Introduction
Les bactéries ont évolué pour répondre à de nombreuses conditions stressantes. Une caractéristique générale de l'adaptation au stress est un changement dans la dynamique de croissance de 1,2. dynamique de croissance se caractérisent essentiellement par deux paramètres: le taux de croissance exponentielle et le temps de latence, à savoir le temps nécessaire pour s'adapter aux nouvelles conditions. Attendu qu'un grand nombre de méthodes à haut débit se concentrer sur des mesures de la vitesse de croissance, le temps de latence est souvent un paramètre vis à vis, bien qu'il soit le paramètre essentiel pour la caractérisation de l'adaptation à des conditions nouvelles. Quantification de l'adaptation aux conditions changeantes a toujours été effectuée en utilisant des méthodes manuelles laborieuses 3,4. Plus récemment, des techniques de pointe ont été mis au point pour l'analyse de cellules uniques 5,6. Cependant, il est encore difficile de faire la distinction croissance normale suite à un retard de croissance (à savoir un temps de retard) à partir de 2,3 croissance lente. Procédé automatisé a été construit, ScanLag 7, àla distinction entre ces deux phénotypes similaires.
Un exemple frappant de l'importance de l'étude de la distribution des temps de latence est révélé sous traitement antibiotique. Antibiotiques et d'autres contraintes Beaucoup tuer les cellules en croissance active seulement, et, par conséquent, les cellules qui sont "en" sont protégés 8. Pour surveiller le temps de latence, on peut observer des cellules individuelles sous un microscope et de surveiller le temps de première division. Un inconvénient majeur de cette méthode est que l'intervalle de temps dynamique est limité; les cellules qui se développent au début couvrent la surface à une vitesse exponentielle, ce qui diminue efficacement la croissance des cellules avec un plus long temps de latence. L'utilisation de chambres d'écoulement contourne quelque peu cette 5, mais un nombre limité de cellules peut être suivi et la fraction des bactéries qui sortent de la phase de latence après que la majorité de la population a commencé à croître ne peut être observée. En dépit de ces limitations, plusieurs études ont évalué l'influence du niveau de différentes insiste sur la distribution du temps de retard en utilisant la microscopie de cellules isolées 9-12. Une autre façon de surveiller la distribution des temps de latence se fait par des mesures de turbidité 13,14. Beaucoup de cultures parallèles, chacun a commencé à partir d'une seule cellule, sont cultivées dans un lecteur de densité optique qui mesure le nombre de bactéries dans la culture au fil du temps. Cette méthode est limitée par la précision de l'extrapolation et pour le nombre de puits dans une plaque.
Procédé automatisé a été développé, appelé ScanLag, qui permet des temps de retard et les distributions des temps de croissance doit être évaluée, même pour le petit pourcentage de bactéries dans une population et ayant des temps de latence très long. La méthode est basée sur la détection de colonies sur des plaques de gélose nutritive classiques 15 (figure 1). Pour automatiser la détection 16,17 une gamme de scanners commerciaux 18 qui sont dirigés par des logiciels maison pour acquérir périodiquement des images des plaques, a été conçu. Logiciel a étéconçu pour analyser automatiquement les images et extraire des paramètres quantitatifs 19,20, telles que le temps d'apparition de chaque temps de chaque colonie, qui est défini ici comme le temps de se développer à partir de 20 pixels à 80 pixels et la croissance des colonies. Ici, nous présentons le procédé en détail, y compris la configuration du système et l'utilisation du logiciel automatisé d'analyse d'image qui a été amélioré avec une meilleure interface utilisateur.
Cette méthode peut être adaptée pour mesurer d'autres caractéristiques des colonies, tels que la morphologie et la couleur. La mesure de ces types de paramètres permet l'utilisation du système dans phénomique multidimensionnels. Comme la méthode détecte colonies de cellules individuelles, le système peut révéler de nouveaux phénotypes qui ne peuvent être mesurés par des mesures au niveau de la population. La technique permet la détection et la récupération des variantes rares, et facilite le dépistage des caractéristiques souhaitées.
Protocol
1. Construire le programme d'installation
- Choisissez un scanner à plat, résolution optique: 4800 dpi; Résolution de matériel: 4800 x 9600 dpi; couleur profondeur de bits: 48 bits, qui peut fonctionner à des niveaux de température et d'humidité pertinents.
- Boîtes de Pétri ont un volume important, contrairement au papier habituellement utilisé sur les scanners commerciaux. Les colonies se situent au-dessus de la couche de gélose, d'environ 5 mm au-dessus de la surface du scanner. Remarque: Pour la plupart des scanners les colonies seront mis au point.
- Certaines entreprises du scanner ne permettent pas la connexion de plus d'un exemple de scanner du même type sur le même ordinateur. Assurez-vous que plus d'un scanner peut être attaché et identifié de manière unique.
- Préparer les accessoires tels que détaillés ci-dessous:
- Préparer des morceaux de feutrine noire stérile pour couvrir les plaques (figure 1 étape 2).
- Pour tenir les boîtes de Pétri en place, préparer les détenteurs de plaques blanches (Matériels et méthodes) qui correspondent aux scanners et qui ont 6 holes de la taille des plats (figure 1 de l'étape 3).
- Si nécessaire pour la croissance du micro-organisme, mettre les scanners dans un environnement à température contrôlée. Connectez les scanners à l'ordinateur.
- Facultatif: Connectez le relais à l'ordinateur et de contourner l'interrupteur marche / arrêt du scanner à surmonter gradient de température.
NOTE: L'unité de relais est pour les micro-organismes extrêmement sensibles à la température. Il s'éteint le scanner de sorte que l'électronique ne chauffent pas la surface inégale. En utilisant seulement une partie de la surface du scanner peut obtenir des résultats similaires.
2. Installez le Gestionnaire de numérisation
- Copiez tous les fichiers de l'application "Gestionnaire de numérisation" dans un répertoire désigné de http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html.
- Configurez fichier ScanningManager.exe.config selon les noms des scanners telles qu'elles apparaissent dans Management-> Gestionnaire de périphériques-> Périphériques d'images informatiques (
- Pour le dépannage de l'application "Gestionnaire de numérisation», voir le fichier lisez-moi.
- Pour la documentation sur l'application "Gestionnaire de numérisation», voir Documentation.html.
3. Réaliser une expérience
- Préparer les boîtes de Pétri (figure 1):
- Diluer la culture à environ 2000 CFU / ml. Plate 0,1 ml de culture de manière uniforme sur la surface de la plaque.
- Pour obtenir un bon contraste entre les colonies et le plat et à absorber l'humidité, couvrir la plaque avec un morceau de feutrine noire stérile. Mettre le couvercle sur la plaque.
- Placer les plaques dans les supports sur les scanners.
- Démarrez le Gestionnaire de numérisation (Figure 3): Choisissez les scanners participants de la liste des scanneurs connectés. Choisissez le nombre d'images à prendre (répétitions), l'intervalle de temps entre les images suivantes (l'écart du temps), et le délai d'attente avant de commencer til expérimenter (démarrer après).
4. L'analyse des images
REMARQUE: Un aperçu des méthodes de calcul est prévu pour analyser les images en utilisant MATLAB "ScanLag", qui est disponible gratuitement pour un usage non-commercial à http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications. html. Autres fonctions disponibles sont décrites dans le manuel du logiciel, et un exemple de code est complété.
- Trier les images de chaque scanner dans des dossiers séparés.
- Utilisation de la fenêtre de commande de Matlab, exécutez les procédures suivantes. Les paramètres requis pour exécuter ces procédures sont définies dans le manuel du logiciel.
- Exécutez PreparePictures pour effectuer un prétraitement: En pré-traitement, les images d'un scanner sont alignés. Chaque boîte de Pétri est rognée de chaque séquence d'images. L'heure à laquelle chaque image a été recueilli est récupérée à partir de l'horodatage.
- TLAllPlates Exécuter pour exécuter la détection et le suivi en ehaque plat Petri séparément, les colonies sont détectés et attribuer un numéro d'identification.
- L'analyse des données extraites: Les tailles de chaque colonie détectée est mesurée en fonction du temps. Pour extraire la distribution de l'apparence des colonies utiliser les fonctions suivantes dans la fenêtre de commande de Matlab (des informations complémentaires sont disponibles dans le manuel du logiciel):
- Exécutez ScanLagApp pour afficher l'analyse d'un certain côté boîte de Pétri avec le graphique des colonies dimensionner en fonction du temps (figure 4).
- Utilisez le curseur pour modifier l'heure de la plaque. Le moment est également indiquée par une ligne verticale correspondant sur le graphique de la zone de colonies.
- Cliquez sur une colonie de voir sa courbe associée, et vice versa, cliquez sur une courbe de trouver sa colonie associé. Après identification de la colonie, le phénotype peut être récupéré par la cueillette de la colonie de la boîte de Pétri identifié.
- Filtrer les défauts de l'analyse automatique par choochanter une colonie et en cliquant sur le bouton exclure. En cliquant exclure le numéro de la colonie devient jaune.
- Après être passé par les résultats de l'analyse de chaque plaque, résumer les résultats:
- Exécutez AddHistograms pour créer un histogramme des temps d'apparence.
- Exécuter plotDeathCurve pour créer une représentation de la courbe de survie de la distribution.
- Exécutez GetAppearanceTimes pour obtenir le temps d'apparition de toutes les colonies dans l'expérience.
- Exécutez ScanLagApp pour afficher l'analyse d'un certain côté boîte de Pétri avec le graphique des colonies dimensionner en fonction du temps (figure 4).
Representative Results
A titre d'exemple d'extraction de distribution de temps de latence, la figure 5 montre la capacité de ScanLag pour identifier et suivre chaque colonie avec des caractéristiques spécifiques sur une plaque avec le temps, comme on le ferait dans un essai de criblage.
Lorsque la culture du micro-organisme est hétérogène, les différentes sous-populations peuvent se révéler lors de l'essai. Par exemple, la figure 6 représente la quantification de l'apparence et révèle la distribution des temps de latence bimodale dans une souche mutante de E. ainsi coli.
Le taux de croissance des cellules influence le temps de l'apparence de la colonie. Lorsque les colonies se développent à la même vitesse, l'apparition tardive peut être attribuée à la durée de retard (Figure 7).
Pour valider la méthode en effet de mesurer le temps de retard de cellules individuelles, on a comparé les résultats de la ScanLag avec ceux obtenus en utilisant la microscopie à cellule unique; cette validation est described en détail dans une publication précédente 7. Cette méthode permet de surveiller beaucoup plus de cellules que peut être évaluée par microscopie. Les distributions obtenues en utilisant la microscopie et obtenu à l'aide ScanLag chevauchent largement. La distribution de ScanLag est légèrement plus large; Des analyses théoriques prévoient l'élargissement à être de l'ordre de l'écart type du temps de division. Si le temps de croissance est différente pour chaque souche, l'origine du retard dans l'apparence doit être examinée plus en utilisant d'autres méthodes.
L'influence des premières colonies apparaissant sur-l'apparition de colonies a été examiné plus tard. Des expériences de contrôle ont confirmé que sept apparence n'a pas été affectée par la suite, tant que le nombre total de colonies par plaque ne dépasse pas 200 (figure 8). Une autre expérience de contrôle a confirmé que l'emplacement de la colonie sur la plaque n'affectait pas son temps d'apparition 7.
L'analyse de la pLates est calibré pour des seuils spécifiques qui pourraient avoir besoin de modification en fonction de nutriments présents dans le milieu de croissance ou du type de micro-organisme. Néanmoins, l'analyse est assez robuste pour une grande gamme de seuils conformément à la figure 9.
Figure 1. Un schéma des étapes nécessaires pour créer une distribution de l'apparence de la colonie.
Figure 2. Une capture d'écran du gestionnaire de périphériques indiquant les noms des scanneurs connectés, et du fichier de configuration. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grandeversion de ce chiffre.
Figure 3. Une capture d'écran du gestionnaire de numérisation.
Figure 4. Une capture d'écran de la ScanLagApp. Une image de la plaque est le volet de gauche, et les courbes de chaque colonie de croissance sont sur le volet de droite, comme indiqué dans le manuel. Les pointes dans certaines des courbes de la zone des colonies se produisent lorsque deux ou plusieurs colonies se confondent. Lors de la fusion des colonies se produit, la surface de ces colonies est considérée comme la zone du joint.
Figure 5. Un résultat représentatif de l'analyse d'une plaque (A). Une image de la sortie de l'application de la détection à la fin de l'expérience. Chaque zone de colonie est identifié, et de couleur assignée à un numéro d'identification unique. Les flèches indiquent les colonies représentatives mesurées dans B. La colonie est détecté sur la base seuil d'intensité (Pour colonies de E. coli sur gélose LB ou gélose M9 ce seuil est de 0,03. Pour les autres médias ou des bactéries, ce seuil peut être réglé dans les ProcessPictures de fonction ). Seuls les objets de plus de 10 pixels sont comptés (ce seuil peut être modifié dans les MatchColonies de fonction). Détection d'une colonie commence à environ 10 5 bactéries. (B) Terrains de la zone en pixels par rapport au temps de quatre colonies représentatives de cette plaque. Le «temps d'apparition» de chaque colonie, c'est quand la colonie est détecté. Le «temps de croissance» de chaque colonie est défini ici comme le temps de grandir vientm 20 pixels à 80 pixels (ces limites sont réglables à l'aide de la fonction getAppearanceGrowthByVec). Le logiciel exclut les colonies qui ont fusionné avant d'atteindre la limite supérieure. Identification d'une colonie spécifique en fonction de ses caractéristiques est facile grâce à la numéro d'identification et la couleur attribuée à chaque colonie. Par exemple les colonies n ° 1, 56, 77 et 124 sont mises en évidence dans les deux graphiques.
Figure 6. Aspect quantification peut révéler la distribution des temps de latence bimodale. Comparaison des histogrammes de l'analyse de ScanLag des temps d'apparition pour les deux souches différentes. Ligne bleue: souche de type sauvage en croissance exponentielle (Total: 1320 colonies); rouge mutant de persistance ligne à grande enrichi avec des bactéries en retard (au total: 1 529 colonies). (A) des histogrammes d'apparence normalisés. Le picd'apparition de cellules en croissance exponentielle est le temps typique de croître à une colonie détectable. Encart: même histogramme de la souche mutante après soustraction de la durée du pic de la culture exponentielle pour obtenir le temps de retard réel sur les bacs de journaux interligne montrant la distribution des temps de latence bimodale. (B) Fonction de survie des mêmes données que dans (A) sur une échelle logarithmique. Cette représentation améliore l'aspect de la fin de la queue de la souche mutante.
Répartition Figure 7. Aspect et distribution du temps de croissance. (A) et (B) montrent deux histogrammes dimensionnelles du temps d'apparition et la durée des deux conditions différentes (Le logiciel exclut les colonies qui ont fusionné avant d'atteindre la limite supérieure) de croissance. (C) comparaison des histogrammesdes deux souches montrent la différence de temps d'apparition, tandis que les temps de croissance (D) sont similaires. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8. L'apparition des premières colonies n'interfère pas avec l'apparition de colonies ultérieures. (A) traîne la distribution temporelle des cellules de type sauvage plaquées seul. (B) la distribution des temps de retard d'une souche sensible au froid seul, après transfert à la température permissive. (C) lag distribution de temps de deux souches plaqués ensemble dans les mêmes conditions. La ligne noire représente la distribution attendue sur la base des données obtenues lors de la mesure de chaque souche séparée. Un boncco rd entre les distributions attendues et mesurées est obtenue à condition que le nombre total de colonies par plaque est inférieur à 200.
.. Figure 9, le seuil de détection n'affecte pas la forme de la distribution de l'apparition de colonies La distribution de l'apparence de la colonie a été analysé pour le même ensemble de données à l'aide de deux tailles différentes de seuil; (A) taille de seuil est de 10 pixels; (B) la taille de seuil est de 50 pixels. Nombre de cellules par histogramme: env. 1500. Le seuil de détection différent en résulte que dans un décalage de la durée de détection.
Figure 10. Température mesures de stabilité across surface de scanner. (A) l'image d'une plaque avec des colonies de Bacillus subtilis cultivés sur le scanner sans gestion de l'alimentation. La surface est plus chaud sur la partie inférieure et par conséquent, les colonies se développent plus rapidement. La ligne progressive à côté de la plaque est une représentation schématique du gradient thermique. (B) La stabilité thermique a été mesurée à l'aide de deux thermocouples placés sur la surface de l'analyseur. Le scanner chauffe pendant chaque balayage et dans le temps. (C) avec gestion de l'alimentation, la température est uniforme et les colonies croître à des taux similaires. (D) Identique à (B) avec le module de gestion de l'alimentation. stabilité de température de ± 0,2 ° C.
Figure 11. Différences dans la répartition de l'aspect peuvent être dus à differences dans les volumes de milieu solide. La même culture bactérienne a été étalée sur des plaques avec différents volumes de la gélose LB, qui donne une hauteur différente de la surface de la gélose. Les différentes hauteurs différentes ont conduit à l'opacité des plaques, et donc un temps de détection différent. La différence entre les plaques a été vérifiée et la différence entre les différentes conditions de hauteur. (A) les différences typiques entre les plaques de volumes égaux de 30 ± 0,5 ml de gélose LB. (B) Différence entre les différentes conditions de taille: la distribution de l'apparence a été mesurée pour les plaques avec des volumes de 20 ± 0,5 ml (rouge), de 30 ± 0,5 ml (vert) et de 40 ± 0,5 ml (bleu). Chaque condition est la moyenne des six plaques différentes. Tant que le volume des plaques se situe dans une plage de ± 5 ml, l'opacité est semblable et conduit à une distribution de temps d'apparition similaire.
Discussion
Méthodes microscopiques basées sur l'observation directe sont souvent considérés comme la «norme d'or» pour étudier le comportement de cellule unique. ScanLag, ce qui permet la mesure de la distribution des temps de latence dans les populations bactériennes, fournit des données en bon accord avec la distribution obtenue à partir de l'analyse à cellule unique et permet d'obtenir des statistiques beaucoup plus élevées.
Plusieurs étapes critiques doivent être effectuées pour que cette méthode fonctionne bien: d'abord, ne pas transiger sur la résolution du scanner, qui devrait être de 4800 x 9600 pour obtenir de bonnes images. Deuxièmement, être conscient que sans le module de gestion de l'alimentation (étape 1.6), le gradient de température peut se développer sur la surface à plat et affecter la croissance. Une autre étape importante est la filtration de défauts tels que des poussières qui peuvent avoir été comptées à tort comme des colonies par le logiciel. La soustraction de fond intégré du logiciel surmonte généralement ces défauts, mais les colonies parfois «faux» ont pourfiltrer manuellement.
Les principales étapes de dépannage peuvent répondre à la variation inter-plaque dans la configuration, pour plusieurs raisons: (a) Le taux de micro-organismes de la croissance est affectée par la température. Différentes conditions de température et d'humidité peuvent se produire en raison de la ventilation inégale ou l'emplacement de l'antenne dans l'incubateur. (B) L'électronique du scanner peuvent chauffer et provoquer un gradient de température à travers la surface du scanner. Figure 10 montre l'influence d'un tel gradient thermique spatiale sur les bactéries du genre Bacillus, en même temps que les mesures de la température sur la surface de balayage avant et après mise en oeuvre du module de gestion de l'alimentation (étape 1.6). A noter que ce module peut ne pas être nécessaire pour les scanners les plus récents, et si seule une partie de la surface du scanner est utilisé, la gestion d'énergie peut être inutile. (C) Plaques avec différents opacité de la gélose nutritive pourrait mener à différents niveaux de détection. Figure 11 montre èmee pour la tolérance aux différents volumes de gélose nutritive qui se traduisent par des opacités différentes.
Expérimentalement la technique de ScanLag est facile à réaliser et ne nécessite que la plaque de micro-organismes sur des boîtes de Pétri standard et pour les placer sur la surface de l'analyseur. Le logiciel qui a été développé commande l'ensemble de la procédure. L'acquisition des images se fait automatiquement, et l'analyse d'image pour le suivi des colonies est également automatique. En outre, le système peut être adapté en place pour mesurer de nombreuses conditions différentes en même temps. Enfin, la méthode repose sur les scanners de bureaux commerciaux et, par conséquent, est à faible coût.
Cette technique peut être étendue à l'étude des micro-organismes qui sont différentes de E. coli K-12, mais plusieurs considérations doivent être faits. Tout d'abord, l'influence des premières colonies apparaissant sur les plus tardives doit être évaluée, comme décrit en détail dans une publication précédente 7. Pour E. Coli K-12, l'densité maximale de UFC par plaque est de 200. D'autres souches de différentes tailles de colonies, et d'autres possible diaphonie entre les colonies, pourrait exiger une densité différente. Deuxièmement, l'analyse des plaques est calibré à des seuils de logiciels basés spécifiques qui pourraient avoir besoin d'être modifié, en fonction du contraste entre le support solide et les colonies. Le logiciel peut aussi être étendue pour extraire d'autres caractéristiques de la colonie, au-delà de retard et le taux de croissance. Le code de logiciel est ouvert et peut être modifiée pour en extraire la forme de colonies, la luminosité, la couleur et la douceur.
Parce que les mesures sont faites sur les colonies qui proviennent de cellules individuelles, les données révèlent de nouveaux phénotypes qui ne peuvent pas être mesurés par des mesures au niveau de la population. L'importance de la distribution des temps de latence est révélé en présence d'antibiotiques. Beaucoup d'antibiotiques sont connus pour être efficaces seulement contre les cellules en croissance; Par conséquent, tant que les cellules restent dans la phase de latence et ne se développent pas, elles sont proprotégés contre les effets de ces antibiotiques 21. Lorsque le nombre de bactéries survivant sont évaluées à des intervalles de temps au cours du traitement antibiotique 15,22,23, une sous-population de bactéries, appelé persistants, est souvent révélée. Dans certains cas, l'immunité à un traitement antibiotique prolongé provient du décalage. En utilisant cette configuration, ce retard est révélé et a souvent une distribution non-trivial 24 (figure 6). Ce procédé permet également la récupération de mutants rares. Par exemple, après le placage d'une population ayant subi une mutagenèse, les mutants peuvent être identifiés en se basant sur le phénotype et isolés directement, sans sélection. La configuration peut également surveiller les interactions cellule-cellule en mesurant la croissance des colonies en fonction de la densité des colonies voisines et de quantifier les phénomènes tels que la détection de quorum ou la propagation des bactéries essaimage. Informations multidimensionnelles découvert par les expériences futures en utilisant cette méthode mènera à une meilleure caractérisation de la population microbiennes et aux progrès de la recherche médicale et de l'environnement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Difco LB broth | BD | 240230 | |
| Petri dish 90 mm | Miniplast | 20090-01 | |
| Epson Perfection v37 | Epson | B11B207201 | Flatbed Scanner with Optical resolution: 4,800 dpi, Hardware Resolution: 4,800 x 9,600 dpi, color bit depth 48-bit. |
| Epson Perfection v200 | Epson | B11B188011 | |
| Epson Perfection 3490 | Epson | B11B177011 | |
| ADU200 USB Relay | ONTRAK | ||
| Pieces of sterile black felt cloth | Custom made | Approximatly 100 x 100 mm | |
| White plate holders | Custom made | Surface size, with 6 x 99 mm diameter hole | |
| Delerin rings the size of the Petri dish | Custom made | Inner diameter: 72 mm Outer diameter: 86 mm Top outer diameter: 90 mm |
References
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