظيف دقيق للموقع الجراحية. B) صورة مرفقة جيدا في الجمجمة. يتم تأمين واجهة من الجمجمة وكذلكمع شغل لاصقة فورية الغراء وكذلك مع ملحي معقم. مستوى حل مستقر يشير إلى عدم وجود تسرب من البئر وضوح الحل يشير إلى عدم وجود تلوث من الحل بمادة لاصقة. C) صورة الجراحة الانتهاء. البئر يحتوي على الحل الجرعات وتوج آمن مع حاجز النيتريل. الاسمنت العظام في مكانها لrigidify عملية الزرع أيضا. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 4. أخذت شريحة صورة المجهر الفلورسنت من شريحة مخ الفأر التالية transmucosal الجرعات مع 40 كيلو دالتون ديكستران مترافق tetramethylrhodamine لمدة 24 ساعة عند -1.06 مم bregma مع سمك 501، م. الكسب غير المشروع المخاطية مرئيا على سطح الدماغ. بار = 1 مم. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوة الأكثر صعوبة من الإجراء الموصوفة هنا هو النقل الناجح للغشاء المخاطي الحجم بشكل كاف على سطح الدماغ. يرصد هذه الخطوة أسهل بكثير إذا كان الحاجز الأنفي تحصد كبيرة بما فيه الكفاية وتنظيفها جيدا. إذا تم اقتطاع جزء بطني من الحاجز، وينبغي الحصول على الكسب غير المشروع الجديدة. يجب أن تكون زاوية الحفر العمودي في الرأس الماوس لضمان أن الغشاء المخاطي ليست تضررت من الحفر. إذا لم يتم اتخاذ مسار الحفر أوسع من المستحسن ستكون أصعب بكثير لإزالة الأنسجة الزائدة التي يتم توصيلها إلى الحاجز. يجب إزالة أي قطع كبيرة من النسيج الضام مع تخفيضات حادة مقص بدلا من محاولة لسحب اطلاق سراحهم. يمكن إزالة قطعة صغيرة من الأنسجة عن طريق كشط مع نصائح من مقص شريطة عدم توصيل الأنسجة إلى الغشاء المخاطي. في نهاية عملية التنظيف، ينبغي أن يتعرض سطح الغضروف مع غشاء تزال تعلق. سوالsionally قد يصبح الغضروف الحاجز منفصلة من العظم الذي كان متصلا على حافة الظهرية. وإذا حدث ذلك فإنه لا يزال من الممكن استخدامه في الخطوة التالية ولكن هو أكثر تحديا لسببين. العظم هو مقبض مريح لعقد ازدراع عند تنظيف وتحويلها. إزالة مرة واحدة، فمن الصعب على المناورة ورقة الغضروف أكثر حساسية. ثانيا، تقاطع الغضروف والعظام حيث الغشاء المخاطي هو سمكا وأسهل للحصول عند إزالته من الغضروف. إذا تم قطع العظم من الغضروف يتم فقدان هذا الجزء من الغشاء.
مرة واحدة وقد تم تنظيف الكسب غير المشروع الحاجز وتم إجراء حج القحف وdurotomy، يمكن وضع الغشاء المخاطي على سطح الدماغ عرضة للخطر. هذا هو أفضل إنجاز عن طريق وضع يزدرع المجاورة لموقع حج القحف. ومن ثم يمكن سحب غشاء من الغضروف، على الجمجمة، وأكثر من الدماغ. العديد من الأشياء يمكن أن تسوء خلال هذه بروسسق. الغشاء يمكن أن تجف، والحصول على ممزقة، أضعاف على رأس نفسه، أو حفنة المباراة. أيضا الغشاء الذي يغطي الجانب الآخر من الحاجز يمكن أن تحصل على تضررت من فرك ضد الجمجمة. فمن الممكن أيضا أنه في محاولة لإزالة الأغشية المخاطية التي تواجه التصاعدي، واحد يزيل الأغشية من كلا الجانبين في نفس الوقت. من أجل منع كل هذه المشاكل لا بد من تحريك غشاء ببطء ودائما نلاحظ جانبي الحاجز. أفضل استراتيجية هي استخدام نصائح من مقص لإزاحة الغشاء من ورقة الغضروف قبل محاولة الانزلاق تشغيله. إذا كان أي جزء من الغشاء لا تزال تعلق، فمن الممكن أن مرونة الأنسجة سوف تتراجع بعد سحب على ذلك. باستخدام الصغيرة، والاقتراحات التجاذبات الغشاء يمكن فصل من الحاجز. عندها فقط سوف تنزلق بسهولة من ذلك. غشاء رقيق جدا لتكون قادرة على التعامل معها ملاقط؛ فإنه يمكن سحبها فقط من سطح واحد إلى آخر. إذا كان يحصل انقلبت أكثر من ذلك أو مطوية على نفسها، فإنهوينبغي التخلص منها وينبغي الحصول على واحد آخر.
إذا كان الكسب غير المشروع يغطي مساحة كامل سطح الدماغ المكشوفة، وكانت العملية ناجحة، ويمكن خياطة فروة الرأس بحيث موقع الجراحة يمكن أن يشفي. يجب وضع حاجز النتريل في مكان بحيث أن الجلد لا تأتي في اتصال مع غشاء. يجب توخي الحذر حتى لا تمارس هذا الضغط على النتريل عندما خياطة وإلا فإن موقف الكسب غير المشروع قد تحرك. أيضا الحرص على عدم خياطة في النيتريل. أفضل طريقة للتأكد من أن المواد يطيع هو أن يبقيه رطبة مع محلول ملحي وتأكد من أنه يبقى مسطحة في جميع أنحاء خياطة.
بمجرد أن تلتئم الكسب غير المشروع (3-7 أيام) وتحتوي كذلك الحل الجرعات يمكن أن تعلق على الجمجمة فوق الكسب غير المشروع. يمكن ان تكون ثابتة بشكل مؤقت في الجمجمة مع الغراء اللاصقة وبشكل دائم مع الاسمنت العظام. مرة واحدة يتم تطبيق الاسمنت العظام، فإنه لن يكون من الممكن إجراء أية تصويبات لtherefo الموقف جيداإعادة جميع الأمثل يجب أن يتم قبل تطبيقه. مرة واحدة البئر هو في موقف والذي عقد في مكان مع لاصقة cyanoacrylate، ينبغي ملأها ملحي معقم. إذا تم الإجراء بنجاح فإن مستوى السائل لا تتغير وسوف تكون واضحة الحل. إذا كان هناك تسرب، فإن مستوى إسقاط وموقع حيث نجا من الماء يجب أن يكون مرئيا. بعد تطبيق أكثر لاصق على موقع التسرب، يجب إضافة المزيد من المياه المالحة للتحقق من ومختومة تسرب. إذا لاصقة يلوث الحل جيدا، وسوف فيلم شفافة تكون مرئية في أعلى مستوى السوائل. إذا حدث هذا البئر يجب غسلها عدة مرات مع المالحة حتى الحل واضح. بالإضافة إلى ذلك، القطن المبادلة يمكن استخدامها لإزالة الفيلم من لمسها لسطح السائل. فقط عندما يكون جيدا الحل هو مستقر واضحة وينبغي تطبيق الاسمنت. عندما هو الاسمنت الجاف، والمياه المالحة من البئر يمكن إزالتها واستبدالها مع الحل الجرعات. وينبغي الحرص علىلا تلف الغشاء عندما pipetting لداخل وخارج البئر. مرة واحدة شغلها، يجب أن تكون مختومة الجزء العلوي من البئر مع قطعة من النتريل باستخدام فورية الغراء اللاصق. من المهم أن يتم ترك مسافة بين سطح الحل والجزء العلوي من البئر. وهذا يضمن أن لاصق لا تلمس الحل عندما وضع على حاجز النيتريل.
مرة واحدة فقد حان الوقت لتحليل تأثير هذا الإجراء الجرعات، يجب إزالة الدماغ وتصويرها. إذا المناعية التي يتعين القيام بها، ويمكن أن يتم القياسية نضح وتلوين الأجسام المضادة. إذا كان موقع مجمع مداوي هو أن تحدد، فمن المستحسن أن فلاش تجميد الدماغ في حل الجليد / الأيزوبيوتان الجافة. وهذا يضمن أن موقع المجمع في شرائح الدماغ هو نفسه كما كان قبل على الفور إلى القتل الرحيم.
بروتوكول الموصوفة هنا يصف طريقة للتحقيق في تسليم المخدرات إلى الدماغ الماوس من خلال جراحياالمطعمة نصف نافذ المخاطية غشاء 18. هذا هو مماثل لنتائج transnasal جراحة إزالة ورم في البشر التي يتم إصلاح العيوب قاعدة الجمجمة مع أوعية دموية الأنف المخاطية غشاء 19،20. باستخدام هذا نموذج الفأر، أصبح من الممكن الآن لدراسة كيف يمكن لهذه الطعوم المخاطية قادرون على تجاوز BBB والسماح لمباشرة عالية الوزن الجزيئي لتقديم الأدوية إلى الدماغ. وقد أجرينا هذا الإجراء الآن أكثر من 100 مرة. حاسم لهذا الإجراء هو الحصاد الناجح لالحاجز الأنفي الكسب غير المشروع من الماوس المانحة ونقل الغشاء المخاطي من الكسب غير المشروع على اختبار الماوس. هذا الإجراء، لأول مرة، وتمكن من اختبار قبل السريرية عالية الوزن الجزيئي المداواة لمجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية والنفسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
بنيامين س بليير MD هو المخترع الرئيسي للطرق تغطي براءات الاختراع المؤقت لتسليم المخدرات الى الجهاز العصبي المركزي.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل مؤسسة Mcihael J. فوكس للبحوث 2011 الابتكارات الاستجابة السريعة باركنسون برنامج جوائز. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Taconic | C57BL/6 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | ||
| Student fine scissors | Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Pneumatic drill | MTI Dental | 333-CB | |
| Drill bit | |||
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| 0.9% Sodium chloride injection USP | Abbott Laboratories | 4925 | |
| Polystyrene Petri dish | Fisher | 08-757-12 | for temporarily storing graft |
| Bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Oxygen/Isoflurane System | SurgiVet | V720100 | |
| Temperature Control System | Physitemp | TCAT-2LV | |
| Small animal stereotaxic instrument | KOPF | Model 940 | |
| Eye ointment | |||
| Electric shaver | |||
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 23-400-106 | |
| 7.5% Providone iodine | Betadine surgical scrub | ||
| 70% Ethanol | |||
| Surgical blade stainless | Feather | 2976#10 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 3% Hydogen peroxide | for cleaning the skull | ||
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Needles | Becton, Dickinson and Company | 305176 | needle tip cut off and used as well |
| Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309597 | |
| Nitrile gloves | Denville Scientific Inc | G4162 | for well closure and protection of graft |
| 5-0 Nylon suture thread | |||
| Student Halsey needle holder | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Cyanoacrylate adhesive | commecially available super glue | ||
| Dental cement kit, 1 lb, pink opaque | Stoelting | 51458 | |
| Isobutane (2-methylbutane) | Aldrich | M32631 | for dry ice bath |
| Dry ice |
References
- Cardoso, F. L., et al. Looking at the blood-brain barrier: Molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res. Rev. 64, 328-363 (2010).
- Pardridge, W. M. Drug transport across the blood-brain barrier. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32, 1959-1972 (2012).
- Chen, Y., Liu, L. Modern methods for delivery of drugs across the blood-brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 640-665 (2012).
- Cheng, F. -C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced neurotoxicity in C57BL/6 mice. Neurosci. Lett. 252, 87-90 (1998).
- Grondin, R., et al. controlled GDNF infusion promotes structural and functional recovery in advanced parkinsonian monkeys. Brain. 125, 2191-2201 (2002).
- Kirik, D., et al. Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat. Neurosci. 7, 105-110 (2004).
- Pardridge, W. M. Drug and gene targeting to the brain with molecular trojan horses. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 131-139 (2002).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery of protein and non-viral gene therapeutics with molecular Trojan horses. J. Control. Release. 122, 345-348 (2007).
- Bellavance, M. -A., et al. Recent advances in blood-brain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 10, 166-177 (2008).
- Merkus, F. H. M., Berg, M. Can nasal drug delivery bypass the blood-brain barrier. Drugs R. D. 8, 133-144 (2007).
- Dhuria, S. V., et al. Intranasal delivery to the central nervous system: Mechanisms and experimental considerations. J. Pharm. Sci. 99, 1654-1673 (2010).
- Illum, L. Nasal drug delivery-possibilities, problems and solutions. J. Control. Release. 87, 187-198 (2003).
- Craft, S., et al. Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial. Arch. Neurol. 69, 29-38 (2012).
- Freiherr, J., et al. Intranasal insulin as a treatment for Alzheimer's Disease: A review of basic research and clinical evidence. CNS Drugs. 27, 505-514 (2013).
- Gill, S. S., et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nat. Med. 9, 589-595 (2003).
- Love, S., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain. Nat. Med. 11, 703-704 (2005).
- Antunes, M. B., et al. Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures. BioTechniques. 43, 195-204 (2007).
- Bleier, B. S., et al. Permeabilization of the blood-brain barrier via mucosal engrafting: implications for drug delivery to the brain. PLoS ONE. 8, (2013).
- Bernal-Sprekelsen, M., et al. Closure of cerebrospinal fluid leaks prevents ascending bacterial meningitis. Rhinology. 43, 277-281 (2005).
- Bleier, B. S., et al. Laser-assisted cerebrospinal fluid leak repair: An animal model to test feasibility. Otolaryngol. Head Neck Surg. 137, 810-814 (2007).
