Introduction
As bactérias têm evoluído para responder a muitas condições estressantes. Uma característica geral da adaptação ao estresse é uma mudança na dinâmica de crescimento 1,2. A dinâmica de crescimento são caracterizados principalmente por dois parâmetros: a taxa de crescimento exponencial eo tempo de latência, ou seja, o tempo necessário para se adaptar às novas condições. Considerando que um grande número de métodos de alto rendimento concentrar nas medições da taxa de crescimento, o tempo de latência é geralmente um parâmetro negligenciado, embora seja o parâmetro crucial para a caracterização da adaptação às novas condições. Quantificação da adaptação às condições de mudança tem sido tradicionalmente realizada utilizando métodos manuais trabalhosas 3,4. Mais recentemente, as técnicas avançadas têm sido desenvolvidos para a análise de células individuais 5,6. No entanto, ainda é difícil distinguir o crescimento normal após um atraso de crescimento (ou seja, um tempo de atraso) 2,3 de crescimento lento. Um método automatizado foi construído, ScanLag 7, adiscriminar entre estes dois fenótipos semelhantes.
Um exemplo marcante da importância do estudo da distribuição de tempo de atraso é revelado sob tratamento com antibióticos. Antibióticos e outros stresses Muitos matar células apenas em crescimento activo, e, por conseguinte, as células que são "mais atrasadas" são protegidos 8. Para monitorar o tempo de atraso, pode-se observar células individuais sob um microscópio e monitorar o tempo para a primeira divisão. Uma grande desvantagem deste método é que o intervalo de tempo dinâmica é limitada; as células que estão em crescimento precoce cobrir a superfície a uma taxa exponencial, diminuindo eficazmente o crescimento de células com tempo de atraso. O uso de câmaras de fluxo um tanto contorna este 5, mas um número limitado de células podem ser rastreadas e a fracção de bactérias que saem da fase de retardamento depois de a maioria da população começou a crescer não pode ser observado. Apesar destas limitações, vários estudos avaliaram a influência do nível de different salienta sobre a distribuição de tempo de atraso por microscopia única célula 9-12. Outra forma de monitorar a distribuição de tempo de atraso é através de medições de turbidez 13,14. Muitas culturas paralelas, cada iniciados a partir de uma única célula, são cultivadas em um leitor de densidade óptica que mede o número de bactérias em cultura ao longo do tempo. Este método está limitado pela precisão de extrapolação e de o número de poços num prato.
Um método automatizado foi desenvolvido, chamado ScanLag, que permite que os tempos de atraso e distribuições de tempo de crescimento a ser avaliado, mesmo para a pequena percentagem de bactérias em uma população que têm tempos muito longos lag. O método é baseado na detecção de colónias sobre placas de agar nutriente convencional 15 (Figura 1). Para automatizar a detecção de 16,17 uma série de scanners comerciais 18 que são dirigidos por software em casa para adquirir periodicamente imagens das placas, foi projetado. Software foiconcebido para analisar automaticamente as imagens e extrair os parâmetros quantitativos 19,20, tais como o tempo de aparecimento de cada vez e o crescimento de colónias de cada colónia, o que é aqui definido como o tempo necessário para passar de 20 pixels de 80 pixels. Aqui apresenta-se o método em detalhe, incluindo a instalação do sistema e a utilização de software de análise de imagem automatizado, que tem sido melhorada com um interface de utilizador melhor.
Este método pode ser adaptado para medir outras características de colónias, tais como morfologia e cor. A medição destes tipos de parâmetros vai permitir o uso do sistema de phenomics multidimensionais. Como o método detecta colónias a partir de células individuais, o sistema pode revelar novos fenótipos que não podem ser medidas por meio de medições de nível de população. A técnica permite a detecção e recuperação de variantes raras, e facilita a triagem para as características desejadas.
Protocol
1. Construir o Setup
- Escolha um scanner de mesa com resolução óptica: 4800 dpi; Resolução Hardware: 4800 x 9600 dpi; bits de cor: 48 bit, que pode operar em níveis de temperatura e umidade relevantes.
- Placas de Petri tem volume significativo, ao contrário do papel normalmente usado em scanners comerciais. As colónias de deitar por cima da camada de agar, cerca de 5 mm acima da superfície do scanner. Nota: Para a maioria dos scanners das colônias estarão em foco.
- Algumas empresas de scanner não permitir a conexão de mais de uma instância do scanner do mesmo tipo para o mesmo computador. Certifique-se de que mais de um scanner pode ser ligado e identificado de forma única.
- Prepare os acessórios, conforme detalhado a seguir:
- Preparar pedaços de pano de feltro preto estéril para cobrir as placas (Figura 1 passo 2).
- Para segurar as placas de Petri no lugar, preparar os titulares placa branca (Materiais e Métodos) que se encaixam os scanners e que tem 6 holes do tamanho das antenas (Figura 1 passo 3).
- Se necessário para o crescimento do microrganismo, colocar os scanners num ambiente de temperatura controlada. Conecte os scanners para o computador.
- Opcional: Ligue o relé para o computador e ignorar o interruptor on / off do scanner para superar gradiente de temperatura.
Nota: A unidade de relé é para temperatura extremamente sensível microorganismos. Ele desliga o scanner de modo que o sistema eletrônico não aquecer a superfície de forma desigual. Usando apenas uma parte da superfície do scanner pode obter resultados semelhantes.
2. Instalar o Gerenciador de Digitalização
- Copie todos os arquivos do aplicativo de digitalização 'Manager' em um diretório designado de http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html.
- Configurar o arquivo ScanningManager.exe.config acordo com os nomes scanners como aparecem no computador de gerenciamento-> Gerenciador de Dispositivos-> Imaging Devices (
- Para solução de problemas da aplicação 'Scanning Manager', consulte o arquivo leia-me.
- Para mais documentação sobre a aplicação 'Scanning Manager', consulte documentation.html.
3. Fazer um experimento
- Preparar os pratos de Petri (Figura 1):
- Dilui-se a cultura a cerca de 2000 CFU / ml. Placa de 0,1 ml de cultura de forma uniforme sobre a superfície da placa.
- Para obter um bom contraste entre as colônias e do prato e para absorver a umidade, cobrir a placa com um pedaço de pano preto estéril sentia. Coloque a tampa sobre a placa.
- Coloque as placas nos suportes sobre os scanners.
- Inicie o Gerenciador de digitalização (Figura 3): Escolha os scanners que participam da lista de scanners anexados. Escolha o número de imagens a serem tomadas (repetições), o intervalo de tempo entre as imagens subseqüentes (gap Time), eo tempo de espera antes de começar tele experimentar (Comece After).
4. Análise das imagens
NOTA: Um esboço de métodos computacionais é fornecida para analisar as imagens em MATLAB usando "ScanLag", que está disponível gratuitamente para uso não-comercial em http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. html. Outras funções disponíveis estão detalhadas no manual do software, e um código de exemplo é complementado.
- Classificar as imagens de cada scanner em pastas separadas.
- Usando a janela de comando do Matlab, execute os seguintes procedimentos. Os parâmetros necessários para executar esses procedimentos são definidos no manual do software.
- Execute PreparePictures para realizar o pré-processamento: No pré-processamento, as imagens de um scanner estão alinhados. Cada placa de Petri é colhida de cada seqüência de imagens. O momento em que cada imagem foi coletado é recuperado do timestamp.
- TLAllPlates de execução para executar a detecção e rastreamento de e Inach Petri separadamente, as colônias são detectados e atribuído um número de identificação.
- A análise dos dados extraídos: Os tamanhos de todas as colónias detectadas são medidos como uma função do tempo. Para extrair a distribuição aparência das colônias utilizar as seguintes funções na janela de comando do Matlab (mais informações estão disponíveis no manual do software):
- Executar ScanLagApp para exibir a análise de uma determinada placa de Petri juntamente com o gráfico do tamanho das colónias em função do tempo (Figura 4).
- Use o controle deslizante para alterar o horário atual da placa. A temporização será também indicada por uma linha vertical no gráfico correspondente área colónias.
- Clique em uma colônia para ver a sua curva de associado, e vice-versa, clique em uma curva para encontrar sua colônia associado. Depois de identificar a colônia, o fenótipo pode ser recuperada por escolher a colônia da placa de Petri identificados.
- Defeitos de filtro na análise automática por Choocantar uma colônia e clicando no botão excluir. Ao clicar excluir o número da colônia ficará amarela.
- Depois de passar através dos resultados da análise de cada uma das placas, resumem os resultados:
- Execute AddHistograms criar um histograma de vezes de aparência.
- Executar plotDeathCurve para criar uma representação da curva de sobrevivência da distribuição.
- Execute GetAppearanceTimes para obter o tempo de aparecimento de todas as colônias no experimento.
- Executar ScanLagApp para exibir a análise de uma determinada placa de Petri juntamente com o gráfico do tamanho das colónias em função do tempo (Figura 4).
Representative Results
Como um exemplo da distribuição do tempo de desfasamento de extracção, a Figura 5 mostra a capacidade de ScanLag para identificar e rastrear cada colónia com características específicas em uma placa ao longo do tempo, tal como seria feito num ensaio de rastreio.
Quando a cultura do microorganismo é heterogénea, as diferentes subpopulações pode revelar-se durante o ensaio. Por exemplo, a Figura 6 mostra a quantificação aparência e, consequentemente, revela distribuição bimodal de tempo de atraso em uma estirpe mutante de E. coli.
A taxa de crescimento das células influencia o tempo de aparecimento da colónia. Quando as colónias crescem à mesma taxa, o aspecto final pode ser atribuída ao tempo de atraso (Figura 7).
Para validar que o método de fato mede o tempo de atraso de células individuais, comparamos os resultados com os obtidos ScanLag usando microscopia de uma única célula; esta validação é described em detalhes em uma publicação anterior 7. Este método permite a monitorização de muito mais do que as células podem ser avaliadas por microscopia. As distribuições obtidas por microscopia e obtido usando ScanLag em grande parte se sobrepõem. A distribuição ScanLag é um pouco mais amplo; análises teóricas prever alargamento para ser da ordem do desvio padrão do tempo de divisão. Se o tempo de crescimento é diferente para cada estirpe, a origem do atraso da aparência deve ser investigado através de outros métodos.
A influência de colónias de aspecto início no aparecimento de colónias foi posteriormente examinada. As experiências de controlo 7 confirmou que o aparecimento posterior não foi afectada, enquanto o número total de colónias por placa não exceder 200 (Figura 8). Uma outra experiência de contraprova confirmaram que a localização da colónia na placa não afectava o tempo de aparecimento 7.
A análise da plates é calibrado a limites específicos, que podem requerer modificação dependendo nutrientes presentes no meio de crescimento ou o tipo de microorganismo. No entanto, a análise é muito robusto para uma ampla gama de limites, conforme mostrado na Figura 9.
Figura 1. Um diagrama esquemático dos passos necessários para criar uma distribuição aparência colônia.
Figura 2. Uma captura de tela do Gerenciador de Dispositivos mostrando os nomes dos scanners anexados, e do arquivo de configuração. Clique aqui para ver uma maiorversão desta figura.
Figura 3. Uma captura de tela do Gerenciador de digitalização.
Figura 4. Uma captura de tela da ScanLagApp. Uma imagem da placa está no painel esquerdo, e as curvas de crescimento de cada colônia estão no painel da direita, conforme detalhado no manual. Os picos em algumas das curvas de área colônias ocorre quando duas ou mais colônias fundir. Quando a fusão de colónias acontece, a área destas colónias é considerada como a zona de união.
Figura 5. Um resultado representativo da análise de uma placa. (A) Uma imagem de saída da aplicação de detecção, no final da experiência. Cada área de colônia é identificado, colorido e atribuído um número de identificação único. As setas apontam para colónias representativos medidos em B. A colónia é detectada com base na intensidade de limiar (para as colónias de E. coli em agar LB ou agar M9 este limite é de 0,03. Para outros meios de comunicação ou de bactérias, este limite pode ser ajustado em função das ProcessPictures ). Apenas os objectos acima de 10 pixels são contados (este limiar pode ser modificado em função das MatchColonies). A detecção de uma colónia começa em cerca de 10 5 bactérias. (B) A representação gráfica da área em pixels versus o tempo de quatro colônias representativas desta placa. O "tempo de aparência" de cada colônia é quando a colônia é detectado. O "tempo de crescimento 'de cada colónia é aqui definido como o tempo para crescer from 20 pixels e 80 pixels (esses limites são ajustáveis utilizando a função getAppearanceGrowthByVec). O software exclui as colônias que se fundiram antes de atingir o limite superior. Identificação de uma colônia específica de acordo com suas características é fácil graças ao número de identificação e da cor atribuída a cada colônia. Por exemplo colônias º 1, 56, 77 e 124 são destacadas em ambos os gráficos.
Figura 6. Aspecto quantificação pode revelar distribuição do tempo de atraso bimodal. Comparação dos histogramas de análise ScanLag de vezes de aparência para duas tensões diferentes. Linha azul: cepa selvagem crescimento exponencial (Total: 1.320 colônias); linha de alta persistência mutante vermelho enriquecido com bactérias atraso (Total: 1.529 colônias). (A) histogramas aparência normalizado. O picode aparecimento de células em crescimento exponencial é o tempo típico para crescer a uma colónia detectável. Detalhe: mesmo histograma da estirpe mutante depois de subtrair o tempo do pico da cultura exponencial para obter o intervalo de tempo real em caixas-espaçada log mostrando a distribuição do tempo de atraso bimodal. (B) A função de sobrevivência dos mesmos dados em (A) em uma escala logarítmica. Esta representação melhora a aparência da cauda final da estirpe mutante.
Figura 7. Distribuição Aparência e distribuição do tempo de crescimento. (A) e (B) mostram dois histogramas dimensionais do tempo de aparecimento e o tempo de crescimento das duas condições diferentes (O software exclui colónias que se fundiram antes de atingir o limite superior). (C) A comparação dos histogramasdas duas estirpes mostram a diferença de tempo aparência, enquanto que os tempos de crescimento (D) são semelhantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. O aparecimento das primeiras colónias não interfere com o aparecimento de colónias posteriores. (A) ficam a distribuição do tempo de células de tipo selvagem plaqueadas sozinho. (B) ficar para distribuição do tempo de uma cepa sensível frio sozinho, após a transferência para a temperatura permissiva. (C) ficam para distribuição do tempo de ambas as linhagens banhado juntos sob as mesmas condições. A linha preta representa a distribuição de esperar com base nos dados obtidos, quando a medição de cada estirpe em separado. Um bom umCORDO entre distribuições esperados e medidos é obtido desde que o número total de colónias por placa é inferior a 200.
.. Figura 9 O limiar de detecção de não afectar a forma da distribuição aparência colónia A distribuição aparecimento de colónias foi analisado para o mesmo conjunto de dados usando duas dimensões de diferentes patamares; (A) o tamanho limite é de 10 pixels; (B) o tamanho limite é de 50 pixels. Número de células por histograma: aprox. 1500. O limiar de detecção diferente resulta apenas num desvio do tempo de detecção.
Figura 10. Temperatura medições de estabilidade across superfície do scanner. (A) Imagem de uma placa com colônias de Bacillus subtilis cultivadas no scanner sem gerenciamento de energia. A superfície é mais quente na parte inferior e, por conseguinte, as colónias crescem mais rapidamente. A linha gradual ao lado da placa é uma representação esquemática do gradiente térmico. (B) A estabilidade da temperatura foi medida com dois termopares colocados em toda a superfície do scanner. O scanner aquece durante cada varredura e ao longo do tempo. (C) Com gerenciamento de energia, a temperatura é uniforme e as colônias crescer a taxas similares. (D) O mesmo que (B) com o módulo de gerenciamento de energia. Estabilidade de temperatura de ± 0,2 ° C.
Figura 11. Diferenças na distribuição de aparência pode ser devido a direnças nos volumes de meio sólido. A mesma cultura bacteriana foi plaqueada em placas com diferentes volumes de ágar LB, resultando numa altura diferente da superfície do agar. As diferentes alturas levou a opacidade diferente das placas, e, por conseguinte, um tempo de detecção diferentes. A diferença entre as placas foi verificada e que a diferença entre as diferentes condições de altura. (A) As diferenças comuns entre as placas de volumes iguais de 30 ± 0,5 ml de agar LB. (B) A diferença entre as diferentes condições de altura: a distribuição aparência foi medido para as placas com volumes de 20 ± 0,5 ml (vermelhas), de 30 ± 0,5 ml (verde) e de 40 ± 0,5 ml (azuis). Cada estado representa a média de 6 placas diferentes. Enquanto o volume das chapas está dentro de ± gama de 5 ml, a opacidade é semelhante e leva à distribuição do tempo de aparência semelhante.
Discussion
Métodos microscópicos com base na observação direta são muitas vezes consideradas como o "padrão ouro" para estudar o comportamento de uma única célula. ScanLag, que permite a medição da distribuição dos tempos de espera nas populações bacterianas, fornece dados em boa concordância com a distribuição obtida a partir da análise de uma única célula e que atinge estatísticas muito mais elevadas.
Vários passos importantes devem ser realizados para que esse método funcione bem: em primeiro lugar, não comprometer a resolução do scanner, que deve ser de 4.800 x 9.600 para obter boas imagens. Em segundo lugar, ter consciência de que, sem o módulo de gerenciamento de energia (passo 1.6), gradiente de temperatura pode se desenvolver na superfície de mesa e afetar o crescimento. Outro passo importante é a filtração de defeitos, tais como poeira, que podem ter sido erroneamente contados como colónias pelo software. A built-in subtração de fundo do software geralmente supera esses defeitos, mas colônias às vezes "falsos" têm deFiltrou-se manualmente.
Os principais passos para solucionar problemas pode resolver variação inter-placa no setup, devido a várias razões: (a) A taxa de crescimento de microorganismos é afetada pela temperatura. As diferentes condições de temperatura e umidade pode ocorrer devido a ventilação irregular ou localização do prato na incubadora. (B) A electrónica do scanner pode aquecer e provocar um gradiente de temperatura em toda a superfície do scanner. Figura 10 mostra a influência de tais gradiente térmico espacial em bactérias Bacillus, juntamente com as medições da temperatura na superfície do scanner antes e após a implementação do módulo de gerenciamento de energia (passo 1.6). Note-se que este módulo pode não ser necessário para scanners mais recentes, e se apenas uma parte da superfície do scanner é usado, gerenciamento de energia pode ser desnecessário. (C) As placas com diferentes opacidade do nutriente agar pode levar a diferentes níveis de detecção. Figura 11 mostra the tolerância para diferentes volumes de agar nutriente, que resultam em diferentes opacidades.
Experimentalmente a técnica ScanLag é fácil de executar e requer apenas a placa de microrganismos em placas de Petri padrão, e colocá-las na superfície do scanner. O software que foi desenvolvido controla todo o procedimento. A aquisição das imagens é feita automaticamente, ea análise de imagem para rastreamento de colônia também é automático. Além disso, o sistema pode ser ampliado para medir a muitas condições diferentes ao mesmo tempo. Finalmente, o processo baseia-se em scanners de escritórios comerciais e, portanto, é de baixo custo.
Esta técnica pode ser estendida para o estudo de microrganismos que diferem a partir de E. coli K-12, no entanto, várias considerações têm que ser feitas. Em primeiro lugar, a influência das colônias aparecendo no início os posteriores tem de ser avaliado, conforme descrito em detalhes em uma publicação anterior 7. Para E. Coli K-12, adensidade máxima de UFC por placa é de 200. Outras cepas com diferentes tamanhos de colônias, e outras conversas cruzadas possível entre colônias, pode exigir uma densidade diferente. Em segundo lugar, a análise das placas é calibrado para limiares de software baseada específicos que podem precisar de ser modificados, de acordo com o contraste entre o meio sólido e as colónias. O software pode ser estendido também para extrair outras características da colônia, além de atraso e taxa de crescimento. O código de software é aberta e pode ser modificado para se extrair a forma de colónias, brilho, suavidade e cor.
Como as medições são feitas sobre as colónias que se originam a partir de células individuais, os dados revelam novos fenótipos que não podem ser medidas por meio de medições de nível de população. A importância da distribuição do tempo de latência é revelado na presença de antibióticos. Muitos antibióticos são conhecidos para ser eficaz apenas contra células de crescimento; Por conseguinte, desde que as células permanecem na fase de latência e não crescem, são pródetectado a partir de efeitos de tais antibióticos 21. Quando o número de bactérias sobreviventes são avaliadas a intervalos de tempo durante o tratamento com antibióticos 15,22,23, uma subpopulação de bactérias, denominado persistentes, muitas vezes é revelada. Em certos casos, a imunidade ao tratamento com antibióticos se origina a partir de atraso prolongado. Usando esta configuração, este atraso é revelado e muitas vezes tem uma distribuição não-trivial 24 (Figura 6). Este método também permite a recuperação de mutantes raras. Por exemplo, após o plaqueamento de uma população mutagenizada, os mutantes podem ser identificadas com base no fenótipo e isolado directamente, sem selecção. A configuração pode também controlar as interacções célula-célula através da medição do crescimento de colónias como uma função da densidade de colónias nas proximidades e quantificar fenómenos tais como quorum sensing ou a propagação de bactérias que infestam. Informações Multidimensional descoberto por futuros experimentos utilizando este método vai levar a melhor caracterização da população microbianas e aos avanços na pesquisa médica e ambiental.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Difco LB broth | BD | 240230 | |
| Petri dish 90 mm | Miniplast | 20090-01 | |
| Epson Perfection v37 | Epson | B11B207201 | Flatbed Scanner with Optical resolution: 4,800 dpi, Hardware Resolution: 4,800 x 9,600 dpi, color bit depth 48-bit. |
| Epson Perfection v200 | Epson | B11B188011 | |
| Epson Perfection 3490 | Epson | B11B177011 | |
| ADU200 USB Relay | ONTRAK | ||
| Pieces of sterile black felt cloth | Custom made | Approximatly 100 x 100 mm | |
| White plate holders | Custom made | Surface size, with 6 x 99 mm diameter hole | |
| Delerin rings the size of the Petri dish | Custom made | Inner diameter: 72 mm Outer diameter: 86 mm Top outer diameter: 90 mm |
References
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